Liečba kmeňovými bunkami pre mikrovaskulárne poškodenie spojené s ischemickou nefropatiou
Mar 21, 2022
Abstrakt:Ischemická nefropatia odráža progresívnu stratufunkcie obličiekv dôsledku aterosklerotickej okluzívnej choroby veľkých ciev. Nedávne štúdie naznačujú, že tento proces je charakterizovaný mikrovaskulárnou zriedkavosťou, zvýšenou hypoxiou tkaniva a aktiváciou zápalových procesov poškodenia tkaniva. Tento prehľad sumarizuje zdôvodnenie a aplikáciu funkčného MR zobrazovania na vyhodnotenie okysličovania tkaniva u ľudských subjektov, ktoré definuje limity renálnej adaptácie na zníženie krvného spoluobčana, rozvoj čoraz závažnejšej hypoxie tkaniva a nábor dráh zápalového poškodenia pri ischemickej nefropatii. Ľudské mezenchymálne stromálne/kmeňové bunky (MSC) sú schopné modifikovať angiogénne dráhy a imunitné reakcie, ale sila týchto účinkov sa líši medzi jednotlivcami a rôznymi klinickými charakteristikami vrátane veku a chronickýchochorenie obličieka úrovne hypoxie. Zhrňujeme nedávno dokončené prvé štúdie u ľudí aplikujúce intrarenálnu infúziu autológneho MSC odvodeného z tukového tkaniva u ľudských subjektov s ischemickou nefropatiou, ktoré demonštrujú vzostup krvi a zníženie hypoxie tkaniva v súlade s čiastočnou opravou mikrovaskulárneho poškodenia, a to aj bez obnovenia hlavný renálny arteriálny krvný kolega. Zápalové biomarkery v renálnej žile poststenózobličkypadol po infúzii MSC. Tieto zmeny súviseli s miernym, ale významným zvýšením dávky závislým od dávkyfunkcie obličiek.Tieto údaje podporujú úlohu autológneho MSC pri oprave mikrovaskulárneho poškodenia spojeného s hypoxiou tkaniva.
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL
ÚvodEpidemiologické štúdie identifikujú stratufunkcie obličiekako hlavný rizikový faktor kardiovaskulárnych príhod a smrti. Možnosti liečby mnohých foriem akútnych a chronickýchochorenie obličiek(CKD) sú obmedzené nad rámec opatrení na zníženie systémového krvného tlaku a zabránenie hyperfiltračnému poškodeniu. Nedávne štúdie na modeloch hlodavcov naznačujú pozoruhodný potenciál mezenchymálnych stromálnych / kmeňových buniek priaznivo ovplyvniťobličkyprežívanie aloštepu a zotavenie z akútpoškodenie obličiek(AKI) a niektoré formy chronickýchochorenie obličiekvrátane cukrovky a lupusovej nefritídy, ako už bolo uvedené [1]. Jedinečné vlastnostiobličkymikrocirkulácia spôsobujeobličkyobzvlášť náchylné na ischemické poškodenie. Ako sa tieto údaje premietajú do ľudských porúch, zostáva zle pochopené. Cieľom tohto prehľadu bolo zhrnúť počiatočné štúdie využívajúce autológne MSC u ľudí s ischemickou nefropatiou spôsobenou aterosklerotickým vaskulárnym ochorenímobličky
Kľúčové slová:ischemická nefropatia; stenóza renálnej artérie; okysličenie tkaniva; chronické ochorenie obličiek;funkcie obličiek
Renovaskulárne ochorenie a mikrovaskulárne poškodenieAterosklerotické renovaskulárne ochorenie veľkých ciev (ARVD) je vysoko rozšírené u staršej populácie v dôsledku stenózy renálnej artérie. Tento proces sa vyvíja postupne počas mnohých rokov a je urýchľovaný dyslipidémiou, cukrovkou, hypertenziou, fajčením a inými rizikovými faktormi aterosklerózy. Keď oklúzia lúmenu dosiahne „kritickú“ prahovú hodnotu, ktorá je zvyčajne identifikovaná ako viac ako 70–80-percentná oklúzia cievy, distálny perfúzny tlak a krvný tlak začnú merateľne klesať [2] (obrázok 1). Bohatá literatúra o hypertenzii spája stratu renálneho perfúzneho tlaku s aktiváciou viacerých presorických dráh, ktoré produkujú a urýchľujú renovaskulárnu hypertenziu, vrátane systému renín-angiotenzín-aldosterón [3]. Zatiaľ čo revaskularizácia hlavnej renálnej artérie bola predtým primárnym prostriedkom liečby ARVD a renovaskulárnej hypertenzie, pokroky v antihypertenzívnej liekovej terapii v posledných rokoch urobili z optimalizovanej medikamentóznej liečby základ manažmentu a často môžu úspešne dosiahnuť cieľové hodnoty krvného tlaku. Jedným z dôsledkov úspešnej medikamentóznej terapie bolo výrazné zníženie revaskularizačných procedúr. Výsledkom je, že mnohí jedinci sú v súčasnosti vystavení zníženému tlaku krvi v obličkách a distálnemu perfúznemu tlaku po dlhšiu dobu, niekedy aj mnoho rokov. Trvalá strata krvi kolegu a následná stratafunkcie obličiekbola označená ako "ischemická nefropatia".
