[ 18F]-fluorid sodný autorádiografické zobrazenie nefrokalcinózy v darcovských obličkách a explantovaných obličkových aloimplantátoch

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrokalcinózaje prítomný až v 43 percentáchobličkybiopsie štepu jeden rok po transplantácii a je spojená s horšou funkciou štepu a zlým prežívaním štepu. Študovali sme [18F]-fluorid sodný ([18F]-NaF) zobrazovanie mikrokalcifikácií v obličkách darcu (n= 7) a explantovaliobličkyaloštepy (n= 13). Na histologické vyhodnotenie kalcifikácie (Alizarin Red; farbenie von Kossa) a ex vivo [18F]-NaF autorádiografiu sa použili tri um sériové rezy zaliate do parafínu. Obrázky sa spojili, aby sa vyhodnotilo, či oblasti mikrokalcifikácie zodpovedajú oblastiam absorpcie [18F]-NaF. Na základe histologických analýz boli tubulointersticiálne a glomerulárne mikrokalcifikácie prítomné v 19/20 a 7/20 vzorkách. Pomocou autorádiografie sa vychytávanie [18F]-NaF zistilo v 19/20 vzorkách, pričom signifikantne väčšia aktivita indikátoraobličkyaloštepu v porovnaní so vzorkami obličiek od mŕtveho darcu (p {{0}}.019). Farbenie aktívnych mikrokalcifikácií alizarínovou červenou preukázalo dobrú koreláciu (Spearmanovo rho 0,81, p < 0,001)="" a="" von="" kossa="" farbenie="" konsolidovaných="" kalcifikácií="" preukázalo="" významnú,="" ale="" slabú="" koreláciu="" (0,62,="" p="0,003)" s="" aktivitou="" [18f]-naf.="" táto="" korelácia="" medzi="" ex-vivo="" absorpciou="" [18f]-naf="" a="" histologicky="" overenými="" mikrokalcifikáciami="" je="" prvým="" krokom="" k="" zobrazovacej="" metóde="" na="" identifikáciu="" mikrokalcifikácií="" v="">nefrokalcinóza. To môže viesť k lepšiemu pochopeniu etiológie mikrokalcifikácií a ich vplyvu na funkciu transplantácie obličky.

Kliknutím získate výhody extraktu z cistanche pri ochorení obličiek

Nefrokalcinóza, definovaná ako parenchymálna a tubulárna depozícia šťavelanu vápenatého (CaOx) alebo fosforečnanu vápenatého (CaPhos), je dôležitým faktorom poklesu funkcie štepu poobličkytransplantácia 1–3. Ukladanie CaOx a CaPhos sa pripisuje vysokým hladinám sérového oxalátu, sérového vápnika a sérového fosfátu u pacientov s chronickouobličkyochorenie a/alebo hyperparatyreóza4,5. Výskytnefrokalcinóza, na základe biopsií obličkového aloštepu, je 6 percent po 6 mesiacoch, 25 – 43 percent po jednom roku a až 79 percent po 10- rokoch poobličkytransplantácia5–7. Štúdie zamerané na biopsie obličkového aloštepu do jedného roka po transplantácii preukázali súvislosť medzi včasnou prítomnosťou usadenín vápnika a nižšou funkciou štepov a slabým prežívaním štepov4,8,9. Či však tieto mikrokalcifikácie hrajú aktívnu úlohu pri dysfunkcii aloštepu alebo sú len indikátormi deregulovaného metabolizmu minerálov, zostáva nejasné.

Randiť,obličkybiopsie aloštepu sú jedinou diagnostickou metódou na vyhodnotenie potransplantačných mikrokalcifikácií. Neinvazívny a spoľahlivý diagnostický prístup by umožnil opakované merania, čím by sa uľahčilo sledovanie kalcifikácií v priebehu času a intervenčné štúdie s potenciálnym zlepšením výsledkov funkcie štepu a prežívania štepu po transplantácii obličky10.

Zobrazovanie pozitrónovou emisnou tomografiou/počítačovou tomografiou (PET/CT) s [18F]-fluoridom sodným ([18F]-NaF) sa používa v klinickej praxi a experimentálnych štúdiách ako modalita skeletálneho a vaskulárneho zobrazovania11–15. Zatiaľ čo spoľahlivú vizualizáciu vaskulárnych mikrokalcifikácií bráni CT zobrazenie, výsledky ex-vivo [18F]-NaF microPET zobrazovania dobre korelovali s histologicky overenými mikrokalcifikáciami vo vzorkách ľudských a zvieracích ciev16,17. Okrem toho výsledky niekoľkých prospektívnych klinických štúdií ukázali, že včasná vaskulárna aktivita [18F]-NaF dobre súvisí s mikrokalcifikáciami zistenými pomocou CT zobrazovania a čo je zaujímavejšie, so zvýšením veľkosti týchto kalcifikácií18–20.

