Súčasná stabilizácia aktínového cytoskeletu vo viacerých bunkách špecifických pre nefrón chráni obličky pred rôznymi zraneniami

Chronické ochorenia obličiekaakútne poškodenie obličieksú mechanickyzreteľné ochorenia obličiek. Zatiaľ čo chronické ochorenia obličiek sú spojené sporanenie podocytov, akútne poškodenie obličiekovplyvňuje renálne tubulárne epitelové bunky. Napriek týmto rozdielom,kardinálna vlastnosťobidvochakútne a chronické ochorenia obličiekje dysregulovaný aktínový cytoskelet. Ukázali sme tofarmakologická aktivácia dynamínu GTPázyzlepšuje poškodenie podocytovmyšie modely chronických ochorení obličiekpodľapodpora polymerizácie aktínu. Tu stanovujeme úlohu dynamínu pri modulácii tuhosti a polarityrenálne tubulárne epitelové bunkyzosieťovaním aktínových filamentov do rozvetvených sietí. Aktivácia zosieťovacej schopnosti dynamínu agonistom s malou molekulou stabilizuje aktomyozínovú kôru apikálnej membrány proti poraneniu, ktoré následnezachováva funkciu obličiekv rôznych myšacích modeloch akútneho poškodenia obličiek. Najmä agonista dynamínu súčasne zoslabuje podocyty atubulárne poraneniev genetickom myšacom modeli Alportovho syndrómu. Naša štúdia poskytuje dôkazy o uskutočniteľnosti a zdôrazňujevýhody nových holistických terapií chrániacich nefróny.

KLIKNITE SEM, ABY STE POZNALI BYLINNÝ FORMULÁR CISTANCHE DOBRÝ PRI AKÚTNOM PORANENÍ OBLIČIEK

Thehlavné príčiny akútneho poškodenia obličiek(AKI) súischémia, Hypoxia, alebonefrotoxicita 1. Hoci sa to dá zvrátiť, AKI predstavuje významný zdravotný problém s vysokou úmrtnosťou a bez definitívnej liečby. Bez ohľadu na svoju etiológiu AKI primárne poškodzuje polarizované epiteliálne bunky renálnych tubulov, ktorých apikálne mikroklky tvoria tubulárny kefový okraj, ktorý sa podieľa na koordinácii nevyhnutného transportu elektrolytov a vody2. Skorým morfologickým znakom AKI je strata kefového lemu a polarity buniek v dôsledku rozpadu aktomyozínovej kôry na apikálnej membráne1.

Vytvorenie a udržiavanie polarity buniek zahŕňa signalizačné kaskády, prenos membrán a dynamiku cytoskeletu, ktoré sú všetky vysoko koordinované3. Organizácia apikálnej membrány je do značnej miery určená architektúrou aktomyozínových sietí4, ktorá vytvára tuhosť kortexu, čím uľahčuje zoskupovanie proteínov polarity. Zatiaľ čo motory myozínu II sa považujú za primárny generátor kortikálnej tuhosti5,6, architektúra aktomyozínovej kôry je založená na nespočetnom množstve proteínov viažucich aktín (ABP)7.

Okrem známych ABP je kefový okraj obličkových tubulov vysoko obohatený o dynamín8, GTPázu, ktorá je najlepšie známa svojou úlohou pri endocytóze9. Dynamin má vnútornú tendenciu zostavovať sa do viacerých oligomerizačných stavov, ako sú diméry, tetraméry, kruhy a špirály9. Prvýkrát sme identifikovali priame interakcie dynamín-aktín10 a ukázali sme, že oligomerizácia dynamínu reguluje polymerizáciu aktínu v podocytoch11,12, špecializovaných bunkách nevyhnutných pre selektivitu obličkového filtra. Pomocou myších modelov CKD sme ukázali, že aktivácia polymerizácie aktínu závislej od dynamínu zvráti poškodenie podocytov obnovením ich jedinečnej štruktúry a funkcie12.

Tu ukážeme, že vrenálne tubulárne epitelové bunkydynamín zosieťuje filamentózny aktín (F-aktín) do rozvetvených sietí. Schopnosť zosieťovania Dynaminu je definovaná jeho oligomerizačným stavom a dĺžkou F-aktínu. Farmakologická aktivácia oligomerizácie dynamínu pôsobí proti AKI stabilizáciou aktínových sietí a tým aj integrity buniek, čo čiastočne chráni renálne epitelové bunky pred poškodením vyvolaným oxidačným stresom. Naša štúdia identifikuje aktomyozínovú kôru apikálnej membrány renálnych tubulárnych buniek ako liečivý cieľ v AKI prostredníctvom dynamínu ako proxy

Výsledky Dynamin oligomerizácia stanovuje tuhosť a morfológiu apikálnej membrány.