Dôležité je, že ARVD veľkých ciev vedie k distálnym mikrovaskulárnym poruchám so stratou ciev stredného a malého priemeru a nakoniec k parenchymálnej fibróze [5,6] (obrázok 2). Strata integrity renálnej mikrovaskulatúry bola identifikovaná ako bežná konečná cesta pre inéobličkychoroby, vrátane diabetickej nefropatie, obezity a nefrosklerózy [7]. Zatiaľ čo ARVD sa spočiatku prejavuje ako hemodynamická porucha, ktorá sa niekedy môže zvrátiť obnovením priechodnosti ciev, následná mikrovaskulárna remodelácia a riedenie sa nakoniec nedajú reverzibilné. Dôsledným pozorovaním je, že ani endovaskulárna reparácia s arteriálnou dilatáciou a stentovaním často nedokáže obnoviť plnú úroveň prietoku krvi a obnoviť glomerulárnu filtráciu [8,9]. Neschopnosť zotaviť safunkcie obličiekpo revaskularizácii je spojená so zvodným dlhodobým prežívaním a zvýšenou potrebou renálnej substitučnej terapie, ako je dialýza a/alebo transplantácia [90]. Za posledných niekoľko desaťročí sa ARVD častejšie spájala s konečným štádiom renálneho ochorenia (ESRD) a bola výrazná
Ischemická nefropatia a okysličenie obličiekNa rozdiel od srdca alebo mozgu je celá oblička podstatne nadmerne parfumovaná v porovnaní s jej metabolickými energetickými požiadavkami [13]. Výsledkom je, že viaceré intrarenálne regulačné mechanizmy obmedzujú oxygenáciu v kortikálnych segmentoch (napr. v dôsledku arteriovenóznych skratov a lokálnych obmedzení difúzie kyslíka) a vedú k funkčným lokálnym gradientom. Arteriovenózny skrat znižuje napätie kyslíka v obličkovej kôre na úroveň 55-60 mm Hg, čo je zreteľný pokles oproti 85-90 mm Hg v normálnej renálnej artérii [14,15]. Normálne fungujúce obličky vykazujú výrazne odlišné regionálne úrovne okysličenia tkaniva v dôsledku obmedzeného postglomerulárneho prietoku krvi do drene a zvýšenej spotreby kyslíka spojenej s energeticky závislým tubulárnym transportom rozpustených látok [15,16]. Medulárna oxygenácia môže byť v normálnom funkčnom stave až 10-15 mm Hg, čo niektorí tvrdia, že je jedinečne náchylné na akútnepoškodenie obličiekkeď sú nefrotoxické inzulty superponované [17]. Uznanie týchto perfúznych charakteristík a vysoko prevládajúca ARVD viedlo niektorých autorov k tomu, aby označili stratu renálnej funkcie po stenotickej lézii za ischemickú nefropatiu18], pričom predpokladali, že strata prietoku krvi musí vyvolať hypoxické poškodenie tkaniva [19].
Funkčné hodnotenie okysličovania obličkového tkaniva u ľudských subjektov bolo možné len od zavedenia zobrazovania magnetickou rezonanciou závislou od hladiny kyslíka v krvi (BOLD MRI) [20] (obrázok 1). Táto metóda závisí od paramagnetickej vlastnosti deoxygenovaného hemoglobínu, ktorá modifikuje magnetické prestavenie po Fifieldovom prerušení, zatiaľ čo okysličený hemoglobín nemá aktívny magnetický moment [21]. Nameraná rýchlosť opätovného usporiadania (vyjadrená ako R2*) je teda priamym odrazom podielu deoxygenovaného hemoglobínu v špecifickej krvi obsahujúcej voxel. Normálne úrovne okysličenia v obličkách sa líšia v najstrmších segmentoch krivky disociácie hemoglobínu, čo z nej robí obzvlášť vhodný nástroj pre tento orgán. Štúdie využívajúce BOLD MRI zdôrazňujú potrebu dôkladnej štandardizácie súvisiacej s príjmom sodíka, používaním diuretík a požitím vody, pretože aj mierne zmeny v týchto parametroch majú merateľné účinky na lokálne úrovne deoxygenácie tkaniva. Tieto odrážajú zmeny v spotrebe kyslíka spojené s transportom rozpustenej látky a vody v medulárnych segmentoch [22–24]. Pri pozornej pozornosti venovanej týmto faktorom umožňuje BOLD zobrazenie BOLD identifikovať zmeny kortikálnej a medulárnej renálnej oxygenácie spojené s chronickýmiochorenie obličiek[25,26], vaskulárna okluzívna choroba, medikamentózna terapia, akútne poškodenie obličiek po injekcii kontrastnej látky a iné stavy [27,28].
CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL
Naša výskumná skupina použila systematické BOLD zobrazovanie obličiek u ľudí s ARVD a s esenciálnou hypertenziou, konkrétne na vyšetrenie úrovne ischémie spojenej s ARVD. Tieto štúdie tiež umožnili opakované merania kortikálnych aj medulárnych krvných kolegov pre každú obličku pomocou centrálneho venózneho kontrastného CT zobrazovania, ako už bolo opísané [29] Počiatočné štúdie na ľudských subjektoch s esenciálnou hypertenziou a ARVD sa uskutočnili za podmienok hospitalizovaného výskumného protokolu s fixným denným príjem sodíka a štandardizované podávanie liekov [30,31]. Celkovofunkcie obličiekbol mierne znížený s hornou hranicou sérového kreatinínu pod 2,5 mg/dl, čiastočne v dôsledku asymetrickej straty obličkového tkaniva spojenej s kompenzačnou hypertrofiou a hyperfiltráciou v kontralaterálnej obličke. Očakávali sme, že znížená krv by zväčšila merateľné hypoxické poškodenie, najmä v hlbokých medulárnych oblastiach, o ktorých je známe, že za normálnych podmienok majú zníženú oxygenáciu. Tieto štúdie trochu neočakávane stanovili pozoruhodný rozsah adaptácie so zachovanými gradientmi kyslíka v poststenóznych obličkách napriek podstatnému zníženiu krvných kolegov v kôre aj dreni, nižšiemu objemu parenchýmu obličiek a zníženej filtrácii rozpustenej látky. Kortikálne aj medulárne merania okysličenia boli dobre zachované napriek zníženiu krvi spoluobčanov až o 40 percent [31]. Čiastočne to odrážalo bohaté zásoby okysličovania v kortikálnych štruktúrach a zníženú spotrebu medulárneho kyslíka v dôsledku nižšej filtrácie a transportu rozpustenej látky. Tieto údaje poskytujú fyziologické potvrdenie odolnosti v rámci normálnej ľudskej obličky, čo umožňuje, aby sa vyvinul postupný hemodynamický kompromis so zachovanou štrukturálnou integritou napriek postupne progresívnej strate funkcie obličiek spojenej s ARVD. Tieto pozorovania boli potvrdené a rozšírené transjugulárnymi biopsiami poststenotických obličiek, ktoré preukázali pozoruhodne intaktné tubulárne a glomerulárne štruktúry, hoci merania glomerulárneho objemu potvrdzujú zníženú perfúziu [32]. Tieto výskumné údaje poskytujú fyziologický základ pre pozorovanie, že mnoho pacientov so stredne závažnou ARVD môže byť mnoho rokov liečených stabilným CKD bez progresívneho poškodenia [8,33].
Táto prispôsobivosť má však svoje limity. Keď post-stenotickí pacienti klesnú na závažnejšie úrovne, objem obličiek aj mikrovaskulárne štruktúry sa znížia. Štúdie využívajúce BOLD zobrazovanie potvrdzujú rozvoj patologickej tkanivovej hypoxie v obličkovej kôre a rozšírenej medulárnej deoxygenácie s kritickou stratou krvi a veľkosti obličkového parenchýmu [34]. V experimentálnych štúdiách, keď sú prísne obmedzenia zavedené po dlhšiu dobu, obnovenie krvi z veľkých ciev nasleduje endovaskulárna dilatácia a umiestnenie stentu nedokáže obnoviť mikrovaskulárne štruktúry a/alebo GFR [35]. Obrázok 2 ilustruje tento bod na prasacom modeli ARVD, ktorý sa vyvíja pomaly počas 6–12 týždňov podobným spôsobom ako u ľudí. Tieto pozorovania posilňujú zlyhanie konzistentnej obnovy GFR v štúdiách revaskularizácie u ľudí [8,36]. Celkovo tieto údaje naznačujú, že makrovaskulárne ochorenie a strata parenchýmovej renálnej perfúzie nakoniec vedú k riedeniu mikrovaskulárnych štruktúr v obličkách, ktoré znižujú funkciu obličiek, často ireverzibilne.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