Tu uvádzame výsledky dôkazu konceptu autorádiografickej štúdie pre ex-vivo použitie [18F]-NaF zobrazovanianefrokalcinózau darcovobličkya transplantované obličkové aloštepy ako diagnostický prístup na vizualizáciu mikrokalcifikácií.

Stôl 1.Obličkycharakteristiky príjemcu transplantátu. Žiadne prípady hyperkalcémie v tejto kohorte; *klasifikácia Banfovej klasifikácie patológie aloštepu—201828; FSGS=fokálna segmentálna glomeruloskleróza; IFTA=intersticiálna fbróza a tubulárna atrofia; zodpovedajúce výsledky autorádiografie a histológie sú uvedené v doplnku S1.

Tabuľka 2. Zosnulýobličkycharakteristiky darcu. *Kardiovaskulárne ochorenie definované ako cerebrovaskulárna príhoda, infarkt myokardu, cievne ochorenie vyžadujúce invazívny zásah; **ako poznamenal tím obstarávania; Zodpovedajúce výsledky autorádiografie a histológie sú uvedené v doplnku S2; žiadni darcovia s diabetes mellitus.

Výsledky

Vzorová kohorta.

Trinásťobličkyvzorky boli získané po transplantektómii, v priemere 33 [IQR 9–66] mesiacov po transplantácii, od príjemcov transplantátu s mediánom veku 51 [IQR 30–64] rokov. Transplantektómia bola vykonaná pre odmietnutie aloštepu (Banf IIA a IIB) u siedmich pacientov, chronickú arteriopatiu aloštepu u dvoch pacientov, infekciu aloštepu u dvoch pacientov, primárnu nefunkčnosť jedného pacienta a intersticiálnu fbrózu a tubulárnu atrofiu stupňa III u jedného pacienta. Osem z 13 (61,5 percenta) pacientov malo hyperparatyreózu, sedem (53,8 percenta) malo hyperfosfatémiu, päť (38,5 percenta) malo diabetes mellitus a žiadny z týchto pacientov nemal príznakynefrokalcinózana klinickom ultrazvuku alebo v anamnéze obličkových kameňov (tabuľka 1). Bolo získaných sedem vzoriek obličiek od mŕtvych darcov od darcov s mediánom veku 65 [IQR 64–71] rokov. Štyria zo siedmich (57,1 percenta) darcov mali v anamnéze kardiovaskulárne ochorenie, žiadny nemal diabetes mellitus a šesť zo siedmich (85,7 percenta) malo pri vizuálnej kontrole aterosklerózu vaskulatúry obličiek, čo sú potenciálne faktory úbytku týchto darcov.obličky(Tabuľka 2).

Obrázok 1. Autorádiografická snímka absorpcie [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) (A) s prekryvnou snímkou ​​absorpcie [18F]-NaF s farbením mikrokalcifikácií alizarínovou červenou (B) a farbením kalcifikácií von Kossa (C).

Autorádiografia a histológia.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 percent v 5 (25 percent) z 20 vzoriek (obr. 1 a obr. 2A) (doplnkové S1 a doplnkové S2, zobrazujúce autorádiografiu a prekrývajúce snímky pre všetky vzorky). Počet oblastí [18F]-NaF bol výrazne vyšší vobličkyvzorky aloštepu v porovnaní so zosnulým darcomobličkyvzorky s mediánom 7.{1}} [IQR 4.0–15,5] a 2.{7}} [IQR 1.0–6.0 ], respektíve (p=0.019) (doplnkový S3).

Tubulointersticiálne mikrokalcifikácie, vizualizované farbením alizarínovou červenou, boli prítomné v 19 z 20 vzoriek, s mediánom 5,5 [IQR 2–10.3] na vzorku, a glomerulárne mikrokalcifikácie boli pozorované v siedmich z 20 vzoriek s mediánom 1 [IQR 1–3] na vzorku (obr. 2B). Výrazne vyšší počet mikrokalcifikácií sa pozoroval vo vzorkách obličkových aloštepov v porovnaní so vzorkami obličiek od mŕtveho darcu, s mediánom 9.0 [IQR 5.0–20,5] a 4,0 [IQR 1,0–4,0] (p=0,046) (doplnkový S3). Pri farbení Von Kossa boli tubulointersticiálne kalcifikácie pozorované v 18 z 20 vzoriek s mediánom 2,5 [IQR 1–5] na vzorku a glomerulárne kalcifikácie boli pozorované v siedmich z 20 vzoriek, s mediánom 1 [IQR 0–3 ] na vzorku (obr. 2C). Počet kalcifikácií sa medzi nimi výrazne nelíšilobličkyvzorky aloštepu a vzorky obličiek od mŕtvych darcov s mediánom 4.0 [IQR 2.0–6.0] a 2.0 [IQR 2.{101} {9}}–7.0], respektíve (p=0.311) (doplnkový S3). Reprodukovateľnosť medzi pozorovateľmi bola identifikovaná medzi vizuálnou a poloautomatickou detekciou kalcifikácií s ICC 0,94 (95 percent CI 0,85–0,98) pre farbenie alizarínovou červenou a 0,77 (95 percent CI 0,42–0,91) pre farbenie Von Kossa.

