Zostavenie transkriptómu De Novo založené na RNA-Seq a objavenie génu Cistanche Deserticola Fleshy Stem-Ⅱ

Funkčná klasifikácia všetkých vyjadrených transkriptov na základe génovej ontológie a KEGG databáz

Anotácia génovej ontológie (GO) bola získaná z anotačného súboru UniProt a asociačného súboru identít. Celkovo bolo k 1 745 funkčným termínom priradených 20 907 transkriptov, čo predstavuje 32,69 % z celkových vyjadrených sekvencií. Z celkových funkčných termínov GO tvorili priradenia k biologickému procesu väčšinu (1 116, 63,95 %), po ktorých nasledovala bunková zložka (329, 18,85 %) a molekulárna funkcia (300, 17,20 %). Priradené funkcie exprimovaných transkriptov pokrývali široký rozsah kategórií GO a 10 najlepších GO termínov s najviac anotovanými prepismi bolo uvedených v tabuľke 3. Poskytujeme distribúciu všetkých exprimovaných transkriptov v troch kategóriách génovej ontológie (molekulárna funkcia, bunková zložka a biologický proces) v doplnkovom súbore (S3 Dataset). Termíny GO súvisiace s väzbovými funkciami a aktivitou transferázy boli zastúpené prevažne v kategórii molekulárnej funkcie. Čo sa týka väzobných funkcií, najpočetnejšia bola väzba katiónov (4 394 transkriptov), ​​nasledovaná väzbou nukleotid/nukleozid (3 404 transkriptov v priemere) a väzbou na proteíny (2 422 transkriptov). Zatiaľ čo v skupine s transferázovou aktivitou je najviac tých s prenosovými skupinami obsahujúcimi fosfor (2 256 transkriptov, 65,77 %). V kategórii bunkových komponentov boli transkripty viac lokalizované intracelulárne (v priemere 10 581 transkriptov), ​​zatiaľ čo v kategórii biologických procesov sa transkripty viac podieľali na metabolickom procese biopolyméru (v priemere 6 683 transkriptov), ​​po ktorých nasledovala regulácia bunkového procesu (4 841 transkriptov ), génová expresia (4 678 transkriptov) a transport (3 512 transkriptov).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE PREVENCIU ALZHEIMEROVEJ CHOROBY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Na ťažbu génov zapojených do biosyntézy lignínu a PhG sa hľadalo 21 358 neredundantných potenciálnych proteínových sekvencií oproti génovým sekvenciám 13 rastlinných organizmov v databáze KEGG a priradili sa k 275 dráham KEGG s najmenej 5 zásahmi. Top 10 dráh s najviac zoradenými sekvenciami je uvedených v tabuľke 4. Väčšina dráh sa podieľala na primárnych metabolických procesoch, ako je metabolizmus aminokyselín alebo bielkovín (ko01230, ko04141 a ko04120), metabolizmus sacharidov (ko01200 a ko00500) a metabolizmu nukleotidov alebo metabolizmus nukleozidov (ko03018, ko00230 a ko00240). Okrem toho existuje 27 sekundárnych dráh súvisiacich s metabolizmom (obr. 2), ako je biosyntéza terpenoidnej kostry, biosyntéza fenylpropanoidov, biosyntéza karotenoidov, biosyntéza izochinolínových alkaloidov a biosyntéza tropánu, piperidínu a pyridínových alkaloidov. Tieto výsledky poskytujú ďalšiu indikáciu, že v tele prebiehali aktívne metabolické procesyC. deserticolakmeňové tkanivo. Všetky exprimované transkripty spojené s dráhami KEGG boli uvedené v doplnkovom súbore (S4 Dataset). Hoci existujú niektoré výrazne zmenené cesty medzi C. deserticola a inými rastlinami, ako je ryža (S5 Dataset), naším hlavným cieľom v tejto štúdii je odhaliť celý transkriptómový profil stonky C. deserticola a zobraziť súvisiace dráhy biosyntézy PhGs. ktoré by mohli byť užitočné pri usmerňovaní pestovania.