Hypoxia tkaniva a zápalové poraneniaNedávne štúdie podčiarkujú ústrednú úlohu zápalových cytokínov a bunkovej infiltrácie pri experimentálnom aj ľudskom renálnom ochorení. Existuje podozrenie, že ARVD môže súvisieť s narušenou lokálnou a bunkovou imunitou ešte predtým, ako postihne obličkových krviniek [37]. Za normálnych podmienok nie sú v parenchýme obličiek viditeľné takmer žiadne identifikovateľné T bunky alebo makrofágy. Po akútnom poranení možno pozorovať určitý stupeň infiltrácie makrofágmi. Funkčné úlohy zápalových buniek podliehajú komplexným fenotypovým posunom (opísané ako variácie polarity M1 až M2), ktoré modifikujú bunkovú funkciu z fagocytárnej na reparatívnu štrukturálnu činnosť, vrátane tvorby nových mikrociev a tubulárnej regenerácie [38,39]. Mechanizmy, ktorými sa riadia funkcie T buniek a makrofágov, sú zložité a dynamické, pričom sa v rôznych podmienkach značne líšia. Rastúci počet dôkazov naznačuje, že prechod z akútneho poškodenia obličiek (AKI) na chronickéochorenie obličiek(CKD) odráža zápalové dráhy s fenotypovým smerom k fibróze a strate 5ubuleglomerulárnej štrukturálnej integrity [38,40]. Naše štúdie na ľudských subjektoch s ARVD podčiarkujú asociáciu aktívneho zápalového poškodenia paralelne s prehlbujúcou sa hypoxiou tkaniva v poststenotickej obličke. Štúdie tkanivových biopsií identifikujú infiltráciu buniek CD68 plus v periglomerulárnych a tubulárnych štruktúrach v poststenotických obličkách, ktoré nie sú prítomné v normálnych obličkách (biopsie odobraté pri implantácii od normálnych darcov obličiek) [32]. Keď stenóza progreduje do úplnej oklúzie, zápalové infiltráty aktivovaných T buniek a makrofágov sú široko prítomné v celej ischemickej obličke [41]. Odber krvi z renálnej žily z jednotlivých obličiek s ARVD demonštruje vysoké cirkulujúce hladiny zápalových [42,43] aj proangiogénnych cytokínov [4]. Dôležité je, že relatívne hladiny týchto markerov kvantitatívne súvisia so závažnosťou meranej tkanivovej hypoxie a so stratou GFR v jednotlivých obličkách [4]. Takéto merania posilňujú koncepciu, že ako mikrovaskulárna oklúzia postupuje s cieľom zväčšiť hypoxiu tkaniva v obličkách, vyvinú sa závažnejšie dráhy zápalového poškodenia, ktoré sú spojené so stratou funkcie parenchýmu a životaschopnosti.
Kmeňové bunky a dráhy poranenia v obličkáchRozpoznanie spojenia medzi vaskulárnou zriedkavosťou, zápalovými cestami a stratoufunkcie obličiekvyvoláva nasledujúcu otázku: "Môže modifikácia týchto dráh zrušiť rozvoj chronického ochorenia obličiek pri ARVD?" Skoré štúdie používajúce intrarenálne podávanie endotelových progenitorových buniek (EPC) na prasacom modeli naznačili, že indukovaná neovaskularizácia by podporila zlepšenú obnovu GFR [44]. Štúdie mezenchymálnych stromálnych/kmeňových buniek (MSC) tiež preukazujú funkčné charakteristiky s uvoľnenými parakrinnými mediátormi, ktoré podporujú angiogenézu za ischemických podmienok [45,46]. Je pozoruhodné, že tieto MSC sú za určitých podmienok tiež schopné modifikovať zápalové bunky v prospech reparatívnych fenotypov [40,47,48] (obrázok 3). Tieto funkčné vlastnosti MSC teda ponúkajú potenciál priaznivo formovať intrarenálnu odpoveď na zníženú krvnú aktivitu v prospech angiogenézy aj reparačných imunologických fenotypov. Počiatočné štúdie intrarenálneho podávania MSC na modeli ošípaných potvrdili, že tieto môžu byť podávané bez zjavnej toxicity a so stimuláciou angiogenézy v obličkovej kôre výrazne nad úrovňou pozorovanou pri obnovení priechodnosti ciev samotnej [49] (obrázok 2). Obnova funkcie obličiek pri experimentálnej renovaskulárnej okluzívnej chorobe sa pozorovala aj po infúzii MSC na modeloch ošípaných aj na hlodavcoch [50].