Prekryvné snímky výsledkov autorádiografie a histológie ukázali spoločnú lokalizáciu vychytávania [18F]-NaF s farbením alizarínovou červenou na mikrokalcifikáciu (obr. 1B). Na porovnanie, prekryvné snímky vychytávania [18F]-NaF a farbenie kalcifikácií Von Kossa ukázali vychytávanie v oblastiach bez histologicky potvrdených kalcifikácií (obr. 1C). Falošne negatívny príjem [18F]-NaF, ako percento histologicky overených (mikro)kalcifikačných oblastí mimo prekrytia, bol medián 0 percent [IQR 0 – 25 percent] pre červené oblasti alizarínu a medián 100 percent [65–100 percent ] pre oblasti Von Kossa. Farbenie mikrokalcifikácií alizarínovou červenou preukázalo dobrú koreláciu s absorpciou [18F]-NaF (Spearmanovo rho 0,81 (95 percent CI 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 percent absorpcie [18F]-NaF (obr. 4).

Obrázok 2. Prekryvný obrázok absorpcie [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) a mikrokalcifikácií (Alizarínová červeň) (A), s farbením alizarínovou červenou pre mikrokalcifikácie (B) a von Kossa farbením pre kalcifikácie (C).

Charakteristiky príjemcu v čase transplantektómie.

Neboli pozorované žiadne rozdiely medziobličkyvzorky alografu od pacientov s (n{{0}}) alebo bez hyperfosfatémie (n=6) pre počet oblastí [18F]-NaF (medián 5.0 [IQR 2.{11}}–11,8] oproti 7.{13}} [7.{15}}–23.0], s. =0.170) , alizarínová červená (medián 7,5 [IQR 5.0–14.0] oproti 12.{29}} [3.0 – 34.0], p{{30}},390) a Von Kossa (medián 5.{51}} [IQR 3,5–6,3] oproti 3.0 [2.{51} {59}}–5.{61}}], s. =0.247). Porovnanie vzoriek alografu obličiek od pacientov s (n=8) alebo bez (n=5) hyperparatyreoidizmom nepreukázalo rozdiely v počte oblastí [18F]-NaF (medián 7.0 [IQR 4.{7} 79}} [IQR 6.0–11.0] oproti 1{{103}}.{117}} [3,5–32,8], s{{76 }}.769) a Von Kossa (medián 4.{119}} [IQR 1,5–5.{125}}] oproti 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{{101} 131}}}}.505). Neboli identifikované významné rozdiely medzi vzorkami obličkových alografov od pacientov s (n=5) alebo bez (n{93}}) diabetes mellitus, pokiaľ ide o počet oblastí [18F]-NaF (medián 5,5 [IQR 2,5– a Von Kossa (medián 3,0 [IQR 2,0–5,8] oproti 4,0 [3,5–8,5], p=0 0,284). V čase medzi transplantáciou a transplantektómiou (mesiace) neboli pozorované žiadne významné korelácie s počtom oblastí [18F]-NaF (p=0.586), alizarínovou červenou (p=0.667) a Von Kossa (s=0.459). Pokiaľ ide o vek v čase transplantácie, nepozorovali sa žiadne významné korelácie s počtom oblastí [18F]-NaF (p=0.902), alizarínovou červenou (p=00,798) a Von Kossa (p =0.334). Podobne neboli pozorované žiadne významné korelácie medzi trvaním vytáčania (mesiace) po ňomobličkyzlyhanie alografu a počet oblastí [18F]-NaF (p=0.481), alizarínová červeň (p=0.565) a Von Kossa (p=0.174).

Obrázok 3. Korelácia počtu oblastí [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) s mikrokalcifikáciami zafarbenými alizarínovou červenou (A) a kalcifikáciami zafarbenými von Kossa (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 percent plochy povrchu indikátora [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) pre počet mikrokalcifikácií zafarbených alizarínovou červenou (A) a von Kossa, zafarbených kalcifikácií (B) (medián, medzikvartilový rozsah).

