SLC37A2, Molekula súvisiaca s fosforom sa zvyšuje v bunkách hladkého svalstva v kalcifikovanej aorme

Cievna kalcifikáciaje hlavným zdrojomsrdcovo-cievne ochorenieu pacientov s chronickým ochorením obličiek.Hyperfosfatémiavedie k zvýšenému intracelulárnemu prítoku fosforu, čo vedie k zvýšeniu počtu buniek podobných osteoblastom v bunkách hladkého svalstva ciev. PiT-1 transportuje fosfát v bunkách hladkého svalstva ciev. Mechanizmus vaskulárnej kalcifikácie však nie je úplne objasnený. Táto štúdia skúmala kandidátske molekuly súvisiace s fosforom iné ako PiT-1. Predpokladali sme, že molekuly príbuzné fosforu patriace donosič rozpustenej látky(SLC) superrodina by sa podieľala na vaskulárnej kalcifikácii. Ako výsledok analýzy DNA microarray sme sa zamerali na SLC37A2 a ukázali sme, že expresia mRNA týchto buniek sa zvýšila na kalcifikovaných bunkách hladkého svalstva aorty (AoSMC). Uvádza sa, že SLC37A2 prenáša výmeny glukóza-6-fosfát/fosfát a fosfát/fosfát. In vitro analýza ukázala, že expresia SLC37A2 nebola ovplyvnená zápalom na AoSMC. Expresia mRNA a proteínu SLC37A2 sa zvýšila v kalcifikovanej AoSMC. In vivo analýza ukázala, že expresia mRNA SLC37A2 v aortechronické ochorenie obličiekpotkanov koreloval s osteogénnymi markerovými génmi. Okrem toho sa SLC37A2 exprimoval v oblasti vaskulárnej kalcifikácie vpotkany s chronickým ochorením obličiek. V dôsledku toho sme ukázali, že SLC37A2 je jednou z molekúl, ktoré sa zvyšujúvaskulárna kalcifikáciain vitro a in vivo.

Kľúčové slová: SLC37A2,vaskulárna kalcifikáciabunky hladkého svalstva aorty,chronické ochorenie obličiek, hyperfosfatémia

KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU PRE FUNKCIU OBLIČIEK

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Ako počet pacientov schronické ochorenie obličiek(CKD) sa zvyšuje, počet pacientovvyžadujúce dialýzusa tiež zvýši. Väčšina úmrtí u pacientov podstupujúcichdialýzasú kvôlisrdcovo-cievne ochoreniaako naprsrdcové zlyhanie, cerebrovaskulárne poruchyalebo infarkt myokardu. (,2) Hlavným zdrojomsrdcovo-cievne ochorenieje ektopická kalcifikácia,() abnormalita spôsobená tvorbou a ukladaním kryštálov fosforečnanu vápenatého v mäkkých tkanivách. (4 6) Rôzne faktory, ako je zápal. oxidačný stres a zvýšenie hladín plazmatického vápnika (Ca) a fosforu (P) sa podieľajú na progresii vaskulárnej kalcifikácie. Spomedzi týchto faktorov je hyperfosfatémia najsilnejšie spojená s vaskulárnou kalcifikáciou. (7.8) Hyperfosfatémia je spôsobená nadmerným príjmom P v prítomnosti zníženej funkcie obličiek. Pacienti podstupujúci dialýzu preto musia obmedziť príjem P. (79-12) Bolo však hlásené, ževaskulárna kalcifikáciaprebieha už pri začatí dialýzy; bol tiež pozorovaný u pacientov s CKD v počiatočnom štádiu, keď hyperfosfatémia nie je evidentná. (3) V dôsledku toho je dôležité zabrániť vaskulárnej kalcifikácii u pacientov s CKD v počiatočnom štádiu, aby sa zlepšila životná prognóza.