Naše štúdie na ľudských subjektoch sa uskutočnili s cieľom preskúmať túto otázku pomocou autológneho MSC odvodeného z tukového tkaniva. Získali sme povolenie na skúšanie nového lieku (IND 15082) na základe údajov o bezpečnosti u ošípaných a iných modelov na rozšírenie ľudských buniek pomocou správnej výrobnej praxe v laboratóriu Mayo Human Cell Therapy pod vedením Dr. Allena Dietza. Bunková expanzia využívala proprietárne hum a rastové médium odvodené od krvných doštičiek [51], testovanie bezpečnosti a kritériá uvoľňovania, ako už bolo opísané [52]. Autológne bunky sa použili na zabránenie možnej senzibilizácii HLA (ľudský lymfocytový antigén) a/alebo deštrukcii buniek súvisiacej s antigénnou nekompatibilitou. Početné štúdie naznačujú, že administrované bunky sú pri intravenóznom podaní široko distribuované, pričom väčšina je odstránená z obehu a veľká časť je lokalizovaná v pľúcnych vaskulárnych miestach [53]. Naše štúdie sme navrhli tak, aby vyžadovali priame intraarteriálne podanie do poststenotických obličiek, konkrétne na vyhodnotenie účinku lokálneho podávania a na posúdenie potenciálu lokálnej toxicity súvisiacej s mikrovaskulárnou oklúziou, ak by k nej došlo. Tieto štúdie boli navrhnuté tak, aby zhodnotili účinky intraarteriálne podávaného MSC na trhy toxicity v ranom období po podaní (týždenné a mesačné) a na renálnu hemodynamiku a funkciu, keď sa študovali tri mesiace po infúzii.
Funkčné charakteristiky ľudského MSC súvisiace s vekom a hypoxiouVyužitie autológnych MSC vyvoláva problém fenotypových a pravdepodobne aj epigenetických rozdielov medzi jednotlivcami na základe veku, pohlavia a iných vlastností. Štúdie využívajúce fenotypizáciu mRNA ukázali, že vek aj základná úroveň funkcie obličiek môžu modifikovať charakteristiky MSC [54]. Hypoxia – najmä hypoxické predkondicionovanie – sa uznáva, že modifikuje viaceré funkčné vlastnosti týchto typov buniek. Či hypoxické prostredie zobličkytkanivo ischemickej nefropatie modifikuje funkčné charakteristiky MSC môže ovplyvniť ich účinnosť in vivo. Skúmali sme zmeny vyvolané hypoxiou v MSC odvodené od normálnych darcov obličiek aj od jedincov s ARVD, ktorí sa líšia z hľadiska veku aj základnej úrovne funkcie obličiek. Tieto údaje demonštrujú kvalitatívne podobné reakcie na hypoxiu u zdravých darcov aj ARVD MSC so zvýšením rýchlosti rastu a expresie cytokínov, hoci počiatočné hladiny expresie cytokínov in vitro sa podstatne líšili. Štúdie ľudských buniek derivovaných z tukového tkaniva získaných pred a po podaní senolytických činidiel naznačujú, že profily markerov starnutia možno značne modifikovať [54,55]. Miera, do akej môžu režimy kondicionovania modifikovať in vivo aktivity týchto buniek, je dôležitou otázkou, ktorú treba ešte úplne definovať.
Účinky mezenchymálnych kmeňových buniek u ľudských subjektov s ischemickou nefropatiouPo získaní súhlasu Institutional Review Board od Mayo Clinic College of Medicine sa uskutočnili počiatočné (prvé u ľudí) štúdie pacientov s ARVD na vyhodnotenie účinkov troch dávok MSC (1 × 105, 2,5 × 105 a 5 x 105 buniek/kg) podaných do renálnej artérie poststenotickej obličky. Materiály a metódy. Každý pacient bol prijatý do oddelenia klinických skúšok a výskumu (CTRU) v nemocnici St. Mary's Hospital v Rochestri, MN. Diétny príjem sodíka sa udržiaval na 150 mEq/d denne. Deň 1 zahŕňal meranie krvi a moču na vylučovanie sodíka a GFR klírensom iotalamátu počas troch zberných intervalov počas hydratácie vodou a stanovenie močového mikroalbumínu, celkového proteínu a markerov poškodenia obličiek, ako bolo opísané vyššie. Deň 2 zahŕňal BOLD MRI s použitím axiálneho aj koronálneho zobrazenia pred a po podaní furosemidu (20 mg IV), ako je opísané [9,31]. 3. deň zahŕňal odber vzoriek krvi z obličkovej žily počas umiestňovania centrálneho venózneho katétra na stanovenie obličkovej krvi (RBF) pomocou multidetektorového CT (MDCT) a odber vzoriek obličkových žíl, ktoré schválila Mayo IRB. Po dokončení zobrazovacích štúdií sa do stenotickej artérie infúziou podal autológny MSC, ako je znázornené na obrázku 4.
In Viro Imaging StudiesBOLD MRI hodnotila kortikálnu a medulárnu oxygenáciu a tubulárnu funkciu. Získavanie MR obrazov so zvyšujúcimi sa časmi ozveny umožňuje vypočítať ich regresiu s logaritmom signálu [20], so sklonom (R2*=1/T2*) súvisiacim s hladinami deoxyhemoglobínu a tým s krvou a obsah kyslíka v tkanivách zistený pri 3T Akvizícia snímky zahŕňala tri transaxiálne rezy cez dve obličky vybrané pomocou prieskumnej akvizície (séria snímok v troch osiach tela vykonaná na výber rezov) v rámci 15 sA gradientovej multi-echo sekvencie získanej T2* vážené snímky obličiek na konci -expiration.TR (čas opakovania) bol 100 ms a TE (čas ozveny) bol od 7 do 566 ms s krokom 3,3 ms (celkovo 16 obrázkov za 15 s ). MDCT hodnotila bilaterálnu, jednu obličku, kortikálnu a medulárnu RBF, perfúziu (ml/min/g) a objemy, ako aj anatómiu a stupeň obštrukcie v stenotickej nal artérii. Získavanie obrazu zahŕňalo lokalizačné skenovanie na identifikáciu tomografických hladín obsahujúcich obličky; pre prietokové štúdie boli vybrané štyri stredné hilové hladiny. Obličky sa skenovali pri 20 x 1,2 kolimácii a 0 stolovom podávaní, pri rotácii gantry 0,5 a čiastočnej rekonštrukcii 0,36 s (jadro B36); 45 skenov (úrovne 6- mm) sa získalo 4 s po bolusovej injekcii (05/kg pri 10 ml/s, do 40 cc) iopamidolu do centrálneho venózneho katétra. Na analýzu údajov CT sa použil softvér na analýzu obrazu ANALYZE* (BiodynamicImaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) a MatLab. Oblasti záujmu boli vybrané z aorty, bilaterálneho kortexu a drene počas vaskulárnej fázy a krivky útlmu času sa analyzovali pomocou matematického modelu, ktorý sme vyvinuli [29. Vzorky krvi z obličkových žíl a dolnej jeny Caya sa odobrali do skúmaviek EDTA počas renálnej angiografie. Cytokíny a navádzacie faktory sa merali pomocou panelov Millipore Luminex pre cytokíny/chemokíny a angiogénne faktory [56].
Špecifická dávka pre každého pacienta bola podaná po protokolových štúdiách za štandardizovaných podmienok zhrnutých na obrázku 4. Či by takéto priame podanie viedlo k nepriaznivým účinkom charakterizovaným mikrovaskulárnou oklúziou, poranením tkaniva a/alebo systémovou reakciou, nebolo známe. Zmeny teploty, kompletný krvný obraz, hemoglobín, laktátdehydrogenáza a rýchlosť sedimentácie sa sledovali počas 12 týždňov v pravidelných intervaloch. Po troch mesiacoch sa títo jedinci vrátili na opakované merania krvného tlaku, individuálnych prietokov krvi obličkami a okysličovania obličiek pomocou BOLD MRI za štandardizovaných podmienok ako predtým. Dôležité je, že príjem sodíka a liekov sa udržiaval na úrovniach identických s hladinami počas štúdie pred liečbou. Podrobnosti tohto protokolu a jednotlivých meraní boli publikované [56].
Malo by sa zdôrazniť, že tieto štúdie fázy la sa uskutočnili bez endovaskulárnej dilatácie stenózy veľkých ciev. Ako sa očakávalo, stenózaobličky was characterized by reduced cortical and medullary volumes and substantially reduced renal blood flows They wer also characterized by more widespread evidence of tissue hypoxia (measured as the fraction of kidney tissue with R2* levels above 30 [28) as compared with the contralateral kidneys. Several notable changes were seen after three months. In particular, the level of cortical perfusion (blood flow/cubic mL of tissue) rose from 23(1.4-2.5)to2.6 (1.6-32) ml/mi/α tissue,p=003.No changes in the measured volumes were observed,but the cortical and total renal blood flows rose 15-20% in the stenotic kidney due to increased perfusion (from 164±99 to 190±126 mL/min,p=0.007). No such changes were observed in the patients undergoing the identical protocol studies without MSC administration [56,7[. Importantly, BOLD measurements after three months demonstrated reductions in the fractional hvypoxia>30.- pre stenotické obličky (obrázok). Tieto zistenia interpretujeme tak, že naznačujú, že mikrovaskulárne zmeny v poststenotickej obličke umožňujú zvýšenú kortikálnu cirkuláciu so sprievodnou úľavou od hypoxie tkaniva. Je dôležité poznamenať, že podobné zmeny v kortikálnej perfúzii sa pozorovali aj v kontralaterálnej obličke, ktorá nepodstúpila MSCinfúziu. Kortikálna perfúzia sa zvýšila, hoci neboli pozorované žiadne zmeny v R2*, čo už bolo nízke a odrážalo minimálnu zjavnú hypoxiu v nestenotizujúcich obličkách. Pozorovalo sa mierne zvýšenie medulárnej perfúzie a celkový prietok krvi obličkami sa zvýšil na podobnú mieru ako pri stenotickej obličke. Tieto pozorovania naznačujú, že systémové účinky, pravdepodobne z parakrinných mediátorov a/alebo presluchov obličiek, ovplyvnili kontralaterálneobličkyako aj stenotickú stránku. Pozorované zmeny v kontralaterálnej obličke sa opäť líšili po infúzii MSC od zmien v obličkách liečených len medikamentóznou terapiou alebo umiestnením endovaskulárneho stentu [57.