Diskusia

V tomto dôkaze koncepčnej štúdie ex-vivo absorpcia [18F]-NaF u človekaobličkyvzorky parenchýmu preukázali dobrú koreláciu s histologicky overenými mikrokalcifikáciami. Príjem [18F]-NaF koreloval silnejšie s farbením alizarínovou červenou pre aktívne mikrokalcifikácie v porovnaní s farbením konsolidovaných kalcifikácií podľa von Kossa, čo naznačuje úlohu zobrazovania [18F]-NaF pri identifikácii oblastí v ranom štádiu nefrokalcinózy.

Prezentované vzorky predstavujú zmes darcovských obličiek a explantovaných obličkových aloimplantátov. Tieto dva typy vzoriek sa líšili, pokiaľ ide o väzbu indikátora, s väčším vychytávaním [18F]-NaF pozorovaným vo vzorkách aloštepu explantovanej obličky. To je v súlade s predchádzajúcimi publikáciami, ktoré uvádzajú nárast mikrokalcifikácií po transplantácii obličky5–7. Združenie onefrokalcinózas horšou funkciou štepu v čase biopsie a jeden rok po transplantácii sa uvádza v dvoch štúdiách biopsie obličkového aloštepu, s 258 a 149obličkypríjemcov transplantátu, respektíve8,9. Okrem toho v longitudinálnej kohorte s 97 príjemcami transplantovanej obličky je výrazne horšie 1-ročné a 12-ročné prežívanie štepu preukázané u pacientov s depozitmi kalcium-oxalátu (tj prežívanie štepu 98,6 % oproti 72,5 % a 79,3 percenta oproti 49,7 percenta). V multivariačnej logistickej regresnej analýze bola prítomnosť kalcium-oxalátových depozícií nezávisle spojená so stratou grafu, v modeli, ktorý okrem iného zahŕňal kreatinín v čase biopsie a typ darcu4. Špecifická úloha mikrokalcifikácií v tejto kaskádeobličkypokles funkcie aloštepu zostáva nejasný. V predtransplantačnom klinickom prostredí sa depozície CaOx pripisujú vysokým hladinám oxalátu v sére, čo je molekula, ktorá sa počas dialýzy účinne neodstráni4. Zatiaľ čo depozície CaPhos sú najčastejšie pozorované u pacientov s hyperparatyreoidizmom a vysokými hladinami vápnika v sére v dôsledku narušeného metabolizmu minerálov pred a po transplantácii5. Nezistili sme žiadne rozdiely vo výsledkoch histológie a autorádiografie pre hyperfosfatémiu, hyperparatyreoidizmus, diabetes mellitus, čas medzi transplantáciou a transplantektómiou a trvanie dialýzy po zlyhaní obličkového aloštepu.

Na vývoj nových liečebných stratégií pre aktívne mikrokalcifikácie vnefrokalcinózajeho klinický význam vzhľadom na (chronické) zlyhanie transplantácie treba chápať komplexnejšie. S identifikáciou cieľovej populácie s vysokým rizikomobličkypríjemcov transplantátov možno navrhnúť klinické štúdie na preskúmanie liečebných stratégií21. Možné zameranie by sa dalo nájsť v up-regulácii endogénnych inhibítorov kalcifikácie so špecifickým dôrazom na osteopontín3.

Vzhľadom na vysoký výskytnefrokalcinózaa jeho spojitosti s funkciou obličkového aloštepu, je zaručené lepšie pochopenie etiológie mikrokalcifikácií. Neinvazívny a spoľahlivý diagnostický prístup na identifikáciu a kvantifikáciu mikrokalcifikácií pri včasnej nefrokalcinóze by mohol umožniť štúdie o vplyve nefrokalcinózy na funkciu transplantácie obličky. Zobrazovanie [18F]-NaF je zaujímavé, pretože vychytávanie [18F]-NaF v ľudských a zvieracích vaskulárnych vzorkách je zvýšené v biologicky aktívnych oblastiach kalcifikácie predtým, ako môžu byť tieto oblasti vizualizované pomocou mikropočítačovej tomografie16,17,22. V nedávnych klinických štúdiách PET/CT sa dokázalo, že vychytávanie [18F]-NaF súvisí s progresiou vaskulárnej kalcifikácie, čo poskytuje klinický dôkaz o použití [18F]-NaF na detekciu oblastí s biologicky aktívnou kalcifikáciou18–20. Pozorovania v tejto štúdii sú v súlade s týmito predchádzajúcimi zisteniami v oblasti vaskulárneho zobrazovania. Bola preukázaná dobrá korelácia medzi vychytávaním [18F]-NaF a histologicky potvrdenými mikrokalcifikáciami, zatiaľ čo korelácia s konsolidovanými kalcifikáciami bola jasne slabšia.