čo vedie k zvýšenému prítoku P do buniek hladkého svalstva ciev (VSMC). Influx P sa uskutočňuje prostredníctvom PiT-1, transportéra na povrchu bunkovej membrány VSMC. PiT- je členom nadrodiny nosičov rozpustených látok (SLC), ktorá zahŕňa transportér fosforečnanu sodného kódovaný SLC20A1.04 PiT- transportuje fosfát cez bunkové membrány závislé od Na a následne mineralizáciu matrice v dôsledku zvýšených hladín p.s) Ako intracelulárne Hladiny P sa zvyšujú, VSMC začína exprimovať osteogénne transkripčné faktory, ako je transkripčný faktor súvisiaci s runt 2 (Runx2)(16) Tento účinok je nasledovaný zvýšenou expresiou génov špecifických pre osteoblasty, ako je osteopontín a osteokalcín. Okrem toho sa znížila expresia proteínov špecifických pre hladké svaly. ako je proteín hladkého svalstva 22-0 (SM22-0). Výsledkom je, že VSMC sa transformuje na bunky podobné osteoblastom. (1718) Nedávne klinické štúdie ukázali, že hladina vápnika v krvi. proteínové častice (CPP), ktoré predstavujú koloidné častice fosforečnanu vápenatého, pribúdajú s klesajúcou funkciou obličiek. (19-21)Okrem toho boli hlásené korelácie s hladinami CPP a P v krvi.2o2i) Je možné, že CpP môže spustiť progresiu vaskulárnej kalcifikácie.22-24)

U pacientov s CKD v počiatočnom štádiu s normálnymi hladinami P v plazme sa však pozorovala vaskulárna kalcifikácia. (13) Okrem toho. PiT-1 mRNA je exprimovaná všade vo všetkých tkanivách. Iná molekula teda môže pôsobiť primárne v oblasti vaskulárnej kalcifikácie. Existujú správy, žezápalpodporuje kalcifikáciu ciev. Diferenciáciu VSMC na bunky podobné osteoblastom (2s26) indukujú zápalové faktory, ako je interleukín (IL)-1B, IL-6 a tumor nekrotizujúci faktor alfa (TNF-a), TNF-a indukuje vaskulárnu kalcifikáciu prostredníctvom cAMP dráhy, ktorá hrá úlohu pri diferenciácii osteoblastov.2728) IL-6 reguluje rôzne dráhy vedúce k vaskulárnej kalcifikácii VSMC2-31) Ďalej. IllB, IL-6 a TNF-a sú tiež faktory spojené so zvýšenou vaskulárnou kalcifikáciou vyvolanou vysokými hladinami p.3233) Avšak. súčasné údaje úplne nevysvetľujú mechanizmus vaskulárneho

kalcifikácia vyvolaná týmito faktormi. Predpokladali sme, že môžu existovať ďalšie molekuly súvisiace s P, ako sú molekuly v superrodine SLC, ktoré sa podieľajú na vaskulárnej kalcifikácii. Zamerali sme sa na membránové proteíny v superrodine SLC a skúmali sme potenciálne kandidátske molekuly súvisiace s P iné ako PiT-1 na zapojenie do vaskulárnej kalcifikácie. Ďalej sme skúmali vzťah medzi kandidátskymi molekulami a vaskulárnou kalcifikáciou vo videu a in vivo.

Materiály a metódy

Bunková kultúra. Normálne ľudské bunky hladkého svalstva (AoSMC) boli získané od Lonza (Bazilej, Švajčiarsko) AoSMC sa kultivovali podľa pokynov výrobcu. AoSMC sa udržiavali v rastovom médiu (bazálne médium buniek hladkého svalstva doplnené 5 % fetálnym bovinným sérom (FBS), epidermálnym rastovým faktorom, inzulínom, fibroblastovým rastovým faktorom-B a gentamicínom/amfotericínom-B). Médiá sa menili každý druhý deň. AoSMC sa pestovali vo zvlhčenom 5% CO inkubátore pri 37 stupňoch a udržiavali sa až do dosiahnutia konfluencie a potom sa použili v experimentoch.

Kalcifikované AoSMC. Kalcifikácia AoSMC bola indukovaná tak, ako je opísané vyššie.435) AOSMC boli kultivované v Dulbeccom modifikovanom Eaglovom médiu doplnenom 15 % FBS a penicilín-streptomycínom a kultivované s 2,6 mM P počas 3, 6, 9, 12 a 14 dní. Koncentrácia P bola upravená pomocou P pufraNaH, PO/Na a HPO. pH 7,2). Iné AoSMC neboli kultivované s 2, 6 mM P.

DNA microarray. Použila sa celková RNA vzoriek AoSMC kultivovaných a nekultivovaných s 2,6 mM P. Celková RNA 5.0 ug sa analyzovala pomocou DNA microarray (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray sa použilo na preskúmanie približne 26,000 génov. Pomer sa vypočítal vydelením úrovne expresie AoSMC kultivovanej s 2,6 mM počas 12 dní úrovňou expresie AoSMC nekultivovanej s 2,6 mM P

DNA mikropole

Použila sa celková RNA vzoriek AoSMC kultivovaných a nekultivovaných s 2,6 mM P. Celková RNA 5.0 ug sa analyzovala pomocou DNA microarray (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray sa použilo na preskúmanie približne 26,000 génov. Pomer sa vypočítal vydelením úrovne expresie na AoSMC kultivovanej s 2,6 mM počas 12 dní úrovňou expresie na AoSMC nekultivovanej s 2,6 mM P. Expresia SLC37A2 pri vaskulárnom zápale. Na vyvolanie zápalovej reakcie v AoSMC sa bunky kultivovali s rastovým médiom, kým nedosiahli konfluenciu, a potom sa ošetrili s 1 ugmL lipopolysacharidov (LPS) (LPS z escherichia coli 0111:B4; Sigma, St. Louis, MO) počas 24 a 72 bez 2,6 mM P. Iné AoSMC sa nekultivovali pomocou analýzy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase. Celková RNA bola extrahovaná z AoSMC ošetrených LPS počas 24 a 72 hodín a buniek neošetrených LPS. Kvantitatívna PCR v reálnom čase založená na SYBR zelenej sa uskutočnila s použitím syntetizovanej cDNA a vhodnej sady primérov pre každý cieľový gén pomocou systému PCR v reálnom čase StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Sekvencie primérov boli nasledovné: ľudský IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' a 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; ľudský SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' a 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- a 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 a SLC37A2 hladiny expresie mRNA boli vypočítané po normalizácii pomocou GAPDH37A2. Expresia v SLC AoSMC. Total boli extrahované z AoSMC nekultivovaných s 2,6 mM P a AoSMC bunky kultivované s 2,6 mM P počas 3, 6, 9, 12 a 14 dní. Real-time PCR sa uskutočnila s použitím syntetizovanej cDNA. Sekvencie primérov boli ako nasleduje: ľudský Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' a 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Hladiny expresie mRNA Runx2 a SLC37A2 sa vypočítali po normalizácii pomocou APPH.

Analýza Western blotting.

Celkový proteín sa zhromaždil zo vzoriek AoSMC kultivovaných za rovnakých podmienok, aké sa použili na analýzu PCR v reálnom čase. Tieto vzorky boli lyzované s použitím Tris-pufrovaného fyziologického roztoku (pH 75) doplneného 5 % NP-40 a 1 % kokteilu inhibítora proteázy. Vzorky koncentrácie proteínu sa merali pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific. Waltham, MA). a koncentrácia sa upravila westernovým prenosom, 10 ug proteínu sa separovalo v 10% polyakrylamidovom géli s použitím elektroforézy na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli. Membrána bola ošetrená protilátkou SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) alebo protilátkou GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) ako primárnymi protilátkami, inkubovaná s protilátkou konjugovanou s králičím lgG chrenovou peroxidázou (R&D Systems, Minneapolis, MN) ako sekundárnou protilátkou a vizualizované pomocou Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anglicko) a luminiscenčného obrazového analyzátora (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokio, Japonsko). Pás sa kvantifikoval použitím lmagelu.

Experimentálne

Všetky protokoly štúdie boli schválené etickou komisiou Univerzity Hyogo, School of Human Science and Environment. Dvanásťtýždňový samci potkanov Sprague-Dawley boli zakúpení od Japan SLC (Shizuoka, Japonsko). Potkany boli chované v 12-cykle svetla, 12-h tmy (09:00-21:00) a bol im umožnený voľný prístup k potrave a mimoriadne čistej vode.