Kandidátske gény kódujúce enzýmy zapojené do biosyntézy lignínu

Lignín je druhý najrozšírenejší prírodný suchozemský polymér v rastlinnej ríši, ktorý tvorí až jednu tretinu materiálu nachádzajúceho sa v stenách rastlinných buniek. Ako dôležitá zložka bunkových stien pomáhajú ligníny transportu vody, poskytujú mechanickú podporu a štrukturálnu integritu a chránia pred patogénmi a bylinožravcami. Tieto úlohy lignínu sú veľmi cenné pri podpore podzemného erektívneho rastu C. deserticola v púšti. V tejto štúdii sme prezentovali úplný obraz dráh biosyntézy lignínu v C. deserticola (obr. 3), v ktorých sa lignínové monoméry biosyntetizujú z fenylalanínu prostredníctvom série enzymatických reakcií, vrátane hydroxylácie, metylácie, redukcie a procesu oxidačnej polymerizácie. Enzýmy súvisiace s biosyntézou lignínu boli detegované pre tri prevažne syntetizované formy vo vaskulárnom tkanive (p-hydroxyl-fenyl (H), guaiacyl (G) a syringyl (S) lignín) a 5-hydroxyl-guaiacyl lignín, ktorý bol len identifikovaný v COMT (kyselina kávová 3-O-metyltransferáza, EC 2.1.1.68) deficitných (ako sú knock-down) rastliny.

Fenylalanínamónia-lyáza (PAL, EC 4.3.1.24) je prvým kľúčovým enzýmom v biosyntéze lignínu (obr. 3), ktorý transformuje fenylalanín na kyselinu škoricovú neoxidačnou deamináciou. Celkovo sa sekvenovalo 6 297 odčítaní PAL a zhromaždilo sa 7 transkriptov PAL v C. deserticola (tabuľka 5). Porovnaním podobností sekvencií sme zistili, že 4 z nich (comp28550_c1_seq1/2/3/5) mali viac ako 95 % podobnosť so známou sekvenciou mRNA C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), zatiaľ čo comp28550_c1_seq4 a comp25940_c0_seq1 mali 77 % a 82 % podobnosti. Predikcia ORF odhalila, že 5 transkriptov malo potenciál kódujúcich proteíny a nesúce doménu lyázy aromatických aminokyselín (PF00221.14). Medzi nimi iba transkript comp{33}}c1_seq4 mohol kódovať kompletnú proteínovú sekvenciu 718 aminokyselinových zvyškov. Uvádza sa, že PAL bol kódovaný malou multigénovou rodinou vo väčšine rastlinných druhov, ako sú 4 v Arabidopsis thaliana, 5 v Populus trichocarpa, 3 v Scutellaria baicalensis a 7 Cucumis sativus atď. Naša fylogenetická analýza naznačila, že tam boli 4 Gény kódujúce PAL v C.

deserticola a pomenovali sme ich CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 a CdPAL4 (obr. S2). 4-kumarát-CoA ligáza (4CL, EC 6.2.1.12) a trans-cinnamát 4-monooxygenáza (CYP73A, EC 1.14.13.11) sú dva enzýmy zodpovedné za premenu kyseliny škoricovej na dikumarol-CoA v dvoch reverzných smeroch objednávky. Sú tiež v chrbtici a ich hodnoty FPKM vyjadrenia sú 39,57 a 51,93.

Štyri typy lignínov boli biosyntetizované rôznymi cestami, ktoré boli riadené tromi kľúčovými enzýmami, cinnamoyl-CoA reduktázou (CCR, EC 1.2.1.44), šikimát o-hydroxycinnamoyltransferázou (HCT, EC 2.3.1.133) a ferulátom{{1{ {56}}}} hydroxyláza (F5H, EC 1,14--). CCR bol hlásený ako kontrolný bod dráhy lignínov [50, 51], ktorá katalyzovala X-CoA (X vrátane dikumarolu, kaffeoylu, feruloylu, 5-hydroxyl-feruloylu a sinapoylu) na Y-aldehyd (Y vrátane p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl a snap), zatiaľ čo HCT katalyzoval p-kumaroyl-CoA na kyselinu p-kumaroylshikimovú/kyselinu p-kumaroylchinovú. Tieto dva enzýmy, rovnako ako prepínač, regulovali biosyntézu P-hydroxyl-fenyl lignínov alebo ďalších troch typov lignínov. F5H bol ďalší prepínač vetvy, ktorý reguloval syringyl lignín a 5-hydroxyl-guaiacyl lignín. Ďalšie dôležité enzýmy zahŕňajú 3-O-metyltransferázu kyseliny kávovej (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-metyltransferázu (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) a cinnamylalkoholdehydrogenázu (CAD, EC 1.1.1.199). ) boli tiež zistené vyjadrené. Podrobné informácie o expresii sú uvedené v tabuľke 6. Tieto enzýmové gény identifikované v tejto štúdii poskytnú cenný zdroj pre funkčné genómové štúdie v tejto dôležitej liečivej rastline. 10 génov súvisiacich s dráhou biosyntézy lignínov v tabuľke 6 bolo vybraných na overenie RT-qPCR, aby sa potvrdili naše výsledky RNAseq (obr. 4) a ich vysoké korelácie (Pearsonov korelačný koeficient: 0,90343) indikovali vysokú presnosť a reprodukovateľnosť našej analýzy transkriptómu. S1 Dataset uvádza sekvencie primérov použité v tejto analýze.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidátske gény kódujúce enzýmy zapojené do biosyntézy PhGs

