Spike a Nsp6 sú kľúčové determinanty útlmu SARS-CoV-2 Omicron BA.1

Variant SARS-CoV-2 Omicron je imunitne vyhýbavejší a menej virulentný ako iné hlavné vírusové varianty, ktoré boli doteraz rozpoznané1–12. Za hlavnú hybnú silu týchto fenotypov sa považuje proteín Omicron spike (S), ktorý má nezvyčajne veľký počet mutácií. Tu sme vytvorili chimérický rekombinantný SARS-CoV-2 kódujúci gén S Omicron (línia BA.1) v chrbtici pôvodného izolátu SARS-CoV-2 a porovnali sme tento vírus s prirodzene cirkulujúcim Omicronom varianta. Vírus nesúci Omicron S robustne unikol humorálnej imunite vyvolanej vakcínou, hlavne kvôli mutáciám v motíve viažucom receptor; na rozdiel od prirodzene sa vyskytujúceho Omicronu sa však účinne replikuje v bunkových líniách a primárnych distálnych pľúcnych bunkách. Podobne aj u myší K18-hACE2, hoci vírus Omicron S spôsobil menej závažné ochorenie ako vírus predkov, jeho virulencia nebola oslabená na úroveň Omicron. Ďalšie skúmanie ukázalo, že mutujúci neštrukturálny proteín 6 (nsp6) okrem proteínu S bol dostatočný na rekapituláciu oslabeného fenotypu Omicron. To naznačuje, že hoci je únik Omicronu z vakcíny riadený mutáciami v S, patogenita Omicronu je určená mutáciami v proteíne S aj mimo neho.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Od decembra 2022 boli následné vlny pandémie COVID{1}} poháňané piatimi hlavnými variantmi SARS-CoV-2, známymi ako varianty vyvolávajúce obavy (VOC): Alpha (B.1.1.7) Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2 a AY línie) a Omicron (BA línie)13. Omicron je najnovšie uznané VOC a bol prvýkrát zdokumentovaný v Južnej Afrike, Botswane a cestovateľom z Južnej Afriky v Hongkongu v novembri 2021 (ID GISAID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Rýchlo sa prehnala svetom, pričom v priebehu týždňov vytlačila predtým dominantný variant Delta a do januára 2022 predstavovala väčšinu nových infekcií SARS-CoV{20}} (odkazy 16–18). Doteraz bolo identifikovaných najmenej päť línií Omicron: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 a BA.5. BA.1 (ďalej označovaný ako Omicron) vykazuje pozoruhodný únik z humorálnej imunity vyvolanej infekciou a vakcínou3,19. Okrem toho je menej virulentný ako iné VOC u ľudí a in vivo modelov infekcie4,5,7,11,12,20. Omicron sa líši od prototypu izolátu SARS-CoV-2, Wuhan-Hu-1, 59 aminokyselinami; 37 z týchto zmien je v proteíne S, čo zvyšuje možnosť, že S je jadrom patogénneho a antigénneho správania Omicron.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Mutácie S ovplyvňujú replikáciu Omikrónu v bunkovej kultúre

Proteín Omicron S obsahuje 30 aminokyselinové substitúcie, 6 delécií a jednu inzerciu s dĺžkou 3 aminokyselín v porovnaní s Wuhan-Hu-1 (rozšírené údaje obr. 1). Dvadsaťpäť z týchto zmien je jedinečných pre Omicron v porovnaní s inými VOC, hoci niektoré z nich boli hlásené v odpadových vodách a menších variantoch SARS-CoV-221,22. Aby sme otestovali úlohu proteínu S vo fenotype Omicron, vytvorili sme chimérický rekombinantný vírus obsahujúci gén S Omicron (USA-lh01/2021) a všetky ostatné gény pôvodného SARS-CoV-2 (GISAID EPI{101} {16}}ISL_2732373)23 (Rozšírené údaje, obr. 2a). Tento chimérický vírus, nazvaný Omi-S, bol vyrobený s použitím modifikovanej formy cirkulárnej polymerázovej predlžovacej reakcie (CPER)24 (rozšírené údaje, obr. 2b), ktorá poskytla vysoko koncentrované vírusové zásoby obsahujúce 0,5 × 106 –5 × 106 plakov. jednotiek (PFU) na ml, z transfekovaných buniek do dvoch dní po transfekcii (rozšírené údaje obr. 2c, d), čím sa odstráni potreba ďalšej vírusovej amplifikácie.

Obr. 1|Účinok S na kinetiku rastu in vitro Omicronu. Schéma vírusov. S, hrot; N, nukleokapsid. b–e, bunky ACE2/TMPRSS2/Caco{3}} (b,d) a bunky Vero E6 (c,e) boli infikované pri MOI 0.01 a percento N-pozitívnych buniek (n=6 replikátov) (b,c) a uvoľňovanie infekčných častíc (n=3 replikátov) (d,e) boli stanovené prietokovou cytometriou a plakovým testom, resp. f, bunky ACE2/TMPRSS2/Caco-2 boli infikované zmesami vírusov v pomere 1:1, aby sa získal konečný MOI 0.005 pre každý vírus . Bunky boli fixované v uvedených časoch a podrobené prietokovej cytometrii. Vľavo, reprezentatívny bodový graf; vpravo, percento neinfikovaných, Omi-S/mCherry-infikovaných, Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG)-infikovaných a dvakrát infikovaných buniek. Na kompenzáciu sa použili jednotlivo infikované bunky. Chybové úsečky, priemer ± sd (n {{20}} replikátov). g, Veľkosti plakov. Vľavo, reprezentatívne obrázky plakov na bunkách ACE2/TMPRSS2/Caco{23}}. Vpravo je priemer plakov vynesený ako priemer ± smerodajná odchýlka 20 plakov na vírus. h boli ľudské epitelové bunky iAT2 infikované pri MOI 2,5 počas 48 hodín alebo 96 hodín. Apikálna strana buniek sa premyla 1 x fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a hladiny infekčných vírusových častíc sa merali plakovým testom. Chybové úsečky, priemer ± sd (n=4 replikátov). Experimenty sa opakovali dvakrát, pričom každé opakovanie experimentu obsahovalo 3 (b–g) alebo 4 (h) replikáty. Hodnoty P boli vypočítané dvojstranným, nepárovým t-testom s Welchovou korekciou. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 a ****P < 0,0001; NS, nie je významné. Stratégia hradlovania pre prietokovú cytometriu je znázornená na doplnkovom obrázku 1.