Všetky vyššie uvedené zmeny naznačujú, že intrarenálne podávanie MSC bolo spojené so zníženou hypoxiou tkaniva, pravdepodobne v dôsledku zlepšenej perfúzie tkaniva súvisiacej s mikrovaskulárnou opravou. Či to bolo výsledkom angiogenézy nových ciev alebo obnovenia priechodnosti z predtým kolabovaných ciev, sa nedá zistiť, hoci zvýšenie perfúzie dokonca aj v kontralaterálnych obličkách s takmer normálnym prietokom krvi by uprednostňovalo prvé.
Vzorky krvi z každej renálnej žily sa získali počas základnej aj trojmesačnej následnej štúdie. Pre mnohé z týchto obličiek boli stenotické hladiny angiogénnych biomarkerov (angiopoetín-2, vaskulárne endoteliálne rastové faktory A. a () zvýšené v porovnaní s nestenotickými obličkami a pri opätovnom meraní po troch mesiacoch klesli. Podobne aj renálne venózne markery zápalových cytokínov (neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), interferón-gama a tkanivový inhibítor metaloproteináz 2 (TIMP-2) boli vyššie v poststenotických obličkách a celkovo klesli, keď sa merania opakovali tri mesiace po MSC infúzie.
Klinické účinky podávania MSCModifikovala infúzia MSC funkciu obličiek a/alebo systémové hemodynamické účinky do významnej miery? Merania teploty, celkového krvného obrazu, rýchlosti sedimentácie erytrocytov a laktátdehydrogenázy počas prvých týždňov a mesiacov nepreukázali žiadnu klinicky evidentnú toxicitu súvisiacu s arteriálnou infúziou počtu buniek až do 5 × 105 buniek/kg, často približujúcich sa 50 miliónom buniek priamo do obličky. Značná pozornosť bola venovaná tomu, aby sa zabezpečilo, že liečba antihypertenzívami sa počas protokolových štúdií tejto skupiny pacientov nezmenila. Celkový systolický krvný tlak mierne klesol u pacientov liečených MSC (144 plus 11 až 136 plus 13 mm Hg, p=0,04), čo je zmena, ktorá odrážala najmä na dávke závislý pokles SBP v kohorte s najvyššou dávkou (140 plus 12 až 128 plus 8 mm Hg, p=0,005). Podobne zmeny v nameranej GFR boli mierne, ale zdalo sa, že sú závislé od dávky, pokiaľ skupina s najvyššou dávkou vzrástla z 57 plus 7 na 64 plus 9 ml/min, p=0,045 (obrázok 6). Skupiny s nižšou dávkou mali minimálne zmeny. Došlo k miernemu zníženiu vylučovania bielkovín močom, opäť najzreteľnejšie v skupine s najvyššou dávkou.
Mikrovaskulárna oprava spojená s terapiou MSC u ľudíTieto štúdie poskytujú predbežné, ale podstatné údaje konzistentné so zvýšenou mikrovaskulárnou perfúziou spojenou s podávaním autológneho MSC odvodeného z tukového tkaniva. Rozširujú sa na výsledky experimentálnych štúdií ľudských subjektov na modeloch ošípaných aj hlodavcov a podporujú potenciálnu úlohu bunkovej doplnkovej terapie pri klinickom ochorení. Predchádzajúce štúdie alogénnej MSC ako ochranného manévru proti akútnemu poškodeniu obličiek (AKI) boli nejednoznačné [58,59] a prospektívna štúdia pooperačnej AKI bola ukončená [60]. Naše štúdie sa zámerne zamerali na pomaly postupujúce dlhodobé mikrovaskulárne ochorenie mimo ARVD veľkých ciev, o ktorých je známe, že sú náchylné na vyvolanie CKD. Posilnili asociáciu tkanivovej hypoxie, ktorá sa vyvíja s pokročilým ochorením a aktiváciou angiogénneho aj zápalového poškodenia obličiek spojeného s progresívnou stratou GFR. Najdôležitejšie je, že poskytli údaje, ktoré podporujú úlohu MSC ako doplnku na zlepšenie lokálnej perfúzie tkaniva a zníženie zápalového poškodenia. Pri vysokých dávkach naše údaje podporujú potenciál týchto zmien mierne zvýšiť glomerulárnu filtráciu a zároveň znížiť arteriálny tlak a vylučovanie bielkovín močom. Či sa takéto účinky môžu rozšíriť aj na iné formy poškodenia obličiek spojené s mikrovaskulárnym poškodením, ako je diabetes [61] a/alebo nefroskleróza, je dôležitou otázkou, ktorá sa v súčasnosti aktívne skúma [62,63]. Tieto stavy nie sú nevyhnutne charakterizované podobnými cestami tkanivovej hypoxie, aké sú zaznamenané pri ťažkej ARVD.