Na preskúmanie úlohy interakcií dynamín-aktín v polarizovaných renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách sme použili Bis-T-23, alosterický aktivátor aktín-dependentnej dynamínovej oligomerizácie v rekonštituovanom systéme13, v bunkách11,13 a v celý organizmus 12. Bunkové fenotypy sa hodnotili v bunkách Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sledovaním stavu F-aktínu a vzoru farbenia tesného spojenia proteínu zonula ocludens-1 (ZO{10}}), čo je považovaný za biomarker bunkovej polarity. Cytochalazín D (CytoD) a latrunkulín A (LatA), známe inhibítory polymerizácie aktínu, znížili hladiny F-aktínu a vyvolali diskontinuálne farbenie ZO -1 (doplnkový obrázok 1a). Na rozdiel od toho Bis-T-23 vyvolal mierne zvýšenie hladín F-aktínu bez akéhokoľvek účinku na farbenie ZO{17}}. Pridanie Bis-T-23 pred, ale nie po LatA, čiastočne zachované hladiny F-aktínu a polarita buniek. Ani vehikulum DMSO, ani inhibítor dynamínu dynole14 nevykazovali žiadny účinok (doplnkový obrázok la).

Skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM) nám umožnila vizualizovať liečivami vyvolané zmeny morfológie buniek so zameraním na apikálnu membránu (obr. 1a). Priemerná výška buniek MDCK bola 11 ± 2 µm a priemerná dĺžka mikroklkov bola 0,63 ± 0,2 µm (tabuľka 1), čo je v rozsahu pozorovanom v obličkách15. LatA znížil výšku buniek a dĺžku mikroklkov a posunul rovnomerne distribuované mikroklky do zhlukov, zatiaľ čo Bis-T-23 vyvolal opačné účinky (tabuľka 1, obr. 1a). Keď sa pridal pred LatA, Bis-T-23 čiastočne zachoval výšku buniek a dĺžku mikroklkov. Keďže mikroklky vykazujú vynikajúcu kontrolu dĺžky definovanú kortikálnym aktínom na ich báze16, tieto údaje poskytujú dôkaz, že Bis-T-23 modifikoval aktomyozínovú kôru na apikálnej membráne.

Aby sme určili presný účinok, ktorý mal Bis-T{1}} na kortikálny aktín, vizualizovali sme aktomyozínovú kôru v lamellipódii pomocou platinovej repliky elektrónovej mikroskopie (PR-EM). LatA znížila hustotu aktínových sietí a tento účinok bol čiastočne zrušený pridaním Bis-T-23 pred LatA (obr. 1b). Keďže LatA urýchľuje depolymerizáciu aktínových filamentov sekvestráciou aktínových monomérov, ďalej sme skúmali, či pozorované zachovanie aktomyozínovej kôry pomocou Bis-T-23 bolo spôsobené jeho pozitívnym účinkom na polymerizáciu aktínu. Na rozdiel od silnej stimulácie polymerizácie aktínu pozorovanej v extraktoch podocytových buniek10, 11, Bis-T-23 len okrajovo zvýšil polymerizáciu aktínu v bunkovom extrakte MDCK (doplnkový obrázok 1b). Podobne imunodeplécia endogénneho dynamínu -2 (Dyn2) z extraktu alebo inhibícia jeho aktivity GTPázy dynódou viedla k okrajovému narušeniu polymerizácie aktínu (doplnkový obrázok 1c). Zatiaľ čo LatA a CytoD významne narušili polymerizáciu aktínu, pridanie Bis-T -23 pred LatA alebo CytoD nebolo schopné prekonať ich inhibičné účinky (doplnkový obrázok 1d, e). Jasplakinolid, liek, ktorý indukuje polymerizáciu aktínu stimuláciou nukleácie aktínového vlákna17, významne nezvýšil celkovú úroveň polymerizácie (doplnkový obrázok 1d), čo naznačuje, že bunkový lyzát MDCK vykazuje takmer maximálnu hladinu polymerizovaného aktínu. Tieto údaje spolu ukázali, že účinky Bis-T-23 na morfológiu apikálnej membrány v bunkách MDCK boli poháňané iným mechanizmom ako polymerizáciou aktínu.