Najprv sme porovnali účinnosť infekcie Omi-S s pôvodným vírusom obsahujúcim D614G (GISAID EPI_ISL_2732373; generovaný pomocou CPER; ďalej označovaný ako divoký typ (WT)) a izolátom Omicron (USA-lh01/2021) v bunkovej kultúre (obr. 1a). Na tento účel sme infikovali bunky ACE2- a TMPRSS2-exprimujúce Caco-2 (ďalej len ACE2/TMPRSS2/Caco-2) a Vero E6 bunky Omi-S, WT a Omikrón pri multiplicite infekcie (MOI) 0,01 a sledovali sa šírenie vírusu prietokovou cytometriou a testom tvorby plakov. Vírus WT a Omi-S sa rýchlo šírili v bunkách ACE2/TMPRSS2/Caco{22}}, pričom 24 hodín po infekcii (HPI) poskytli 89 % a 80 % infikovaných buniek (Obr. 1b). Naopak, Omicron sa replikoval pomalšie, čo viedlo k 48 % infikovaným bunkám pri 24 hpi. Podobný vzor bol pozorovaný v bunkách Vero E6, v ktorých 60 % a 41 % buniek bolo pozitívnych na WT a Omi-S, v danom poradí, pri 48 hpi, na rozdiel od 10 % na Omicron (obr. 1c). Test plakov ukázal, že hoci Omi-S aj Omicron produkovali nižšie hladiny infekčných vírusových častíc v porovnaní s WT, vírusový titer Omi-S bol významne vyšší ako titer Omicron. V bunkách ACE2/TMPRSS2/Caco-2 Omi-S produkoval 5.{44}}násobok (P=0.0006) a 5{48}}násobok (P {{49} }.0312) viac infekčných častíc ako Omicron pri 12 hpi a 24 hpi (obr. 1d). Podobne v bunkách Vero E6 boli titre infekčného vírusu Omi-S 17-krát (P=0.0080) a 11-krát (P=0.0078) vyššie ako Omicron pri 24 hpi a 48 hpi, v tomto poradí (obr. 1e). Rozdiel medzi vírusmi sa stal menej zrejmým v neskorších časových bodoch v dôsledku vyššej cytotoxicity spôsobenej Omi-S v porovnaní s Omicron (rozšírené údaje, obr. 3a). Zvýšená účinnosť replikácie Omi-S v porovnaní s Omicron bola zachovaná pri testovaní pri rôznych MOI (rozšírené údaje, obr. 3b). Ďalej sme potvrdili fitness výhodu Omi-S oproti Omicron priamym konkurenčným testom. Na tento účel sme najprv vytvorili rekombinantný Omicron (mikrón), ktorý v našich testoch na bunkových kultúrach napodobňoval kinetiku replikácie prirodzeného Omikrónu (rozšírené údaje, obr. 4). Ďalej sme vytvorili Omi-S s obsahom mCherry a Omicron s obsahom mNeonGreen a naočkovali sme bunky ACE2/TMPRSS2/Caco-2 týmito vírusmi zmiešanými v pomere 1:1. Prietoková cytometrická analýza infikovaných buniek v rôznych časoch infekcie ukázala, že Omi-S/mCherry bola jednoznačne lepšia ako Omicron/mNeonGreen, pokiaľ ide o replikáciu (obr. 1f). Napokon, vyššia infekčná účinnosť Omi-S sa odrazila aj na veľkosti plaku; hoci WT vírus produkoval najväčšie plaky (okolo 4,1 mm), veľkosť Omi-S plakov (okolo 2,2 mm) bola dvojnásobne väčšia (P < 0,0001) ako veľkosť Omicron plakov (okolo 1,1 mm) (obr. 1g). Tieto výsledky naznačujú, že hoci mutácie v proteíne S ovplyvňujú účinnosť infekcie Omicron, úplne nevysvetľujú fenotyp Omicron.

Niekoľko línií dôkazov ukázalo, že proteín S začlenený do Omi-S sa správal rovnakým spôsobom ako v prirodzenom Omicrone. Napríklad, ako bolo opísané vyššie20,25, Omicron S bol slabo štiepený v porovnaní s WT S; zatiaľ čo 71 % S vo viriónoch WT bolo v štiepenej forme, iba 45 % a 47 % sa štiepilo v Omi-S a Omicron, v danom poradí (rozšírené údaje obr. 5a). Rovnaký vzor štiepenia S bol evidentný v bunkách infikovaných vírusom (WT, 63 % štiepených; Omi-S, 33 % štiepených; Omicron, 42 % štiepených) (Rozšírené údaje Obr. 5b). Tieto experimenty tiež odhalili, že Omicron S bol neefektívne začlenený do vírusových častíc v porovnaní s WT S (pomer S k nukleokapsidu (N): 3,40 pre vírus WT, 1,91 pre Omi-S a 2,04 pre Omicron) (Rozšírené údaje, obr. 5a). Podobne Omi-S aj Omicron produkovali menšie syncýtiá v porovnaní s vírusom WT, čo je pozorovanie, ktoré bolo predtým zaznamenané pre Omicron20,26 (rozšírené údaje obr. 5c). Nakoniec, v súlade s publikovanou literatúrou25, Omi-S a Omicron vykazovali preferenciu pre vstup sprostredkovaný katepsínom, čo sa odráža v ich vyššej citlivosti na inhibítor katepsínu E64d (rozšírené údaje, obr. 6). Ďalej sme porovnali kinetiku replikácie WT, Omi-S a Omicron v pľúcnych epiteliálnych bunkách, ktoré tvoria hlavné miesto replikácie vírusu u pacientov s COVID-19 (odkazy 27, 28). V súlade s tým sme použili ľudské indukované pluripotentné kmeňové (iPS) bunky odvodené z pľúcnych alveolárnych epitelových buniek typu 2 (iAT2). Bunky AT2 predstavujú základnú bunkovú populáciu v distálnych pľúcach a predstavujú jeden z primárnych cieľov infekcie SARS-CoV-228,29. Infikovali sme bunky iAT2, pestované ako kultúra rozhrania vzduch-kvapalina (ALI), pri MOI 2,5 a monitorovali sme sekréciu vírusového potomstva na apikálnej strane buniek pri 48 hpi a 96 hp. V súlade s výsledkami získanými z bunkových línií vírus WT produkoval najvyššie hladiny infekčných vírusových častíc (obr. 1h). Medzi Omi-S a Omicron, prvý z nich priniesol približne päťnásobne (P=0.0008) vyšší infekčný vírusový titer pri 48 hp. Vírusové titre pre WT a Omi-S sa znížili pri 96 dpi v porovnaní so 48 hp v dôsledku cytopatického účinku (CPE) infekcie. Pre Omicron však nebol pozorovaný žiadny CPE, čo viedlo k trvalej produkcii infekčných viriónov. Celkovo tieto výsledky potvrdzujú záver, že mutácie v S úplne nezodpovedajú za oslabenú replikačnú kapacitu Omicronu v bunkovej kultúre.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Minimálna úloha S v patogenite Omicron u myší

