Prudký pokles väzbovej schopnosti SARS-CoV-2 omikrónového variantu (B.1.1.529) RBD na protilátky v skorých COVID-19 rekonvalescenčných sérach a inaktivovaných očkovacích sérach

Pre viac informácií:Ali.ma@wecistanche.com

Abstraktné

NovýSARS-CoV-2variant B.1.1.529 bol pomenovaný WHO ako Omicron a 26. novembra 2021 bol klasifikovaný ako Variant of Concern (VOC). obavy z možných vplyvov VOC na COVID-19. Tu prostredníctvom testov ELISA s použitím rekombinantných proteínov RBD so sekvenciami rovnakými ako sú sekvencieSARS-CoV-2WIV04 (línia B.1), variant Delta a variant Omicron ako poťahové antigény, väzbové schopnosti medzi RBD a protilátkami v COVID-19 rekonvalescentných sérach a očkovacích sérach po dvoch dávkach inaktivovanej vakcíny vyrobenej Sinopharm WIBP sa navzájom porovnávajú. Výsledky ukázali, že variant Omicron sa môže vyhýbať protilátkam indukovaným rodovým kmeňom a inaktivovanou vakcínou, s významným znížením väzbovej schopnosti jeho RBD oveľa väčšou ako pri variante Delta.

Kľúčové slová:SARS-CoV-2; Omicron; varianty obáv; protilátka; doména viažuca receptor; inaktivovaná vakcína

Wenhao Zhou 1,2,†, Ping He 1,2,†, Junhua Li 1,†, Huan Liu 1,2, Mengjuan Shi 1,2, Junping Yu 1,2,*a Hongping Wei 1,2,*

1 Kľúčové laboratórium CAS pre špeciálne patogény a biologickú bezpečnosť, Centrum pre megavedu o biologickej bezpečnosti, Wuhanský virologický inštitút, Čínska akadémia vied, Wuhan 430071.

2 Univerzita Čínskej akadémie vied, Peking 100049, Čína

1. Úvod

Nový variantSARS-CoV-2Omicron (B.1.1.529), ktorý bol nahlásený v novembri 2021, bol 24. novembra 2021 identifikovaný ako variant v rámci monitorovania (VUM) a o dva dni neskôr označený WHO ako variant vyvolávajúci obavy (VOC), zatiaľ čo variant Delta prevzal jeden mesiac od variantu záujmu (VOI: 4. apríla 2021) do VOC (11. mája 2021) . K 21. decembru 2021 bol variant Omicron hlásený v 106 krajinách vo všetkých šiestich regiónoch WHO. Odhadovalo sa, že Omicron sa môže šíriť rýchlejšie ako Delta, ako uviedla WHO 17. decembra 2021. Omicron má viac ako 30-zvyškových mutácií v spike proteíne v porovnaní s 15-zvyškovými mutáciami vo variante Delta [ 1], čo môže byť dôvodom jeho zvýšenej prenosnosti [2]. Typy schválených vakcín zohrali veľkú úlohu pri kontrole šíreniaSARS-CoV-2[3,4]. Avšak s vývojomSARS-CoV-2a objavením sa VOC, protilátky generované súčasnými vakcínami môžu stratiť neutralizačnú schopnosť voči variantom [5–7]. Preto je dôležité zhodnotiť schopnosť súčasných vakcín proti rôznym variantom [8,9].

Zlatým štandardom na hodnotenie účinnosti vakcíny je stanovenie neutralizačných titrov imunizovaných sér na základe kultúr živých vírusov, ako je napríklad neutralizačný test redukcie plakov (PRNT). PRNT však potrebuje laboratórium na úrovni biologickej bezpečnosti-3 a jeho vykonávanie je nákladné a zdĺhavé. Aby bolo možné rýchlo odhadnúť neutralizačnú aktivitu séra proti novoobjaveným variantom, môžu sa na odhad neutralizačnej aktivity do určitej miery použiť testy založené na proteíne RBD, čo je receptor viažuca doména vírusu viažuceho sa na hostiteľské bunky [10]. .

Tu prostredníctvom testov ELISA s použitím rekombinantných proteínov RBD so sekvenciami rovnakými ako sekvencia SARS-CoV-2 WIV04 (línia B.1), variant Delta a variant Omicron ako poťahové antigény, väzbové schopnosti medzi RBD a protilátky v COVID-19 rekonvalescentných sérach a očkovaných sérach po dvoch dávkach inaktivovanej vakcíny vyrobenej spoločnosťou Sinopharm WIBP sa navzájom porovnávajú. Výsledky ukázali, že protilátky v oboch typoch séra mali zníženú väzbovú schopnosť na Omicron RBD, ale malé zníženie väzby na Delta RBD v porovnaní s tým na B.1 RBD naznačuje oveľa vyššiu schopnosť variantu Omicron uniknúť inaktivovanej vakcíne. a infikovať predtým uzdravených ľudí ako variant Delta.