O fenyletanoidových glykozidoch (PhG) je známe, že sú primárnymi aktívnymi zložkami C. deserticola s aktivitami zlepšujúcimi sexuálnu potenciu, zachytávaním voľných radikálov a proti starnutiu. Tri chemické zložky PhGs sú organická kyselina, sacharid a fenyletanol aglykón (obr. 3). Organické kyseliny vrátane kyseliny kávovej, kyseliny ferulovej a kyseliny kumalovej sú produktmi biosyntézy fenylpropanoidov. Zložky sacharidov vrátane glukózy a ramnózy sú produktmi dráh metabolizmu uhľohydrátov, ako je metabolizmus škrobu a sacharózy, metabolizmus aminocukrov a nukleotidových cukrov, metabolizmus fruktózy a manózy atď. Cesta biosyntézy fenyletanolovej časti však zatiaľ nie je jasná. Tu sme na základe našich sekvenčných údajov navrhli dve možné cesty biosyntézy fenyletanolu. Jednou z nich je uvádzaná dráha kyseliny kávovej alebo kyseliny ferulovej, tiež známa ako dráha kyseliny škoricovej, ktorá je podobná hlavnej dráhe biosyntézy lignínu. Ďalšia je založená na metabolickej dráhe fenylalanínu (obr. 3), v ktorej sa fenylalanín na fenyletanol dosiahol známou „Enrlichovou cestou“, ktorá bola prvýkrát nájdená v kvasinkách pred sto rokmi a overená v kvetoch petúnie, paradajkách a ruži. Štyri enzýmové gény kódujúce aspartát/tyrozínaminotransferázu, histidín-fosfátaminotransferázu a primárnu aminooxidázu, ktoré sú zodpovedné za konverziu fenylalanínu na fenyletanol, boli detegované exprimované v stonke C. deserticola. Produkt fenyletanolu môže byť ďalej oxidovaný monooxygenázou alebo metylovaný metyltransferázou na jeho deriváty (fenyletanolaglykón), ktoré sa podieľajú na biosyntéze PhG. Stručne povedané, boli navrhnuté dve predpokladané dráhy biosyntézy fenyletanolového aglykónuC. deserticolaale stále potrebuje ďalšie štúdium.

Diskusie

V posledných rokoch sa rastlinná genomika rýchlo rozvíjala s použitím technológie sekvenovania novej generácie, zatiaľ čo len málo výskumov sa zameralo na genomiku púštnych liečivých rastlín. Je naliehavo potrebné vykonať genomický alebo transkriptomický výskum, aby sme pochopili jeho prispôsobenie sa suchu a slanému prostrediu a dráhe biosyntézy hlavných bioaktívnych zložiek. De novo objav transkriptómu pre niektoré liečivé rastliny,

ako Panax ginseng, Ginkgo biloba a Glycyrrhiza uralensis boli prvýkrát využité pomocou platformy Roche 454 pre jej dlhú dĺžku čítania. Kvôli efektívnej schopnosti zostavovania s krátkymi čítaniami, najmä výhodnými čítaniami na párovom konci, sa transkriptómové sekvenovanie a zostavovanie na báze Illumina vo veľkej miere používalo aj pre modelové a nemodelové organizmy. V tejto štúdii sme vygenerovali približne 8G zo 101 bp párovaných koncových čítaní a vytvorili sme dlhšie unigénne sekvencie s priemernou dĺžkou 725 bp. Rozsiahle kmeňovo špecifické transkriptómové údaje by mohli poskytnúť užitočné referenčné údaje a mohli by sa použiť na ťažbu sekundárneho metabolizmu bioaktívnych zložiek C. deserticola. Pred montážou prešlo 81,62 % z celkového počtu nespracovaných načítaní filtrami prísnej kvality (vrátane orezania adaptéra a vyradenia nekvalitných načítaní), čo naznačuje vysokú kvalitu našich sekvenčných údajov, a 82,08 % vysokokvalitných odčítaní bolo užitočných na zostavenie. Iné hodnoty, ktoré sa nepodarilo použiť na zostavenie, môžu pochádzať z chýb sekvenovania, parametrov zostavy a spol. Tieto nepoužité vysokokvalitné čítania zostali užitočné pri zlepšovaní de novo zostavy v kombinácii s dlhšími čítaniami z inej platformy (ako je Roche 454) v budúcnosti.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Veľký počet zostavených transkriptov (30 098) vykazoval vysokú sekvenčnú podobnosť so známymi génmi vo verejných databázach, čo naznačuje, že naše údaje o párovom konci na báze Illumina pokrývali podstatnú časť prepisov C. deserticola. Transkripty bez BLAST zásahov môžu byť spôsobené 3' alebo 5' nepreloženými oblasťami, nekódujúcou RNA alebo novými génovými sekvenciami C. deserticola. Exprimované transkripty boli anotované do širokej škály kategórií GO a KEGG dráh (tabuľky 3 a 4), v ktorých bolo veľa transkriptov priradených k sekundárnym dráham súvisiacim s metabolizmom. Ako vieme, fenylpropanoid môže fungovať ako indukovateľná antimikrobiálna zlúčenina s veľkým prínosom pre podzemný životný štýl [1] a okrem jeho medicínskeho využitia môže pôsobiť aj ako signálna molekula pri interakciách medzi rastlinami a mikróbmi [68, 69]. Terpenoid sa používa na biosyntézu bioaktívnych zložiek (ako je 6- deoxykatalpol) [70]. Zistili sme, že gény zapojené do biosyntézy hlavného reťazca fenylpropanoidov a terpenoidov boli v C. deserticola veľmi hojné. Ešte dôležitejšie je, že objav dobre znázornených dráh biosyntézy lignínu (obr. 3) poukázal na aktívny metabolický proces lignínu v stonke C. deserticola. Všetky známe enzýmové gény zapojené do biosyntézy lignínu (obr. 3) boli detegované exprimované a štyri kľúčové enzýmy vrátane PAL, CCR, HCT a F5H mali nižšiu mieru expresie (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 a 3,83 v tomto poradí) iné enzýmové gény (tabuľka 6). To, či zmena expresie týchto troch génov môže ovplyvniť produkciu lignínu v C. deserticola alebo nie, si zasluhuje ďalšie štúdium. PAL je kľúčovým enzýmom v biosyntéze lignínu a podieľa sa aj na biosyntéze fenylpropanoidu, resveratrolu, flavonoidu a kumarínu [71–74]. Zistili sme štyri odlišné gény PAL v genóme C. deserticola (obr. S2), ktorý sa zhodoval s tým, že PAL bol kódovaný malou multigénovou rodinou [39, 43, 45–49] a ďalej sme dokázali, že môže hrať dôležitú úlohu v metabolickom toku uhlíka. .

PhG je primárnou aktívnou zložkou C. deserticola. Pre kvalitu C. deserticola sú dôležité gény zapojené do biosyntézy fenyletanolu. Vydedukovali sme dve rôzne biosyntetické dráhy fenyletanolu a 17 enzýmových génov zapojených do biosyntézy PhG v stonke C. deserticola. Na základe štruktúrneho vzorca medziproduktov a katalytických vlastností zodpovedajúcich enzýmov, v ktorých by sa kyselina kávová/ferulová najskôr oxidovala na fenylpyruvátový derivát, boli tiež prvýkrát odvodené možné procesy po kávovej/ferulovej kyseline (obr. 3); potom bola karboxylová skupina zbavená dekarboxylázami; nakoniec sa aldehydová skupina premenila späť na alkoholovú skupinu dehydrogenázou. Toto je prvá aplikácia technológie párového sekvenovania Illumina na preskúmanie celého transkriptómu C. deserticola a na zostavenie čítania RNA-seq bez referenčného genómu. Táto štúdia poskytne užitočné zdroje a génové sekvencie pre funkčný výskum genomiky a proteomiky na C. deserticola v budúcnosti.

Závery

V tejto štúdii sme profilovali transkriptóm kmeňa C. deserticola na základe údajov o vysokovýkonnom sekvenovaní, identifikovali gény zapojené do biosyntéznych dráh lignínu a tiež prvýkrát odvodili potenciálnu biosyntézu PhGs, čo určite urýchli pochopenie nejednoznačných fyziologických procesov a veľkej liečivej hodnoty na molekulárnej úrovni. Doteraz ide o prvý pokus de novo zostaviť celý transkriptóm kmeňa C. deserticola a zistiť biosyntézu liečivých zložiek pomocou sekvenčných súborov údajov na báze Illumina. Naša štúdia môže podporiť vývoj prírodných liečiv a výber kultivarov s liečivými vlastnosťami.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%