Aby sme zistili, či Omi-S vykazuje vyššiu in vivo kondíciu v porovnaní s Omikronom, skúmali sme výsledok infekcie Omi-S v porovnaní s WT SARS-CoV-2 a Omicron u K18-hACE2 myší. V súlade s publikovanou literatúrou4,5 intranazálna inokulácia myší (vo veku 12–20 týždňov) s Omicronom (104 PFU na myš) nespôsobila žiadny významný úbytok hmotnosti, zatiaľ čo očkovanie vírusom WT spustilo rýchly pokles telesnej hmotnosti, pričom všetky myši do 8 dní po infekcii (dpi) stratili viac ako 20 % svojej pôvodnej telesnej hmotnosti (obr. 2a). Je pozoruhodné, že 80 % myší infikovaných Omi-S tiež stratilo viac ako 20 % svojej telesnej hmotnosti o 9 dpi (obr. 2a a rozšírené údaje obr. 7a). Vyhodnotenie klinických skóre (kumulatívna miera úbytku hmotnosti, abnormálneho dýchania, aberantného vzhľadu, zníženej schopnosti reagovať a zmeneného správania) tiež odhalilo podobný vzorec; zatiaľ čo myši infikované Omikronom vykazovali málo alebo žiadne príznaky klinického ochorenia, zdravie tých, ktorí boli infikovaní WT a Omi-S, sa rýchlo zhoršilo, pričom vírus WT spôsobil závažnejšie ochorenie (P=0.0102) (obr. 2b a rozšírené údaje na obr. 7b). Keďže SARS-CoV-2 spôsobuje smrteľnú infekciu u myší K18-hACE24, porovnali sme prežitie myší po vírusovej infekcii. V súlade s výsledkami úbytku telesnej hmotnosti a klinického skóre spôsobili WT a Omi-S úmrtnosť 100 % (6/6) a 80 % (8/10). Naproti tomu všetky myši infikované Omicronom prežili (obr. 2c). Tieto zistenia, ktoré sú v súlade s nedávnou publikáciou30, naznačujú, že proteín S nie je výhradným determinantom patogenity Omicron u K18-hACE2 myší.

Ďalej sme porovnali šírenie Omi-S s Omicron a WT SARS-CoV-2 v pľúcach a nosových muškách K18-hACE2 myší. Myši (vo veku 12 až 20 týždňov) boli intranazálne stimulované 104 PFU (sedem myší na vírus) a vírusové titre v pľúcach myší sa merali pri 2 a 4 dpi. V súlade so zisteniami in vitro bol titer infekčného vírusu v pľúcach myší infikovaných WT vyšší ako titer zistený u myší infikovaných ďalšími dvoma vírusmi (obr. 2d). Je však pozoruhodné, že myši infikované Omi-S produkovali 30-násobne (P=0.0286) viac infekčných vírusových častíc v porovnaní s myšami infikovanými Omicron pri 2 dpi. Titer klesol pri 4 dpi pre myši infikované WT a Omi-S, ale vykazoval rastúci trend u myší infikovaných Omicron, čo poukazuje na možnosť miernej, ale pretrvávajúcej infekcie Omicron u myší K18-hACE2. Všetky tri varianty získané z pľúc myší si zachovali rovnaký fenotyp veľkosti plaku ako pôvodné inokulum, čo naznačuje, že replikácia u myší nemala žiadny detegovateľný účinok na genotypy týchto vírusov (údaje nie sú uvedené).

Aby sme vyhodnotili vírusovú patogenitu v pľúcach a nosových muškách K18-hACE2 myší, vykonali sme histopatologickú analýzu týchto tkanív pri 2 dpi. Ako už bolo uvedené4,31, v pľúcnych alveolách myší infikovaných vírusom WT sa zistila rozsiahla takmer difúzna imunoreaktivita proteínu SARS-CoV-2 N (obr. 2e). Naproti tomu infekcia Omi-S a Omicron produkovala lokalizované ložiská alveolárneho farbenia s menším počtom ohnísk pre Omicron v porovnaní s Omi-S. Najvýraznejší fenotyp bol pozorovaný v bronchiolovom epiteli, v ktorom Omi-S spôsobil výraznú, rutinne obvodovú infekciu, pričom približne 10–15 % bronchiolov bolo pozitívnych na vírusový proteín N pri 2 dpi, zatiaľ čo iba 3–5 % bronchiolov bolo N. -pozitívne pre Omicron (obr. 2f). Vírus WT infikoval približne 1 % bronchiolov a vo všetkých prípadoch obsahoval iba jednu izolovanú epitelovú bunku na bronchiol. Okrem toho bola bronchiolárna infekcia spojená s epiteliálnou nekrózou u myší infikovaných Omi-S, ako sa stanovilo prostredníctvom analýzy sériových hematoxylínových a eozínových (H&E) sekcií, zatiaľ čo u myší infikovaných Omikronom alebo WT neboli pozorované žiadne histologické dôkazy poškodenia dýchacích ciest (rozšírené údaje Obr. 8a, b). Nosové mušle myší naočkovaných vírusmi WT a Omi-S obsahovali veľké množstvo SARS-CoV-2-pozitívnych buniek, ktoré boli spojené so zjavnými cytopatickými účinkami, zatiaľ čo Omicron produkoval zriedkavé, sporadicky pozitívne bunky bez zjavných príznakov epitelu zranenia (Rozšírené údaje Obr. 8c). Celkovo tieto zistenia naznačujú, že replikácia Omicronu v respiračnom trakte myší je podstatne oslabená v porovnaní s Omi-S, čo podporuje náš záver, že mutácie v S sú len čiastočne zodpovedné za oslabenú patogenitu Omicronu.