VýstrahyNiekoľko dôležitých upozornení si zaslúži dôraz a ďalší výskum. Niektoré z nich sú zhrnuté v tabuľke 1. Náš výber autológnych buniek bol založený na obave, že zavedenie buniek s rôznymi alotypmi predstavuje riziko buď deštrukcie a/alebo alosenzitizácie, čo by mohlo zmiasť interpretáciu výsledkov a/alebo predstavovať riziko pre pacient. Niektorí autori tvrdia, že MSC sú neimunogénne, a preto sú relatívne chránené pred týmito obavami [63]. Z praktického hľadiska je použitie autológnych buniek časovo náročné s ohľadom na zber, expanziu a testovanie na podávanie. Tieto vlastnosti obmedzujú ich zohľadnenie pri liečbe súvisiacej s akútnymi procesmi. Azda najdôležitejšie je, že autológne bunky sú obzvlášť citlivé na charakteristiky darcu spojené s vekom, pohlavím, základným ochorením (napr. aterosklerotické ochorenie, diabetes) a dysfunkciou obličiek, ktoré všetky pravdepodobne modifikujú potenciálnu účinnosť MSC [54]. Zatiaľ čo mnohé vlastnosti MSC sú flexibilné a môžu byť modifikované podmienkami, za ktorých fungujú, je pravdepodobné, že interindividuálna variabilita bude hrať veľkú úlohu v ich skutočnom klinickom dopade.
Rozsah zmien v krvi spoluobčanov a GFR spojených s infúziou MSC v týchto štúdiách bol mierny. Klinický účinok pre každého jednotlivca do značnej miery závisí od základného stupňa renálnej dysfunkcie a od stupňa celkovej funkčnostiobličkyhmotnosť je ovplyvnená. Štúdie renálnej revaskularizácie identifikovali rad pozorovaných zmien, ktoré zahŕňajú určité zlepšenie oproti určitému zhoršeniu GFR po vaskulárnej manipulácii. Hoci sú tieto zmeny komplexné, ďalšie zhoršovanie GFR z akéhokoľvek dôvodu je spojené s poklesom dlhodobej renálnej prognózy a prežívania [10]. Či sa menšie zmeny GFR, BP a/alebo proteínu v moči pozorované v priaznivých odpovediach uvedených v tomto dokumente premietnu do zmeny prognózy, zostáva neznáme.
Ďalšia práca bude závisieť od definovania najúčinnejšej dávky MSC, ciest podávania a sledovania buniek. Je možné, že na udržanie mikrovaskulárnej integrity bude potrebné opakované dávkovanie, keďže trvácnosť týchto účinkov ešte nebola stanovená. Medzi najdôležitejšie prvky bude patriť integrácia bunkovej terapie s inými terapeutickými manévrami. V prípade ARVD bude nevyhnutné vyhodnotiť úlohu MSC ako doplnku k iným intervenciám, ako je revaskularizácia renálnej artérie, zavedenie vaskulogénnych cytokínov a/alebo ochrana mitochondrií. Niektorí autori navrhujú zavedenie angiogénnych cytokínov (ako je vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) a/alebo hepatocytové rastové faktory) do renálnej cirkulácie, ktorých mikrovaskulárne účinky sa zvyšujú, keď sú udržiavané na mieste so štruktúrnym biopolymérnym lešením [64,65]. Obidve tieto intervencie majú predbežné údaje na podporu alternatívnych ciest obnovy mikrovaskulárnych štruktúr a funkčnej integrity za špecifických podmienok [66,67].
Zhrnutie
Celkovo tieto štúdie demonštrujú mikrovaskulárnu zriedkavosť ako primárny mechanizmus spojený s progresívnym poranením u človekaobličkyspojené s ARVD. Identifikujú hranice adaptácie na zníženú krv a prechod k zjavnej hypoxii tkaniva spojenej so zápalovým poranením. Naše štúdie demonštrujú, že intrarenálna infúzia autológneho MSC odvodeného z tukového tkaniva je schopná zvýšiť perfúziu tkaniva a krvi kolegov bez odstránenia stenózy veľkých ciev, čo je v súlade s obnovením určitého stupňa mikrovaskulárnej funkcie. Tieto zmeny súviseli so zníženými zápalovými biomarkermi v obličkových žilách a s dávkou súvisiacimi prírastkami glomerulárnej filtrácie po troch mesiacoch. Zastávame názor, že terapia založená na bunkách bude pravdepodobne dôležitým doplnkovým zdrojom na obnovenie mikrovaskulárnej integrity pri ARVD aj iných obličkových ochoreniach spojených s vaskulárnou zriedkavosťou a zápalovým poškodením.