2. Materiály a metódy

2.1. Vzorky

Jedenásť vzoriek očkovacieho séra bolo odobraných od jedenástich zdravých dobrovoľníkov približne 3 týždne po 2. dávke inaktivovanej vakcíny vyrobenej spoločnosťou Sinopharm WIBP (Wuhan Institute of Biological Products Co., Wuhan, Čína). V období od februára do mája 2020 bolo odobratých sedemnásť vzoriek séra pacientov v rekonvalescencii infikovaných SARS-CoV-2 líniou B.1 na neutralizačné testy. Všetky séra boli až do použitia skladované pri -80 ◦C. Štúdiu schválila etická komisia Wuhanského virologického inštitútu Čínskej akadémie vied (č. WIVH17202102).

2.2. Neutralizačný test redukcie plaku (PRNT)

Na vyhodnotenie vzťahu medzi neutralizačnou aktivitou pomocou PRNT a väzbovou schopnosťou RBD na protilátky v sérach meraných pomocou ELISA sa použilo celkom 24 vzoriek séra, vrátane 7 sér vyvolaných inaktivovanou vakcínou a 17 rekonvalescentných sér. PRNT je rovnaký ako predchádzajúca správa [11] s malými zmenami. Stručne povedané, bunky Vero E6 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (DMEM) obsahujúcom 10 percent fetálneho bovinného séra (FBS; Biological Industries, 04–001–1ACS, Cromwell, CT, USA) a 100 U/ml penicilín-streptomycínu. Bunky boli nasadené na 12-jamkové platne a inkubované pri 37 °C s 5 percentami CO2, kým nevytvorili monovrstvy. Roztoky SARS-CoV-2 WIV04 s titrami približne 300 plakotvorných jednotiek (PFU) sa zmiešali so štyrmi riedeniami každej vzorky séra (20, 80, 320 a 1280-krát) a inkubovali sa 1 hodinu pri 37 °C. C. Potom sa zmesi preniesli na 12-jamkové platne obsahujúce bunkové monovrstvy Vero E6, jednotlivo. Po inkubácii pri 37 °C počas 1 hodiny s 5 percentami CO2 sa zmes odstránila z jamiek a potom sa jamky prekryli DMEM s obsahom 2 percent FBS a 0,9 percenta metylcelulózy a inkubovali sa pri 37 °C s 5 percentami CO2 po dobu 4 dni. Fixácia sa potom uskutočnila pridaním 1 ml 8% formaldehydu do každej jamky a inkubáciou počas 20 minút. Nakoniec boli doštičky zafarbené 0,5% kryštálovou violeťou. PRNT50 (Väčšie alebo rovné 50 percentné zníženie počtu vírusových plakov) sa použilo na zobrazenie neutralizačných titrov, ktoré sa získali podľa EC50 prispôsobeného nelineárnou regresiou pomocou softvéru GraphPad Prism 7.

2.3. Imunosorbentný test viazaný na enzým (ELISA)

Tri rekombinantné proteíny RBD kmeňa SARS-CoV-2 B.1 (zvyšky 319–537 spike proteínu SARS-CoV-2) a variant B.1.1.529 (Omicron, zvyšky 319–537 s 15 mutácií G339D, S371L, S373P, S372F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N5051D6elta, zvyšok Y5051D6.9. -537 s mutáciami L452R a T478K) (Acro Biosystems, Peking, Čína) sa použili na test ELISA. V stručnosti, doštičky ELISA (Jet Biofifil, Guangzhou, Čína) boli potiahnuté 100 ul/jamku karbonátového pufra (pH=96) obsahujúceho rekombinantné RBD proteíny (5ug/ml) a inkubované pri 4? C cez noc. Potom boli doštičky trikrát premyté PBS obsahujúcim 0,05 percenta Tween 20 (PBST), blokované 330 ul/jamku 5 percentného sušeného odstredeného mlieka (Oxoid, Altrincham, UK) v PBST počas 2 hodín pri 37 stupňoch a potom premyté tri krát s PBST. Séra sa najskôr zriedili PBST pri 1-20 a 180 riedeniach a pridali sa do potiahnutých jamiek （100 ul na jamku）. Doštičky sa inkubovali pri 37 °C počas 1 hodiny a potom sa dôkladne premyli PBST. Nakoniec sa do paštét pridali králičie protilátky značené chrenovou peroxidázou (HRP) proti ľudskému IgG (Biodragon Immunotechnologies, Suzhou, Čína) v riedení 1∶10,000 v PBST (100 μl/jamka) a inkubovali sa po dobu 1 hodiny pri 37 °C. Po premytí PBST sa do doštičiek pridalo 100 ul/jamku 3,3,5,5-tetrametylbenzidínu （TMB）） (Tiangen Biotech, Peking, Čína) a inkubovali sa 10 min. pri izbovej teplote. Potom, čo sa reakcia zastavila pomocou 2 MH, SO2, sa merala optická hustota (OD) pri 450 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek (INFINITE 200 PRO, TECAN, Manredorf, Švajčiarsko). Analýza sa uskutočnila pomocou softvéru GraphPad Prism 7.

3. Výsledky

3.1. Zodpovedajúci vzťah medzi väzbovými schopnosťami RBD meranými testom ELISA a neutralizáciou séra Hodnoty PRNT50 (neutralizačné titre pri 50-percentnej redukcii vírusových plakov) pre sedem očkovaných sér a 17 rekonvalescentných sér proti SARS-CoV-2 B.1 a zodpovedajúca OD450 nm nameraná pomocou ELISA so sérom riedeným 1:20 s použitím RBD SARS-CoV-2 B.1 ako potiahnutého antigénu sú uvedené v tabuľke S1. Zodpovedajúce výsledky sú znázornené na obrázku 1.

Ako je znázornené na obrázku 1A, B, pre vakcinované aj rekonvalescentné séra hodnoty PRNT50 vo všeobecnosti korelujú s hodnotami OD450 nm, čo naznačuje, že vyššie hodnoty OD450 nm zhruba zodpovedali vyšším hodnotám PRNT50, tj vyššej neutralizačnej aktivite. Prostredníctvom Pearsonovej korelačnej analýzy (ako je znázornené na obrázku 2C, D) bola evidentná silná korelácia medzi hodnotami PRNT50 a OD450 nm RBD so sérami pre skupinu v rekonvalescencii aj pre očkovanú skupinu. Preto meranie zmien v OD450 nm metódou ELISA by mohlo poskytnúť rýchlu indikáciu na vyhodnotenie zmien v neutralizačnej aktivite séra. Pretože variant Omicron nebol v našom laboratóriu dostupný, metóda ELISA sa použila na vyhodnotenie, či Omicron môže uniknúť protilátkam vyvolaným prirodzenými infekciami a očkovaním.

3.2. Väzbová schopnosť RBD zo SARS-CoV-2 B.1, delta variantu a omikrónového variantu na očkované séra, ako aj rekonvalescentné séra

Pomery S/N OD450 nm vakcinovaných a rekonvalescentných sér k pomerom kontrolných sér s negatívnymi protilátkami sa použili na vyjadrenie väzbovej schopnosti RBD na protilátky v sére. S znamená signál, čo je OD450 nm protilátkovo-pozitívneho séra a N znamená šum, čo je OD450nm protilátkovo-negatívneho séra. Výsledky 11 vakcinovaných sér sú znázornené na obrázku 2A, B. Pri oboch riedeniach (1:20 a 1:80) protilátky vo vakcinovaných sérach vykazovali malé zníženie (menej ako 20 percent) vo väzbe na variant Delta a prudké zníženie (nad 50 percent) vo väzbe na variant Omicron v porovnaní s variantom B.1, ako je uvedené v tabuľke S2. Podobné výsledky (obrázok 2C, D) boli tiež pozorované pre rekonvalescentné séra staršieho kmeňa B.1 (tabuľka S3)

4. Diskusie

V tejto štúdii bola schopnosť variantu SARS-CoV-2 Omicron uniknúť protilátkam indukovaným inaktivovanou vakcínou a prirodzenými infekciami skorého variantu hodnotená metódou ELISA s použitím zodpovedajúcich RBD ako poťahových antigénov. Hoci metóda ELISA sa nerovná klasickým neutralizačným testom založeným na bunkovej kultúre, ako sú PRNT, hodnoty OD450 nm vo všeobecnosti korelovali s PRNT50 séra (obrázok 1), čo je tiež pozorované v niektorých predchádzajúcich správach [10]. keďže sa ukázalo, že RBD vrcholového proteínu SARS-CoV-2, ktorý dokáže rozpoznať ACE-2 na hostiteľských bunkách, je hlavnou doménou viažucou receptor k hostiteľskej bunke a použila sa na návrh vakcín [12,13]. Existujú však určité obmedzenia pri použití väzbovej schopnosti RBD na odhadnutie neutralizačnej aktivity protilátky v sére. Iné fragmenty z RBD môžu vírus neutralizovať [14]. Okrem toho, mimo RBD (RBD Omicron obsahuje 15 mutácií v porovnaní s líniou B.1 s referenčným sekvenčným číslom NC_045512.2 na NCBI), variant Omicron má 15 mutácií a niekoľko miest delécie alebo inzercie, ktoré by mohli ovplyvniť konformáciu pôvodného RBD.

Ako je znázornené na obrázku 1 a tabuľke S1, existovali dve vzorky séra (Vac3 a Conv10), ktoré nevykazovali dobrú koreláciu medzi PRNT50 a zodpovedajúcimi hodnotami OD450 nm. Variant Omicron má celkovo 30 mutácií na spike proteíne a polovica mutácií sa vyskytla na RBD v porovnaní s predkovým variantom B.1, zatiaľ čo existuje osem mutácií pre variant Delta, z ktorých dve existujú na RBD [ 15]. Výsledky na obrázku 2 odhalili, že variant Delta, len s dvoma mutáciami na RBD, má obmedzený pokles väzbovej schopnosti RBD na očkované séra aj na rekonvalescentné séra, čo bolo v súlade s niektorými nedávnymi štúdiami [16,17]. . Omicron sa však účinne vyhýba protilátkam vyvolaným rodovými variantmi a inaktivovanou vakcínou s prudkým znížením väzbovej schopnosti jeho RBD.

Omicron sa rýchlo stáva dominantným a nahrádza variant Delta. Súčasné výsledky môžu naznačovať potrebu vyvinúť posilňovače využívajúce hrot Omicron, a nie hroty predkov alebo skorých variantov, na dlhodobé posilnenie imunity. Toto je obzvlášť dôležité, ak ide o indukciu adekvátnej imunitnej odpovede u starších ľudí alebo imunokompromitovaných osôb, ktoré majú tendenciu slabo reagovať na inaktivovanú vakcínu. Na záver, počiatočné výsledky ukázali, že Omicron sa môže účinne vyhýbať protilátkam vyvolaným rodovými variantmi a inaktivovanou vakcínou, pričom väzbová schopnosť jeho RBD sa zníži o viac ako 50 percent oveľa viac ako u variantu Delta.

Referencie

1. Jhun, H.; Park, HY; Hisham, Y.; Pieseň, CS; Kim, S. SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) Variant: Jedinečná mutácia T478K v motíve väzby receptora (RBM) génu Spike. Immune Netw. 2021, 21, e32. [CrossRef]

2. Gu, H.; Krishnan, P.; Ng, DYM; Chang, LDJ; Liu, GYZ; Cheng, SSM; Hui, MMY; ventilátor, MCY; Wan, JHL; Lau, LHK; a kol. Pravdepodobný prenos SARS-CoV-2 Omicron Variant v hoteli Quarantine, Hong Kong, Čína, november 2021. Vznik. Infikovať. Dis. 2022, 28, 460–462. [CrossRef] [PubMed]

3. Tatsi, EB; Filippatos, F.; Michos, A. SARS-CoV-2 varianty a účinnosť vakcín: Prehľad súčasných dôkazov. Epidemiol. Infikovať. 2021, 149, e237. [CrossRef] [PubMed]

4. Mohamed, K.; Rzymski, P.; islam, MS; Makuku, R.; Mushtaq, A.; Khan, A.; Ivanovská, M.; Makka, SA; Hashem, F.; Márquez, L.; a kol. Očkovanie proti COVID-19: Neznáme, výzvy a nádeje. J. Med. Virol. 2021. [CrossRef] [PubMed]

5. Yap, C.; Ali, A.; Prabhakar, A.; Prabhakar, A.; Pal, A.; Lim, YY; Kakodkar, P. Komplexný prehľad literatúry o vakcínach COVID{1}} a úlohe variantov SARS-CoV-2 v pandémii. Ther. Adv. Vakcíny Immunother. 2021, 9, 25151355211059791. [CrossRef] [PubMed]

6. Garcia-Beltran, WF; Denis, KJS; Hoelzemer, A.; Lam, EC; Nitido, AD; Sheehan, ML; Berrios, C.; Ofoman, O.; Chang, CC; Hauser, BM; a kol. Posilňovače vakcíny proti COVID-19 založené na mRNA vyvolávajú neutralizačnú imunitu proti variantu SARS-CoV-2 Omicron. Medrxiv 2021. [CrossRef]