Vzhľadom na všeobecné znalosti o obohatenej lokalizácii Dyn2 a F-aktínu na kefovom okraji renálnych epiteliálnych buniek8 a úlohe dynamínu v endocytóze sme ďalej skúmali, či Bis-T-23 ovplyvňoval aktín nepriamo prostredníctvom zmien v endocytóze. Ako sa očakávalo, Dyn2 aj F-aktín sa ko-lokalizovali v aktomyozínovej kôre pod apikálnou membránou, v mikroklkoch a v jamkách potiahnutých klatrínom (CCP), ktoré sú definované ich odlišným tvarom a veľkosťou (doplnkový obrázok 1f). Skúmali sme dynamiku CCP pomocou úplnej internej reflexnej fluorescenčnej mikroskopie (TIRF)18,19. Bis-T-23, dokonca ani pri svojej najvyššej koncentrácii, nemal žiadny vplyv na distribúciu životnosti CCP, zatiaľ čo dynol znížil počet produktívnych CCP (doplnkový obrázok 1g). Tento nedostatok korelácie medzi úrovňou endocytózy a zmenami v morfológii buniek tvrdí, že Bis-T- 23 sa zameriava na kortikálny aktín bez ovplyvnenia úlohy dynamínu v endocytóze.

Pretože polarita obličkových buniek je udržiavaná architektúrou a trvalou kontrakciou aktomyozínových sietí, ktorá stanovuje tuhosť buniek na apikálnej membráne20, ďalej sme merali tuhosť buniek pomocou mikroskopie atómovej sily (AFM). Systém Nanowizard IV a softvér na analýzu JPK sa použili na určenie zmien v Youngovom Modulus21 pri rôznych experimentálnych nastaveniach (doplnkový obrázok 2a). Liečba LatA viedla k významnému zníženiu kontaktnej tuhosti medzi bunkami a apikálnej tuhosti buniek v bunkách MDCK (obr. 1c–e). Na rozdiel od toho Bis-T-23 významne zvýšil tuhosť buniek v porovnaní s vehikulom DMSO (obr. 1c–e), čo je v súlade s jeho pozitívnymi účinkami na výšku buniek, počet mikroklkov a hustotu aktínových sietí (tabuľka 1 a Obr. 1b)22. Pridanie Bis-T-23 pred LatA výrazne znížilo negatívny účinok LatA na tuhosť buniek (obr. 1c–e), v súlade s pozitívnym účinkom Bis-T-23 na aktínové siete a apikálna bunková morfológia (tabuľka 1, obr. 1b).

Obr. 1 Dynamínová oligomerizácia definuje tuhosť buniek ovplyvnením aktínovej architektúry v renálnych epitelových bunkách. a Reprezentatívne snímky SEM buniek MDCK ošetrených DMSO (0,1 %) alebo Bis-T-23 (30 µM, 0,1 % DMSO) počas 1 0 min pred pridaním DMSO (0,1 %) alebo LatA (0,2 µM, 0,1 % DMSO) počas 2{{23} } min. Zväčšené obrázky vložiek (oranžové oblasti) ukazujú usporiadanie, distribúciu a hustotu mikroklkov na apikálnej membráne. b Reprezentatívne PR-EM snímky MDCK buniek ošetrených tak, ako je vysvetlené v (a). Obrázky ukazujú zmeny v organizácii aktomyozínovej kôry v MDCK bunkách za uvedených podmienok. c Reprezentatívne obrázky Youngových máp modulu MDCK buniek ošetrených tak, ako je vysvetlené v (a). d, e Stĺpcové grafy predstavujúce Youngov modul znázorňujúci tuhosť buniek meranú na spoji bunka-bunka (d) alebo na apikálnej membráne (e). Každý symbol predstavuje priemernú tuhosť jednej bunky. Výsledky uvedené v d, e boli generované z najmenej 1 0 buniek z najmenej troch kultivačných misiek. Chybové úsečky, priemer ± SD (*P menšie alebo rovné 0,05, **P menšie alebo rovné 0,01, ***P menšie alebo rovné 0,001, ****P menšie alebo rovné 0,0001, nepárové dvojstranný t-test). ns, nie je významné.