Experimentálne diéty zahŕňajú kontrolnú diétu P (1.0% P, 0.6Ca, 20% bielkovín), adenínovú diétu (0,75% adenínu , 1.0% P, 0,6 % Ca, 2,5 % bielkovín), diéta s nízkym obsahom P (LP) (0,2 % P,0 0,6 % Ca, 10 % bielkovín) a diéta s vysokým obsahom P (HP) (1,0 % P, 0,6 % Ca, 10 % bielkovín) založená na diéte AIN93-G (orientálna Kvasinky, Tokio, Japonsko) s kazeínom ako zdrojom bielkovín.3637) Bolo hlásené, že diéta s nízkym obsahom bielkovín podporuje vaskulárnu kalcifikáciu u potkanov s adenínom vyvolaným zlyhaním obličiek, preto sa vykonala reštrikcia proteínov.3738)Pred zoskupením všetky potkany (n=23) boli týždeň kŕmené štandardnou MF stravou (orientálne kvasinky), aby sa aklimatizovali. Vo veku 13 týždňov boli potkany rozdelené do 2 skupín: kontrolná skupina (n=5) a skupina s adenínom indukovaným CKD (n=18). Kontrolná skupina dostávala kontrolnú P diétu počas 6 týždňov . Skupina s adenínom indukovaným CKD dostávala adenínovú diétu približne 3 týždne a potom bola ďalej rozdelená do 2 podskupín: skupina CKD-LP (n=8) alebo skupina CKDHP (n=10). Potkany zo skupiny CKD-LP a skupiny CKD-HP dostávali LP diétu a HP diétu počas 3 týždňov, respektíve počas experimentálneho obdobia, príjem potravy sa zaznamenával denne. Počas adenínovej diéty sa vzorky krvi odoberali z chvostovej žily medzi 10:{46}} ráno a 11:{48} ráno raz týždenne do druhého týždňa a potom raz za 2 dni na sledovanie plazmatických hladín. Počas LP diéty alebo HP diéty sa vzorky krvi odoberali raz týždenne. Vzorky moču sa odoberali a objem moču sa zaznamenával raz týždenne. Potkany boli usmrtené anestetikom s použitím izofluranu (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) a laparotómií. Na analýzu sa odobrali vzorky krvi odobraté z dolnej dutej žily a torakoabdominálnej aorty.

Expresia SLC37A2 na aorte.

Približne jedna tretina zozbieranej torakoabdominálnej aorty sa použila na vizualizáciu kalcifikácie a imunofarbenie. Aorta sa zaliala do parafínu a narezali sa 4-um rezy. Rezy boli zafarbené pomocou súpravy Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences. Warrington, PA) podľa pokynov výrobcu. analýza imunofarbenia sa uskutočnila so sériovými rezmi. Rezy sa inkubovali s protilátkou SLC37A2 cez noc pri 4 stupňoch a potom sa ošetrili s Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokio, Japonsko) počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom boli rezy ošetrené súpravou DABsubstrate (Nichirei).

Celková RNA bola extrahovaná zo zvyšku zmrazenej torakoabdominálnej aorty. PCR v reálnom čase sa uskutočnila s použitím syntetizovanej cDNA. Sekvencie primérov boli nasledovné: potkaní osteo-pontín, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' a 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' a; potkaní SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' a 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Úrovne expresie mRNA osteopontínu a mRNA SLC37A2 sa vypočítali po normalizácii pomocou GAPDH

Štatistická analýza.

Údaje sú prezentované ako priemer + SE. Rozdiely medzi skupinami boli analyzované pomocou t-testu. V experimentoch s kalcifikovanou AoSMC indukovanou fosfátmi sa rozdiely analyzovali pomocou jednosmernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledovala Dunnettova metóda. V modelových experimentoch CKD boli rozdiely analyzované pomocou K ruskal-Wallisovho testu, po ktorom nasledovala Steel-Dwassova metóda. Korelačné koeficienty (rs) boli stanovené pomocou Spearmanovho poradového testu korelačných koeficientov. Na všetky testy. obojstranné hodnoty p<0.05 were considered statistically significant.