Ako bolo uvedené, identifikovala sa spoločná lokalizácia medzi vychytávaním [18F]-NaF a mikrokalcifikáciami pozitívnymi na alizarínovú červeň, zatiaľ čo oblasti vychytávania [18F]-NaF sa nelokalizovali spolu s farbením konsolidovaných kalcifikácií Von Kossa. Tieto kalcifikované oblasti s konsolidovanými kalcifikáciami a bez zodpovedajúceho príjmu [18F]-NaF možno považovať za oblasti neaktívnej kalcifikácie, kde neprebieha žiadny proces mineralizácie, ako už skôr opísali Irkle et al. v ex-vivo štúdii kalcifikácie karotíd16. Aj keď overené len na vaskulárne kalcifikácie a nie naobličkykalcifikácie parenchýmu, je podporovaná väzbovými vlastnosťami [18F]-NaF na vonkajší povrch kalcifikátov a obmedzenou penetráciou v pevných kalcifikáciách. Preto bude absorpcia [18F]-NaF vyššia pri mikrokalcifikáciách, s veľkým povrchom v porovnaní s mikrokalcifikáciami, s veľkým objemom, ale relatívne malým povrchom13,16.

Tento dôkaz koncepcie má tiež určité obmedzenia. Po prvé, čo je súčasťou dizajnu štúdie, výsledky predstavujú jeden časový bod, bez klinického sledovania progresie kalcifikácie. Po druhé, tento dôkaz koncepcie pozostáva z relatívne nízkeho počtu vzoriek obličiek, keďže transplantektómia po neskorom zlyhaní transplantácie sa vykonáva len na základe klinickej indikácie a dostupnosti odmietnutého darcu.obličkyna výskumné použitie je obmedzené23. Preto by sa nad rámec tohto projektu mala zvážiť komplexná analýza etiológie ukladania vápnika. Po tretie, klinickej translácii výsledkov bráni nedostatok vedomostí o in vivo distribúcii [18F]-NaF v obličkách a vplyve klírensu obličkového značkovača, tj nízka aktivita medzi cieľmi a pozadím by mohla obmedziť vizualizáciu kalcifikácií. Na vyriešenie tohto problému by sa mal posúdiť optimálny moment [18F]-NaF PET zobrazovania, tj kedy sa [18F]-NaF skutočne vylučuje a zostávajúca aktivita pochádza z väzby na kalcifikované oblasti. Možno to možno dosiahnuť oneskoreným zobrazením presahujúcim tri hodiny, ako sa to robí na hodnotenie koronárnych kalcifikácií24. Znížená rýchlosť glomerulárnej filtrácie zistená u príjemcov transplantátu by mohla viesť k predĺženej fáze vylučovania, čo si vyžaduje dlhší čas medzi injekciou indikátora a zobrazením PET, ale súčasné usmernenia nenaznačujú potenciálnu nefrotoxicitu indikátora [18F]-NaF11,25. Potenciálnym krokom medzi tu prezentovaným dôkazom koncepčnej štúdie a in vivo zobrazovaním môže byť ex-vivo [18F]-NaF PET zobrazovanie normotermických perfundovaných obličiek alebo in vivo [18F]-NaF mikroPET štúdie na zvieratách26,27. Po štvrté, klinická aplikácia tejto techniky by mohla byť brzdená nákladmi na vykonanie [18F]-NaF PET/CT procedúry a inherentnou radiačnou expozíciou. Nové digitálne PET kamerové systémy s vyššou citlivosťou však môžu znížiť oboje v dôsledku kratšieho času skenovania a nižšej dávky injektovanej aktivity.

Sila tohto dôkazu koncepčnej štúdie spočíva v podrobnom porovnaní mikrokalcifikácií identifikovaných pomocou [18F]-NaF autorádiografie a histológie. Príjem [18F]-NaF v rôznych vzorkách sa mohol porovnávať bez potreby ďalších úprav, pretože všetky vzorky boli inkubované v rovnakom roztoku [18F]-NaF. Okrem toho táto štúdia poskytuje prvé údaje ukazujúce vizuálnu a štatistickú zhodu medzi absorpciou [18F]-NaF a histologicky overenými mikrokalcifikáciami vo vzorkách obličiek.

Cistanche-funkcia obličiek

Na záver uvádzame prvé údaje o použití [18F]-NaF v autorádiografickej štúdii na identifikáciu mikrokalcifikácií v aktívnychnefrokalcinózapoobličkytransplantácia. Táto ex-vivo [18F]-NaF proof of concept štúdia je prvým krokom k potenciálnemu použitiu klinického [18F]-NaF PET/CT u príjemcov transplantátu obličky.

Metódy

Ľudskéobličkyvzorky.

Obličkové tkanivo bolo získané po transplantektómii (n{0}}) a z vyradených obličiek od mŕtvych darcov (n{1}}) v prípade poklesu darcovej obličky pridruženými transplantačnými centrami. Klinické údaje od príjemcov a darcov obličkových transplantátov boli získané zo zdravotných záznamov pacientov, vrátane prítomnosti hyperparatyreoidizmu, hyperfosfatémie a diabetes mellitus pred transplantektómiou a klinického hodnotenia patológie vzoriek obličkových aloštepov hlásených pomocou Banfovej klasifikácie renálnej aloštepovej patológie28. Výskumné aktivity boli vykonávané v súlade s deklaráciou Helsinských etických princípov pre lekársky výskum zahŕňajúci ľudské subjekty a Inštitucionálna hodnotiaca komisia túto štúdiu schválila (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Od všetkých príjemcov transplantátu bol získaný informovaný súhlas a bol daný súhlas na použitie vyradených obličiek od mŕtvych darcov na výskumné účely. Klinické a výskumné aktivity boli v súlade so zásadami Istanbulskej deklarácie, ako je uvedené v Istanbulskej deklarácii o obchodovaní s orgánmi a transplantačnej turistike.

Štandardný operačný postup (SOP) pre odber vzoriek tkaniva bol nasledovný: Vzorky sa odobrali na chirurgickom zákroku, ihneď po extrakcii obličky (pre transplantektómiu) alebo pri príchode vyradeného darcu.obličkyv našom transplantačnom centre. Vzorky použité na tento experiment boli odobraté v priečnej rovine horného pólu, vrátane kortikálneho a medulárneho tkaniva obličiek, s veľkosťou medzi 25 mm x 15 mm a 20 mm x 40 mm. Tieto vzorky boli fixované vo formalíne a zaliate do parafínu. Pomocou mikrotómového presného rezacieho prístroja boli vyrobené tri um rezy zaliate do parafínu. Tieto rezy boli pripevnené na sklo adhézneho mikroskopu (TOMO, Matsunami Glass, USA). Sériové sekcie, tj susedné sekcie, ktoré odhaľujú sekvenčné vrstvyobličkyvzorky tkaniva, sa použili na autorádiografiu a histologickú analýzu. Pred inkubáciou so značkovačom a histologickým farbením boli rezy zbavené parafínu, rehydratované v demineralizovanej vode a dočasne uložené vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS).

[18F]-NaF inkubácia a autorádiografia.

Experiment ex vivo bol založený na protokole použitom v predchádzajúcich štúdiách od Hopa a kol. a Reijrink a kol.22,29. Prvou štúdiou je autorádiografická štúdia vychytávania [18F]-NaF v karotických plakoch od pacientov s cievnou mozgovou príhodou podstupujúcich chirurgický zákrok, s CT indikáciou kalcifikácie ako porovnanie. Druhá štúdia je autorádiografická štúdia vychytávania [18F]-FDG vo vzorkách tukového tkaniva s imunohistochémiou sériových rezov ako porovnaním. Jeden z troch sériových rezov sa kúpal v roztoku [18F]-NaF s koncentráciou 618 milibecquerelov (MBq) v 300 ml PBS pri teplote miestnosti počas 30 minút. Premytie sa uskutočnilo trikrát opláchnutím studeným PBS a dvakrát studenou vodou. Vzorky sa vysušili na vzduchu a na vzorky sa umiestnilo zatemnené fosforové sito. Expozícia sa uskutočnila cez noc, počas 24 hodín a 30 minút. Stanovenie distribúcie a intenzity tkanivovej aktivity sa uskutočnilo na fosforovej obrazovke s použitím Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, USA).

Alizarínová červeň a von Kossa farbenie.

Farbenie alizarínovou červenou sa uskutočnilo na vizualizáciu akumulácie vápnika v počiatočnom štádiu kalcifikácie. Vzorky sa inkubovali v 2 % w/v roztoku alizarínovej červene (rozpustenej v demineralizovanej vode), pH 4,2 počas 5 minút30. Premývanie sa uskutočnilo 20-krát opláchnutím v 1:1 acetón/xylén a 20-krát opláchnutím v 100 percentnom xyléne. Uskutočnilo sa farbenie von Kossa na vizualizáciu prítomnosti molekúl anorganického fosfátu v konsolidovaných kalcifikáciách. Stručne povedané, vzorky boli inkubované v 1% roztoku dusičnanu strieborného (AgNO3) počas 1 hodiny, pričom boli vystavené slnečnému žiareniu30. Striedavo s trojnásobným opláchnutím v demineralizovanej vode sa inkubácia uskutočnila s tiosíranom sodným počas 5 minút, po ktorej nasledovala inkubácia v jadrovej rýchlej červenej počas 3 minút.