Mutácie v S a nsp6 definujú omikrónový útlm

Okrem proteínu S má Omicron v porovnaní s vírusom WT zmeny aminokyselín v neštrukturálnom proteíne 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, obale (E), membráne (M) a N. (Rozšírené údaje Obr. 9a). Aby sme identifikovali proteíny bez špičiek, ktoré sa podieľajú na zoslabení Omicron, vytvorili sme veľký panel fluorescenčne značených chimérických vírusov, z ktorých každý obsahuje Omicron S v kombinácii s jedným nespikový proteínom Omicron, pričom zvyšné proteíny pochádzajú z vírusu WT (Rozšírené údaje Obr. 9b). Keď sme skombinovali Omicron S s Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), pozorovali sme silný pokles vírusovej replikácie, pričom kinetika infekcie napodobňovala kinetiku Omicronu v bunkovej kultúre (obr. 3a–d); pri iných chimérických vírusoch sa nepozorovalo žiadne takéto zníženie. Slabá účinnosť replikácie Omi-S / nsp6 bola tiež potvrdená naším zistením, že obnovenie Omi-S / nsp6 a Omicron trvalo takmer päť až šesť dní pomocou CPER, zatiaľ čo všetky ostatné varianty boli obnovené za dva dni (údaje nie sú uvedené). Nakoniec, podobne ako Omicron, Omi-S/nsp6 jasne prekonal Omi-S v priamom konkurenčnom teste (obr. 3e).

Obr. 2|Úloha S v patogenite omikrónu. a–c, Samce a samice K18-hACE2 myší (vo veku 12–20 týždňov) boli intranazálne naočkované 1 × 104 PFU WT (n=6 myši), vírus Omi-S (n=10 myší) alebo Omicron (n {{1{{40}}}} myší). V tomto experimente sa použili dva nezávisle vytvorené vírusové zásoby. Telesná hmotnosť (a), klinické skóre (b) a prežitie (c) sa monitorovali denne počas 14 dní. Myši, ktoré stratili 20 % svojej pôvodnej telesnej hmotnosti, boli usmrtené. d,e, K18-hACE2 myšiam boli intranazálne naočkované 1 × 104 PFU WT (n=14 myší), Omi-S (n=14 myší) a Omicron (n {{ 20}} myší). Vzorky pľúc infikovaných myší sa odobrali pri 2 alebo 4 dpi, aby sa určil vírusový titer (n=4 myší) (d) alebo na imunohistochemickú (IHC) detekciu proteínu N (n=3 myší) (e). V e sú uvedené reprezentatívne obrázky IHC zobrazujúce SARS-CoV-2N (hnedá farba) v alveolách (šípky) a bronchiolách (šípky) v pľúcach myší pri rozlíšení 2 dpi. Mierka, 100 um. f, Percento N-pozitívnych bronchiolov v pľúcach infikovaných myší (n=3 myší) pri 2 dpi. Každá bodka predstavuje infikovanú myš. Štatistická významnosť bola stanovená pomocou dvojstranného, ​​nepárového t-testu s Welchovou korekciou (a,b,d,f) a log-rank (Mantel-Cox) testom (c). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 a ****P < 0,0001; NS, nie je významné.

V pľúcach K18-hACE2 myší, zatiaľ čo Omi-S spôsobil rozsiahlu bronchiolárnu infekciu a poranenie, Omicron aj Omi-S/nsp6 vykazovali zníženú infekciu bez dôkazu poškodenia epitelu (obr. 3f). V súlade s týmito zisteniami pľúca myší infikovaných Omi-S/nsp{7}} produkovali vírusové titre ekvivalentné tým, ktoré boli pozorované pre rOmicron a izolát Omicron (obr. 3g). Nakoniec prežilo 71 % myší infikovaných Omi-S/nsp6 (obr. 3h) - v kontraste s mierami prežitia iba 20 %, ktoré boli pozorované u myší infikovaných Omi-S (obr. 2c). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že mutácie v S a nsp6 sú dostatočné na definovanie oslabenej virulencie Omicron. Tieto pozorovania podporujú a ďalej rozširujú zistenia predchádzajúcej štúdie, ktorá ukazuje, že mutácie v oblasti 5′-UTR–nsp12, v ktorej sa nachádza nsp6, prispievajú k oslabeniu Omicronu u myší K18-hACE230.

Obr. 3|Mutácie v S a nsp6 riadia omikrónovú patogenitu.a–d, Kinetika replikácie uvedených reportérových vírusov mNeonGreen v bunkách ACE2/TMPRSS2/Caco{4}} (MOI=0.01) určená prietokom cytometria (n=3 replikátov) (a,c) a plakový test (n=3 replikátov) (b,d). Experimenty sa opakovali dvakrát. e, bunky ACE2/TMPRSS2/Caco{11}} boli infikované zmesami vírusov v pomere 1:1, aby sa získal konečný MOI 0.005 pre každý vírus . Bunky boli fixované v uvedených časoch a analyzované prietokovou cytometriou. Je zobrazené percento neinfikovaných, jednotlivo infikovaných a dvakrát infikovaných buniek. Na kompenzáciu sa použili jednotlivo infikované bunky. Jednotlivé dátové body sú vynesené spolu s priemerom ± sd (n=3 replikátov). Experiment sa opakoval dvakrát. f–h, K18-hACE2 myšiam boli intranazálne naočkované 1 x 104 PFU vírusov. Vzorky pľúc infikovaných myší sa odobrali pri 2 dpi na detekciu IHC proteínu N (n=3 myší) (f) alebo na stanovenie vírusových titrov (n=4 myší) (g). V f sú reprezentatívne obrázky H&E farbenia N-pozitívnych bronchiolov zobrazené vo vložkách. Bronchiolárna epiteliálna nekróza je označená šípkami. V bronchioloch myší infikovaných Omicronom alebo Omi-S/nsp6 sa nepozorovali žiadne známky nekrózy. Mierka, 100 µm. Pravý graf v f ukazuje percento N-pozitívnych bronchiolov v pľúcach infikovaných myší. Každá bodka predstavuje infikovanú myš. h, Prežitie infikovaných myší monitorované denne počas 14 dní. Myši, ktoré stratili 20 % svojej pôvodnej telesnej hmotnosti, boli usmrtené. Štatistická významnosť bola stanovená pomocou dvojstranného, ​​nepárového t-testu s Welchovou korekciou (a–g) a log-rank (Mantel-Cox) testom (h). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 a ****P < 0,0001; NS, nie je významné.