7. Schmidt, F.; Muecksch, F.; Weisblum, Y.; Silva, JD; Bednarski, E.; Cho, A.; Wang, Z.; Gaebler, C.; Caskey, M.; Nussenzweig, MC; a kol. Vlastnosti plazmovej neutralizácie variantu SARS-CoV-2 Omicron. Medrxiv 2021. [CrossRef]

8. Mohammadi, M.; Shayestehpour, M.; Mirzaei, H. Vplyv hrotových mutovaných variantov SARS-CoV2 [Alfa, Beta, Gamma, Delta a Lambda] na účinnosť podjednotkových rekombinantných vakcín. Braz. J. Infect. Dis. 2021, 25, 101606. [CrossRef] [PubMed]

9. Lopez Bernal, J.; Andrews, N.; Gower, C.; Gallagher, E.; Simmons, R.; Thelwall, S.; Stowe, J.; Tessier, E.; Groves, N.; Cabrera, G.; a kol. Účinnosť vakcín Covid-19 proti variantu B.1.617.2 (Delta). N. Engl. J. Med. 2021, 385, 585–594. [CrossRef] [PubMed]

10. Edara, VV; Norwood, C.; Floyd, K.; Lai, L.; Davis-Gardner, ME; Hudson, WH; Mantus, G.; Nyhoff, LE; Adelman, MW; Fineman, R.; a kol. Infekciou a vakcínou indukovaná väzba protilátok a neutralizácia B.1.351 SARS-CoV-2 variantu. Bunkový hostiteľský mikrób 2021, 29, 516–521.e3. [CrossRef] [PubMed]

11. Lau, EHY; Tsang, OTY; Hui, DSC; Kwan, MYW; Chan, WH; Chiu, SS; Ko, RLW; Chan, KH; Cheng, SMS; Perera, R.; a kol. Neutralizujúce titre protilátok pri infekciách SARS-CoV-2. Nat. komun. 2021, 12, 63. [CrossRef] [PubMed]

12. Tian, ​​X.; Li, C.; Huang, A.; Xia, S.; Lu, S.; Shi, Z.; Lu, L.; Jiang, S.; Yang, Z.; Wu, Y.; a kol. Silná väzba nového spike proteínu koronavírusu z roku 2019 ľudskou monoklonálnou protilátkou špecifickou pre koronavírus SARS. Emerg. Mikróby infikujú. 2020, 9, 382–385. [CrossRef] [PubMed]

13. Huo, J.; Le Bas, A.; Ruza, RR; Duyvesteyn, HME; Mikolajek, H.; Malinauskas, T.; Tan, TK; Rijal, P.; Dumoux, M.; Oddelenie, PN; a kol. Neutralizujúce nanobody viažu SARS-CoV-2 vrchol RBD a blokujú interakciu s ACE2. Nat. Struct. Mol. Biol. 2020, 27, 846–854. [CrossRef] [PubMed]

14. Xie, X.; Liu, Y.; Liu, J.; Zhang, X.; Zou, J.; Fontes-Garfifias, ČR; Xia, H.; Swanson, KA; Cutler, M.; Cooper, D.; a kol. Neutralizácia delécie 69/70 hrotu SARS-CoV{3}}, variantov E484K a N501Y sérami vyvolanými vakcínou BNT162b2. Nat. Med. 2021, 27, 620–621. [CrossRef]

15. Kumar, S.; Thambiraja, TS; Karuppanan, K.; Subramaniam, G. Omicron a delta variant SARS-CoV-2: Komparatívna výpočtová štúdia Spike Proteinu. J. Med. Virol. 2021. [CrossRef] [PubMed]

16. Ai, J.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Lin, K.; Zhang, Y.; Wu, J.; Wan, Y.; Huang, Y.; Song, J.; Fu, Z.; a kol. Variant Omicron vykazoval nižšiu neutralizačnú citlivosť ako iné varianty SARS-CoV-2 na imunitné séra vyvolané vakcínami po booste. Emerg. Mikróby infikujú. 2022, 11, 337–343. [CrossRef]

17. Zhao, X.; Li, D.; Ruan, W.; Zhang, R.; Zheng, A.; Qiao, S.; Zheng, X.; Zhao, Y.; Chen, Z.; Dai, L.; a kol. Znížená neutralizácia séra na Omicron SARS-CoV-2 inaktivovanými aj proteínovými podjednotkovými vakcínami a rekonvalescentmi. BioRxiv 2021. [CrossRef]