Spracovanie a analýzy obrazu.

Zafarbené tkanivové rezy boli digitalizované pomocou Hamamatsu Nanozoomer 2.{1}}HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japonsko) a snímky boli skontrolované pomocou softvéru Aperio ImageScope verzie 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Nemecko). Autorádiografia a kvantitatívne počítačové analýzy obrazu sa uskutočnili pomocou softvéru ImageJ, verzia 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Pre všetky histologické snímky sa použilo odčítanie pozadia, pričom sa na okraj histologickej vzorky vložil obrys. Poloautomatická detekcia kalcifikácií pri farbení Alizarinovou červenou a Von Kossa bola vykonaná pomocou ImageJ-BioVoxxel Toolbox31. Pre všetky vzorky boli aplikované prahové hodnoty a detekované oblasti kalcifikácie boli rozšírené v 6 iteráciách, aby sa optimalizovala vizualizácia. Pre autorádiografické snímky sa rotácia a zmena veľkosti vykonali na základe pôvodných histologických vzoriek. Prahové hodnoty sa aplikovali na všetky vzorky, čo viedlo k oblastiam vychytávania indikátora, podľa prístupu opísaného Irkle et al.: obrázky boli prahované pomocou metódy Otsu, po ktorej nasledovalo Gaussovo rozmazanie a prahovanie pomocou metódy Li16. Prekryvné snímky boli získané porovnávaním obrysov zo susedných histologických snímok s následným porovnávaním výsledkov histológie a autorádiografie (obr. 1). Kvantifikácia kalcifikácie a plochy indikátora na základe pixelov (ako percento plochy vzorky) sa uskutočnila pomocou nástroja ImageJ—Analyze Particles.

Symptómy ochorenia obličiek Cistanche

Štatistické analýzy.

Štatistiky boli vykonané pomocou štatistického balíka pre sociálne vedy verzie 23 (IBM Corporation, Armonk NY, USA), grafy boli vytvorené pomocou GraphPad Prism 7.02 pre Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, USA) a obrázky boli vytvorené pomocou Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, USA). Výsledky boli prezentované ako medián a interkvartilový rozsah (IQR) pre skreslené údaje a ako frekvencia a percento, keď boli údaje kategorické. Skupiny sme porovnávali pomocou testov Mann–Whitney U (obojstranná phodnota<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Dostupnosť údajov

Obličky od mŕtveho darcu aobličkyAutorádiografické snímky príjemcu transplantátu vychytávania [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) s prekryvnými snímkami vychytávania [18F]-NaF s farbením mikrokalcifikácií alizarínovou červenou a farbením kalcifikácií von Kossa sú online dostupné ako doplnkové informácie. Všetky dodatočné údaje budú sprístupnené na požiadanie v súlade s predpismi IRB Univerzitného lekárskeho centra Groningen.

Referencie

1. Gwinner, W. a kol. Včasná kalcifikácia obličkových aloštepov zistená protokolovými biopsiami: príčiny a klinické dôsledky. Am. J. Transplant. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Čo jenefrokalcinóza?. Kidney Int. 88, 35 – 43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontín chráni pred vysokým obsahom fosfátovnefrokalcinózaa vaskulárna kalcifikácia. Kidney Int. 89, 1027 – 1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Včasná prítomnosť ukladania šťavelanu vápenatého vobličkybiopsia štepu je spojená so zlým dlhodobým prežívaním štepu. Am. J. Transplant. 5, 323-329 (2005).

5. Evenepoel, P. a kol. Lokalizácia, etiológia a vplyv depozitov fosforečnanu vápenatého v obličkových aloimplantátoch. Am. J. Transplant. 9, 2470-2478 (2009).

6. Nankivell, BJ a kol. Prirodzená anamnéza chronickej aloštepovej nefropatie. N. Engl. J. Med. 349, 2326-2333 (2003).

7. Schwarz, A. a kol. Rizikové faktory pre chronickú aloštepovú nefropatiu po transplantácii obličky: protokolová štúdia biopsie. Kidney Int. 67, 341-348 (2005).

8. Bagnasco, SM a kol. Oxalátové usadeniny v biopsiách z natívnych a transplantovaných obličiek a vplyv na funkciu štepu. Nephrol. Vytočiť. Transplantácia. 24, 1319 – 1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Ukladanie oxalátu v biopsiách renálneho aloštepu do 3 mesiacov po transplantácii je spojené s dysfunkciou aloštepu. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Zabudli sme na zobrazovanie pred a po transplantácii obličky?. Eur. Radiol. 28, 3263 – 3267 (2018).

11. Beheshti, M. a kol. 18F-NaF PET/CT: Pokyny pre postup EANM pre zobrazovanie kostí. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR a kol. Koronárny arteriálny príjem 18F-fluoridu sodného. J. Am. Zb. Cardiol. 59, 1539 – 1548 (2012).

13. Dweck, MR a kol. Vychytávanie 18F-fluoridu sodného je markerom aktívnej kalcifikácie a progresie ochorenia u pacientov s aortálnou stenózou. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371-378 (2014).

14. Derlin, T. a kol. Uskutočniteľnosť 18F-fluoridu sodného PET/CT na zobrazenie aterosklerotického plátu. J. Nucl. Med. 51, 862 – 865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Identifikácia cieľa pre diagnostiku a intervenciu vulnerabilných aterosklerotických plakov za zobrazovaním pomocou 18F-fluorodeoxyglukózovej pozitrónovej emisnej tomografie: sľubné indikátory na obzore. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. a kol. Identifikácia aktívnej vaskulárnej mikrokalcifikácie pomocou pozitrónovej emisnej tomografie fluoridu sodného 18F. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD a kol. 18 Amplifikácia F-fluoridového signálu identifikuje mikrokalcifikácie spojené s nestabilitou aterosklerotického plátu v obrazoch pozitrónovej emisnej tomografie/počítačovej tomografie. Circ. Cardiovasc. Imaging 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM a kol. Vaskulárny príjem na pozitrónovej emisnej tomografii fluoridu sodného 18F: prekurzor vaskulárnej kalcifikácie? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. a kol. Korelácia zápalu hodnotená 18F-FDG PET, aktívna depozícia minerálov hodnotená 18F-fluoridovou PET a vaskulárna kalcifikácia v aterosklerotickom plaku: štúdia PET/CT s dvojitým indikátorom. J. Nucl. Med. 52, 1020 – 1027 (2011).

20. Kitagawa, T. a kol. Prediktívna hodnota pozitrónovej emisnej tomografie 18F-fluoridu sodného pri detekcii vysokorizikového ochorenia koronárnych artérií v kombinácii s počítačovou tomografiou. J. Am. Heart Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. a kol. Endogénne inhibítory kalcifikácie v prevencii vaskulárnej kalcifikácie: konsenzus z akcie COST EuroSofCalcNet. Predné. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. a kol. 18F-fluorid sodný pozitrónová emisná tomografia hodnotila mikrokalcifikácie v karotických plakoch vinníka a nevinníka. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064 – 1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrektómia po zlyhaní transplantácie: súčasná prax a výsledky. Am. J. Transplant. 7, 1961 – 1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. a kol. Trojhodinové oneskorené zobrazovanie zlepšuje hodnotenie koronárneho 18F-fluoridu sodného PET. J. Nucl. Med. 60, 530 – 535 (2019).

25. Bucerius, J. a kol. Stanovisko Kardiovaskulárneho výboru Európskej asociácie nukleárnej medicíny (EANM) k PET zobrazovaniu aterosklerózy. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. a kol. Obličky ošípaných DCD analyzované pomocou MRI na posúdenie ex vivo ich životaschopnosti. Transplantácia 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. a kol. Infúzia mezenchymálnych stromálnych buniek do ošípanýchobličkypočas normotermickej strojovej perfúzie: intaktné MSC možno vysledovať a lokalizovať do glomerulov. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. a kol. Referenčná príručka pre Banfovu klasifikáciu patológie renálneho aloštepu z roku 2018. Transplantácia 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. a kol. Vychytávanie [18F]FDG v tukovom tkanive nesúvisí so zápalom u diabetes mellitus 2. typu. Mol. Imaging Biol. 23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. a kol. Vaskulárna kalcifikácia a aortálna fbróza bifunkčná úloha osteopontínu pri diabetickej artérioskleróze. Arter. TrombVascBiol 31, 1821-1833 (2011).

31. Brocher, J. Kvalitatívne a kvantitatívne vyhodnotenie dvoch nových binarizačných algoritmov limitujúcich histogram. Int. J. Obrazový proces. 8, 30 – 48 (2014).

Poďakovanie

Tento výskumný projekt je podporený grantom nadácie De Cock-Hadders Foundation (kód projektu 2018-03).

Autorské príspevky

SB prispela k návrhu, akvizícii a analýze a vypracovala rukopis. IFA, MR a MLCB prispeli k návrhu, akvizícii a analýze a podstatne zrevidovali rukopis. SPB, CM a MHdB prispeli ku koncepcii a obsahovo prepracovali rukopis. JLH, RHJAS a RAP prispeli ku koncepcii, dizajnu a analýze a podstatne zrevidovali rukopis.

Konkurenčné záujmy

Autori nedeklarujú žiadne konkurenčné záujmy.