S proteín RBM riadi únik vakcíny Omicron

Veľké množstvo literatúry poskytlo dôkazy o rozsiahlom úniku Omicronu z humorálnej imunity vyvolanej vakcínou14,19. Aby sme definovali S oblasti, ktoré sú spojené s imunitným únikovým fenotypom Omicronu, najprv sme porovnali in vitro neutralizačnú aktivitu séra od očkovaných jedincov proti WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20 20), Omi-S a Omicron. Zahrnuté boli séra odobraté do dvoch mesiacov od druhej dávky mRNA-1273 (Moderna mRNA vakcína; n=12) alebo BNT162b2 (Pfizer-BioNTech mRNA vakcína; n=12) (Rozšírené údaje Stôl 1). Uskutočnili sme viaccyklový neutralizačný test s použitím prostredia, v ktorom bol vírus a neutralizačné séra neustále prítomné, čo napodobňovalo situáciu u séropozitívneho jedinca. Všetky séra slabo neutralizované Omicron, s 11.1-násobkom (rozsah: 4.{20}}násobkom až 81.2-násobkom; P < 0,0001) dolnou polovicou maximálneho neutralizačného riedenia (ND50) pre Omicron v porovnaní s WA1 (obr. 4a,b). V skutočnosti asi 80 % vzoriek úplne neneutralizovalo Omicron pri najvyššej testovanej koncentrácii (rozšírené údaje, obr. 10). Je pozoruhodné, že Omi-S vykazoval identické hodnoty ND50 ako Omicron (11,{34}}krát nižšie ako hodnoty WA1; P < 0,0001) (obr. 4a, b), čo naznačuje, že proteín Omicron S, keď je začlenený do WT vírus, správa sa rovnako ako v Omicron.

Obr. 4|Úloha S v imunitnej rezistencii Omicronu. Hodnoty ND50 pre WA1, Omi-S a Omicron v sérach od jednotlivcov, ktorí dostali dve dávky vakcíny Moderna (darcovia 1 – 12) alebo Pfizer (darcovia 13 – 24) (ďalšie podrobnosti o sérach sú uvedené v časti Rozšírené Tabuľka údajov 1, jednotlivé krivky sú znázornené na rozšírených údajoch na obrázku 10). b, Trajektórie hodnôt ND50 voči WA1, Omi-S a Omicron (údaje z a sú vynesené do grafu). Je označená násobná zmena hodnôt ND50 (n=24 vzoriek séra). c – f, Schéma chimérických (vľavo; c, d) a mutantných (vľavo; e, f) vírusov. Číslovanie aminokyselín pre mutanty WA1 v e je založené na sekvencii WA1 S, zatiaľ čo číslovanie pre mutanty Omicron v f je založené na sekvencii Omicron S. Testovalo sa šesť z 24 sér (3 od Moderny a 3 od Pfizer). Každá vzorka séra je znázornená bodkou špecifickej farby. Údaje sú vynesené ako násobok zmeny rodičovského vírusu. Štatistická významnosť bola stanovená pomocou dvojstranného, ​​nepárového t-testu s Welchovou korekciou. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 a ****P < 0,0001; NS, nie je významné.

Proteín SARS-CoV-2 S obsahuje dve domény: doménu S1, ktorá interaguje s receptorom ACE2, a doménu S2, ktorá je zodpovedná za membránovú fúziu32. V doméne S1 leží N-terminálna doména (NTD) a doména viažuca receptor (RBD), ktorá obsahuje motív viažuci receptor (RBM), ktorý vytvára priamy kontakt s receptorom ACE233. NTD Omicron S má 11 zmien aminokyselín, vrátane 6 delécií a jednej 3-inzercie s dĺžkou aminokyseliny, zatiaľ čo RBD obsahuje 15 mutácií, z ktorých 10 je sústredená v RBM (rozšírené Údaje Obr. 1). NTD aj RBD hostiteľské neutralizačné epitopy34–37, ale RBD je imunodominantný a predstavuje primárny cieľ neutralizačnej aktivity, ktorá je prítomná v imunitných sérach SARS-CoV-237,38. Aby sme určili, či je fenotyp neutralizačnej rezistencie Omicron spôsobený mutáciami v konkrétnej doméne proteínu S, vytvorili sme dve skupiny chimérických vírusov. Prvú skupinu tvoril vírus WA1 nesúci NTD, RBD alebo RBM Omicron (obr. 4c) a druhú skupinu tvoril vírus Omi-S nesúci NTD, RBD alebo RBM WA1 (obr. 4d). Neutralizačný test ukázal, že mutácie v RBM boli hlavnou príčinou rezistencie Omicron na humorálnu imunitu vyvolanú vakcínou: nahradenie RBM WA1 RBM Omicron znížilo ND50 o 5.4-krát (P < 0,0001), a naopak, nahradenie RBM Omi-S WA1 zvýšilo ND50 5.6-krát (P=0.0003) (obr. 4c, d). Skutočnosť, že žiadny z RBM-swap vírusov nedosiahol približne 11--násobok rozdielu, ktorý bol pozorovaný medzi WA1 a Omi-S, naznačuje, že mutácie v iných častiach S tiež prispievajú k rezistencii voči vakcíne.

Aby sme zistili, či špecifické mutácie vo vakcíne Omicron RBM unikajú, vytvorili sme dva ďalšie panely rekombinantných vírusov, jeden s WA1 S nesúci mutácie Omicron RBM, buď jednotlivo alebo v kombinácii (obr. 4e), a druhý s Omicron S, ktorému chýba to isté. súbor mutácií (obr. 4f). Dva mutanty WA1 – mutant 3 (so substitúciou E484A) a mutant 4 (nesúci zhluk piatich substitúcií Q493R, G496S, Q498R, N501Y a Y505H) – vykazovali mierny, ale štatisticky významný pokles 1.4--násobne ( P=0.0002) a 1.{19}}násobok (P=0.0003) v hodnotách ND50 v tomto poradí v porovnaní s WA1 (obr. 4e). Opak bol pozorovaný, keď boli tieto mutácie odstránené z Omicron S; mutant Omicron 3 (bez substitúcie E484A) a mutant 4 (bez Q493R, G496S, Q498R, N501Y a Y505H) mali 1.9-násobok (P=0.0082) a 3.{{38 }}násobne (P=0.0025) vyššie hodnoty ND50 v porovnaní s Omicron (obr. 4f). Keďže žiadny z mutantov nezachytil celkový fenotyp Omicron, predpokladáme, že únik vakcíny je kumulatívnym účinkom mutácií distribuovaných pozdĺž dĺžky proteínu S. Je možné, že mutácie zmenia konformáciu Omicron S takým spôsobom, že väčšina imunodominantných neutralizačných epitopov je narušená a stane sa nedostupnou pre neutralizáciu.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Diskusia

Táto štúdia poskytuje kľúčové poznatky o vírusových proteínoch, ktoré prispievajú k patogenite SARS-CoV-2. Ukázali sme, že S, najviac mutovaný proteín v Omicron, má neúplnú úlohu v zoslabení Omicron. V testoch bunkovej infekcie vírus Omi-S vykazuje strednú účinnosť replikácie medzi vírusom predkov a Omicron. Podobne u K18-hACE2 myší je Omi-S v kontraste s nefatálnym Omikronom a vedie k 80 % úmrtnosti; vírus predkov spôsobuje u týchto myší 100% úmrtnosť. Najmä, keď sme spojili mutácie S s mutáciami v nsp6, vírus vykazoval oslabený fenotyp, ktorý sa do značnej miery podobal fenotypu Omicron, čo naznačuje, že tieto dva proteíny sú hlavnými determinantmi patogenity Omicron. Budúce štúdie dešifrujú mechanizmus (mechanizmy), ktorým mutácie nsp6 ovplyvňujú replikáciu vírusu.

Jedným z potenciálnych obmedzení našej štúdie je použitie K18-hACE2 myší na štúdie patogenézy namiesto modelov primátov, ktoré majú viac podobností s ľuďmi39. Treba však poznamenať, že myši K18-hACE2 sú dobre zavedený model na skúmanie letálneho fenotypu SARS-CoV-24,31. Hoci sa u týchto myší vyvinula pľúcna patológia po infekcii SARS-CoV{10}}, úmrtnosť bola spojená s postihnutím centrálneho nervového systému v dôsledku vírusovej neuroinvázie a šírenia31,40. Skutočnosť, že infekcia K18-hACE2 myší s Omi-S, ale nie s Omicronom, vyvoláva neurologické príznaky (napríklad zhrbené držanie tela a nedostatočnú schopnosť reagovať), naznačuje, že vlastnosť neuroinvázie je u Omi-S zachovaná, pravdepodobne v dôsledku jeho vyššej replikačnej účinnosti a že determinanty tejto vlastnosti ležia mimo S proteínu. Tieto zistenia sú v súlade s predchádzajúcou štúdiou, ktorá ukazuje, že škrečky infikované Omi-S vylučujú podstatne viac vírusu a schudli viac ako škrečky infikované Omicronom, čo naznačuje, že mutácie mimo S prispievajú k oslabenej patogenite Omicronu41.

Zistili sme, že hoci sa vírus predkov replikuje hlavne v pľúcnych alveolách a spôsobuje len zriedkavú infekciu bronchiolov u K18-hACE2 myší, Omi-S aj Omicron vykazujú zvýšenú tendenciu replikovať sa v bronchiolárnom epiteli, čo naznačuje, že S proteín je zodpovedný za zmenený tropizmus. Mechanizmus tohto prepínača nie je známy, ale je možné, že Omicron S je účinnejší ako WT S pri použití katepsínu B alebo katepsínu L (odkaz 25, 42, 43), ktoré tvoria aktívnu cestu vstupu vírusu do bronchiolov a iných dýchacích ciest. bunky41. Naproti tomu vstup SARS-CoV-2 do alveolárnych epitelových buniek je poháňaný hlavne TMPRSS2 (odkaz 28, 44), ktorý Omicron S nedostatočne využíva25,45, čo vedie k slabej infekcii týchto buniek4,5 25,43. Tieto zistenia môžu vysvetliť oslabenú pľúcnu patológiu spôsobenú Omicronom.

cistanche benefity-posilňujú imunitný systém

Omicron nsp6 má dve zmenené miesta v porovnaní s prototypom SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1 izolátu: deléciu troch aminokyselín (LSG, pozície 105–107) a substitúciu I189V (rozšírené údaje, obr. 9). Bolo opísaných niekoľko funkcií nsp6 pri replikácii koronavírusu; hlavnou z nich je biogenéza dvojmembránových vezikúl (DMV), ktoré predstavujú miesto syntézy vírusovej RNA46–50. Predchádzajúca štúdia ukázala, že SARS-CoV{15}} DMV sú generované hlavne spoločným pôsobením troch vírusových proteínov: nsp3, nsp4 a nsp6; hoci nsp3 a nsp4 sú dostatočné na tvorbu DMV, nsp6 spája tieto DMV s endoplazmatickým retikulom a usmerňuje základnú komunikáciu medzi týmito štruktúrami46. To, či konštelácia mutácií v Omicron nsp6 ovplyvňuje tvorbu alebo funkcie DMV, si vyžaduje ďalšie skúmanie. Nsp6 tiež aktivuje NLR3-závislú produkciu cytokínov a pyroptózu v pľúcach pacientov s COVID-19, čo slúži ako kľúčový faktor virulencie47. Je potrebné poznamenať, že variant nsp6, ktorý je spojený s asymptomatickým COVID{29}}, vykazoval zníženú schopnosť vyvolať pyroptózu47, čo vyvolalo špekulácie, že mutácie v Omicron nsp6 môžu tiež ovplyvniť pyroptózu. Na rozbor účinku mutácií Omicron na funkcie nsp6 budú potrebné podrobné štúdie mechanizmu.

V súčasnosti nie je známe, či mutácie v S a nsp6 fungujú vo vzájomnej zhode pri riadení útlmu Omikrónu. Vzhľadom na to, že Omicron S vykazoval vyššiu predilekciu pre bronchioly, je možné, že S je zodpovedný za zmenený vírusový tropizmus, zatiaľ čo nespikové mutácie vrátane mutácií v nsp6-sú iba adaptáciami na zmenené tkanivové prostredie. Stojí za zmienku, že aj keď sa zdá, že nsp6 je hlavným proteínom bez špičiek za zoslabením Omicron, príspevok iných vírusových proteínov nemožno úplne vylúčiť. In vitro experimenty skúmajúce úlohu non-spike mutácií boli všetky uskutočnené v ACE2/TMPRSS2/Caco-2 bunkách. Použitie iných, imunitne kompetentnejších typov buniek by mohlo odhaliť aj účinok iných non-spike mutácií. Okrem toho naše chimérické vírusy obsahovali Omicron S spárovaný naraz iba s jedným nespikovým proteínom, čo obmedzovalo epistatické interakcie s dlhým dosahom medzi mutáciami vo viacerých vírusových proteínoch.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Naša štúdia ukazuje, že mutácie v RBM Omicron S sú hlavnými determinantmi úniku Omicronu z neutralizujúcich protilátok, hoci prispievajú aj mutácie v iných oblastiach S. V rámci RBM identifikujeme dva hotspoty mutácií, ktoré dávajú Omicron S schopnosť odolávať neutralizácii: jeden nesie substitúciu E484A a druhý obsahuje zhluk piatich substitúcií – Q493R, G496S, Q498R, N501Y a Y505H. Ukázalo sa, že substitúcia E484A uniká neutralizácii rekonvalescentným sérom51. Okrem toho štrukturálne modelovanie naznačuje, že niektoré terapeutické monoklonálne protilátky vytvárajú vysoko stabilné soľné mostíky so zvyškom E484, pričom úplne strácajú svoju väzbu, keď sa tento zvyšok zmení na A alebo po zmenách Q493K a Y505H52. Podobne mapovanie zvyškov RBM, ktoré priamo interagujú so 49 známymi neutralizačnými protilátkami, odhalilo N440, G446, S477 a T478 ako nízkofrekvenčné interaktory, N501, Y505 a Q498 ako interaktory so strednou frekvenciou a E484 a Q493 ako vysokofrekvenčné3 v súlade s našimi výsledkami neutralizačného testu. Pozoruhodné je, že aj keď je potenciál Omicron S viazať sa na protilátky54, jeho kapacita viazať sa na receptory je neporušená. V skutočnosti má Omicron RBD vyššiu afinitu k ACE2 v porovnaní s Wuhan-Hu-1 a Delta RBD25. To naznačuje, že mutácie v Omicron S sa vyvinuli takým spôsobom, že bránia väzbe protilátky, ale zachovávajú zapojenie receptora. To otvára možnosť zamerať sa na konzervované a štrukturálne obmedzené oblasti S, ktoré sa podieľajú na rozpoznávaní ACE2 pri navrhovaní širokospektrálnych vakcín na kontrolu pandémie COVID-19.

referencie

1. Liu, L. a kol. Nápadné úniky protilátok prejavujúce sa variantom SARS-CoV Omicron-2. Príroda 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. a kol. Značný únik SARS-CoV-2 Omicron k neutralizácii protilátok. Príroda 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. a kol. Plazmatická neutralizácia omikrónového variantu SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med. 386, 599-601 (2022).

4. Shuai, H. a kol. Oslabená replikácia a patogenita SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Príroda 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ a kol. SARS-CoV-2 Omicron vírus spôsobuje oslabené ochorenie u myší a škrečkov. Príroda 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA a kol. Klinické výsledky spojené s variantom SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) a infekciou podvariantov BA.1/BA.1.1 alebo BA.2 v južnej Kalifornii. Nat. Med. 28, 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. a kol. Včasné posúdenie klinickej závažnosti omikrónového variantu SARS-CoV-2 v Južnej Afrike: štúdia prepojenia údajov. Lancet 399, 437-446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA Odhady závažnosti SARS-CoV-2 Omicronového variantu v Ontáriu, Kanada. J. Am. Med. Doc. 327, 1286 – 1288 (2022).

9. Uraki, R. a kol. Charakterizácia izolátov SARS-CoV-2 Omicron BA.4 a BA.5 u hlodavcov. Príroda 612, 540–545 (2022).

10. Uraki, R. a kol. Charakterizácia a antivírusová citlivosť SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Príroda 607, 119–127 (2022).

11. Dyer, O. Covid-19: Omicron spôsobuje viac infekcií, ale menej hospitalizácií, ako ukazujú údaje z Delty v Južnej Afrike. Br. Med. J. 375, n3104 (2021).

12. Sigal, A. Miernejšie ochorenie s Omicronom: je to vírus alebo už existujúca imunita? Nat. Rev. Immunol. 22, 69 – 71 (2022).

13. KTO. Sledovanie variantov SARS-CoV-2 https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022).

14. Cele, S. a kol. Omicron značne, ale neúplne uniká neutralizácii Pfizer BNT162b2. Príroda 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. a kol. Pravdepodobný prenos omikrónového variantu SARS-CoV-2 v karanténnom hoteli, Hong Kong, Čína, november 2021. Núdzová situácia. Infikovať. Dis. 28, 460 – 462 (2022).

16. Iuliano, AD a kol. Trendy v závažnosti ochorenia a využívaní zdravotnej starostlivosti počas skorého obdobia omikronového variantu v porovnaní s predchádzajúcimi obdobiami vysokého prenosu SARS-CoV-2 – Spojené štáty americké, december 2020 – január 2022. Morb. Smrteľný. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. COVID Data Tracker https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Taylor, L. Covid-19: Omicron dosahuje týždenný rekordný počet celosvetových infekcií. Br. Med. J. 376, 66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. a kol. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 vedie k rozsiahlemu úniku z neutralizačných protilátkových reakcií. Cela 185, 467-484 (2022).

20. Suzuki, R. a kol. Oslabená fuzogenicita a patogenita SARS-CoV-2 omikrónového variantu. Príroda 603, 700–705 (2022).

21. Smyth, DS a kol. Sledovanie záhadných línií SARS-CoV-2 zistených v odpadových vodách New Yorku. Nat. komun. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE a kol. Poznámky z terénu: skoré dôkazy o variante SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) v komunálnych odpadových vodách – Spojené štáty americké, november – december 2021. Morb. Smrteľný. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. a kol. Klonovanie genómu SARS-CoV-2 bez pasáží a mutagenéza pomocou červenej rekombinácie. Int. J. Mol. Sci. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Optimalizovaná metóda funkčnej analýzy SARS-CoV založená na cirkulárnej polymerázovej extenzii-2. Predtlač na https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. a kol. Zmenené používanie TMPRSS2 spoločnosťou SARS-CoV-2 Omicron ovplyvňuje tropizmus a fuzogenicitu. Príroda 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ a kol. SARS-CoV-2 Omicron je variant imunitného úniku so zmenenou cestou vstupu do buniek. Nat. Microbiol. 7, 1161 – 1179 (2022).

27. Martines, RB a kol. Patológia a patogenéza SARS-CoV-2 spojená s fatálnym koronavírusovým ochorením, Spojené štáty americké. Emerg. Infikovať. Dis. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. a kol. SARS-CoV-2 infekcia ľudských pľúcnych alveolárnych buniek typu 2 odvodených z pluripotentných kmeňových buniek vyvoláva rýchlu epiteliálnu vnútornú zápalovú odpoveď. Cell Stem Cell 27, 962-973 (2020).

29. Mulay, A. a kol. SARS-CoV-2 infekcia primárneho ľudského pľúcneho epitelu na modelovanie COVID-19 a objavovanie liekov. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Spike proteín-nezávislé zoslabenie variantu SARS-CoV-2 Omicron u laboratórnych myší. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. a kol. Fatálna neurodiseminácia a SARS-CoV-2 tropizmus u K18-hACE2 myší len čiastočne závisí od expresie hACE2. Vírusy 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW Štrukturálne a funkčné vlastnosti vrcholového proteínu SARS CoV-2: potenciálny vývoj antivírusového lieku na COVID-19 . Acta Pharmacol. Sin. 41, 1141 – 1149 (2020).

33. Lan, J. a kol. Štruktúra domény viažucej sa na vrchol SARS-CoV-2 na receptor ACE2. Príroda 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. a kol. Neutralizačná ľudská protilátka sa viaže na N-terminálnu doménu Spikeho proteínu SARS-CoV-2. Science 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN a kol. Prevládajúce, ochranné a konvergentné rozpoznávanie epitopov SARS-CoV-2 bez RBD pomocou IgG. Science 372, 1108–1112 (2021).

36. Premkumar, L. a kol. Receptor viažuca doména vírusového spike proteínu je imunodominantným a vysoko špecifickým cieľom protilátok u pacientov so SARS-CoV-2. Sci. Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. a kol. Ľudské neutralizačné protilátky vyvolané infekciou SARS-CoV-2. Príroda 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. a kol. Mapovanie neutralizačných a imunodominantných miest na doméne viažucej sa na vrchol SARS-CoV{2}} pomocou štruktúrne riadenej sérológie s vysokým rozlíšením. Cela 183, 1024 – 1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Modely primátov (okrem človeka) pre výskum SARS-CoV-2: zvážte alternatívy k makakom. Lab Anim. 50, 113 – 114 (2021).

40. Kumari, P. a kol. Neuroinvázia a encefalitída po intranazálnej inokulácii SARS CoV-2 u K18-hACE2 myší. Vírusy 13, 132 (2021).

41. Páv, TP a kol. Zmenená vstupná dráha a antigénna vzdialenosť omikrónového variantu SARS-CoV{2}} mapujú oddelené domény spike proteínu. Predtlač na https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Modelovanie toho, ako môže zmenené využitie vstupných ciest do buniek variantom SARS-CoV-2 Omicron ovplyvniť účinnosť a synergiu inhibítorov TMPRSS2 a katepsínu B/L. Predtlač na https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY a kol. Replikácia omikrónového variantu SARS-CoV-2 v ľudskom bronchu a pľúcach ex vivo. Príroda 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. a kol. Hodnotenie vstupu SARS-CoV-2, zápalu a nových terapeutík v bunkách ľudského pľúcneho tkaniva. PLoS Pathog. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. a kol. Variant SARS-CoV-2 Omicron vykazuje menej účinnú replikačnú a fúznu aktivitu v porovnaní s variantom Delta v bunkách exprimovaných TMPRSS2-. Emerg. Mikróby infikujú. 11, 277 – 283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. a kol. Úloha NSP6 v biogenéze replikačnej organely SARS-CoV-2. Príroda 606, 761–768 (2022).

47. Sun, X. a kol. SARS-CoV-2 neštrukturálny proteín 6 spúšťa NLRP3-závislú pyroptózu zacielením na ATP6AP1. Cell Death Differ. 29, 1240 – 1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Koronavírus NSP6 obmedzuje expanziu autofagozómov. Autofágia 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. a kol. Evolučná analýza SARS-CoV-2: ako by mutácia neštrukturálneho proteínu 6 (NSP6) mohla ovplyvniť vírusovú autofágiu. J. Infect. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC RNA replikácia vírusu myšacej hepatitídy prebieha v dvojmembránových vezikulách. J. Virol 76, 3697-3708 (2002).

51. Liu, Z. a kol. Identifikácia vrcholových mutácií SARS-CoV{2}}, ktoré zmierňujú neutralizáciu monoklonálnych protilátok a protilátok v sére. Cell Host Microbe 29, 477-488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: silne zmutovaný variant SARS-CoV-2 vykazuje silnejšiu väzbu na ACE2 a účinne uniká schváleným terapeutickým protilátkam COVID-19. Predné. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. Kryo-EM štruktúra ektodomény omikrónového spike proteínu SARS-CoV-2. Nat. komun. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM a kol. Aktivita rekonvalescentného a očkovacieho séra proti SARS-CoV-2 Omicron. Príroda 602, 682–688 (2022).