Stanovili sme tiež tuhosť buniek pomocou systému BioScope II ako alternatívneho experimentálneho prístupu pre AFM. V tomto prípade boli krivky silového odsadenia získané podľa modelu Dischera a spolupracovníkov vypočítaného pomocou softvéru Matlab23. Podobné trendy, pokiaľ ide o tuhosť buniek, boli zaznamenané pre súhru medzi LatA a Bis-T -23 (doplnkový obrázok 2b, 2c). Okrem toho dynoda nevykazovala žiadny vplyv na tuhosť buniek, zatiaľ čo CytoD významne znížila tuhosť buniek (doplnkový obrázok 2d, e), v súlade s ich aktínovými fenotypmi (doplnkový obrázok 1a). Tieto údaje spolu stanovujú koreláciu medzi stavom aktomyozínovej kôry, tuhosťou buniek, morfológiou apikálnej membrány a polaritou buniek. Tieto zistenia tiež presvedčivo demonštrujú úlohu oligomerizácie dynamínu pri definovaní mechanických parametrov polarity epitelových buniek prostredníctvom jej účinku na aktomyozínovú kôru

Dynamin zosieťuje aktínové vlákna do rozvetvených sietí, ktoré sú základom bunkovej polarity. Aby sme objasnili molekulárny mechanizmus, ktorým oligomerizácia dynamínu ovplyvňuje architektúru aktomyozínového kortexu, ďalej sme skúmali účinok dynamínu na aktínové vlákna v rekonštituovanom systéme. Na základe súčasnej hypotézy dĺžka aktínových filamentov definuje ich spôsob zosieťovania6. Pretože priemerná dĺžka kortikálnych aktínových filamentov v sieti na prednej hrane je medzi 100 a 150 nm24, skúmali sme účinky dynamínu na organizáciu kratších filamentov generovaných prekrytím F-aktínu gelsolínom (Gsn-aktín) (obr. 2a). Pridanie Dyn2 viedlo k vytvoreniu veľkých, rozvetvených sietí (obr. 2b, c). Na základe veľkostí a tvarov rekombinantného Dyn2 (obr. 2d) boli siete tvorené prevažne dimérmi Dyn2 (Dyn2DIMER) a tetramérmi (Dyn2TETRA), ktoré interagovali s niekoľkými aktínovými vláknami (obr. 2e): Dyn2DIMER viazaný až na dve vlákna, Dyn2TETRA viazal až štyri vlákna a Dyn2RING až šesť vlákien. Nízke zväčšenie obrázkov odhalilo, že siete závislé od dynamínu tvoria vzor menších a väčších prstencových tvarov (obr. 2c).

Na koreláciu pozorovaní z rekonštituovaného systému s úlohou dynamínu v bunkách sme ďalej určili lokalizáciu endogénneho Dyn2 na kortikálnych aktínových sieťach pomocou monoklonálnej protilátky anti-Dyn2, po ktorej nasledovala sekundárna protilátka konjugovaná so zlatom (doplnkový obrázok 3a–c). Ako je vidieť v rekonštituovanom systéme, dynamín je spojený s odlišným počtom F-aktínu v rozvetvených sieťach (obr. 2f). Tieto údaje spoločne identifikujú novú aktivitu dynamínu, ktorou je zosieťovanie F-aktínu do rozvetvených sietí.

Aby sme porovnali schopnosť zosieťovania dynamínu a ochranný účinok Bis-T-23 na aktomyozínový kortex a morfológiu apikálnej membrány, ďalej sme skúmali účinky Bis-T-23 na dynamínom sprostredkované siete v rekonštituovaných systémoch (obr. 3a). Na základe vrstevnicových grafov, ktoré poskytujú topografické znázornenia rôznych hustôt vlákna, Bis T{7}} zvýšil celkovú hustotu siete (obr. 3a), čo by sa dalo vysvetliť zvýšením počtu F-aktínu viazaného na dynamín v dôsledku zvýšenie jeho oligomerizácie. Okrem toho dynamín silnejšie zosieťoval kratšie vlákna ako dlhý F-aktín (obr. 3a–c), čo naznačuje, že schopnosť dynamínu vytvárať rozvetvené siete je definovaná jeho stavom oligomerizácie a dĺžkou aktínových vlákien. Schopnosť zosieťovať aktínové vlákna do sietí bola zdieľaná dvoma izoformami dynamínu, všade exprimovaným Dyn2 a neurónovo špecifickým dynamínom-1 (Dyn1) (obr. 3b, c).

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Obchod:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop