Štrukturálna charakteristika a hodnotenie protizápalových a antityrozinázových aktivít polyfenolov z Melastoma Normale, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Zlúčenina 3 mala rovnaký molekulový vzorec ako zlúčenina 2, ako je určené jej údajmi HRESIMS. Porovnanie medzi údajmi NMR 3 a 2 (tabuľka 2) odhalilo, že metoxylová skupina na galloyl-C-4 v 2 sa posunula na galloyl-C-3' v 3. Toto bolo potvrdené koreláciami HMBC (Obrázok 2) metoxylových protónov (8y 3,88) a aromatického protónu (bH7,24) s galloyl-C-3'(6c 149,1) v 3 a chemické posuny metoxylovej skupiny, galloyl-C{ {24}}, galloyl-C-4 a galloyl-C-3', ktoré sa posunuli z bc60.8, 151.5, 141.3 a 146.5 v 2tobc56.7, 146.6, 140.7 a 149.1 na 3, v tomto poradí bavlnený efekt pri 237 nm a negatívny pri 262 nm v CD spektre indikovali (S) konfiguráciu HHDP skupiny pre 3 [24]. Konfigurácia cukrovej skupiny bola odvodená z kopulačnej konštanty (=8.5 Hz) anomérneho protónu glukozylovej skupiny. Kyslá hydrolýza 3 s 1 M HCl poskytla D-glukózu, čo bolo potvrdené TLC a GC analýzami. Zlúčenina 3 bola teda identifikovaná ako 1-O-galloyl-6-0-(3-metoxygalloyl)-2,3-0-(S)-hexahydroxydifenoyl{{ 66}}D-glukóza.

Molekulový vzorec 4 bol odvodený z jeho HRESIMS spektra (m/z 783,1032, [MH]-) ako C35H28021. Jeho molekulová hmotnosť bola o 16 hmotnostných jednotiek nižšia ako molekulová hmotnosť 3, čo možno pripísať neprítomnosti hydroxylu a prítomnosti aromatického protónu (6H6,87) na vanilloyl-C-5' v 4 (tabuľka 2) . Toto bolo potvrdené prítomnosťou 1,2,4-trisubstituovanej aromatickej skupiny （μ7,60 （dd, J=8.3,1,8 Hz）,6,87 （d, J=8 0,3 Hz） a 7,57 （d, J=1,8 Hz）） a zmena chemického posunu galloyl-C-5' pri δc 145,8 v 3 na vanilloyl-C-5 ' pri bc 115,9 v 4. Korelácie metoxylových protónov (6H 3,90) a aromatického protónu (H 6,87) s vanilloyl-C-3' v HMBC spektre (obrázok 2) ďalej potvrdili aromatický protón (H 6,87) pri vanilloyl-C-5'. Ukázalo sa, že atropoizoméria HHDP je S konfiguráciou objavením sa pozitívnych a negatívnych efektov bavlny pri 239 nm a 263 nm [24]. Interakčné konštanty anomérneho protónu v 4 boli 8,5 Hz, čo pripomína -anomerickú konfiguráciu. Kyslá hydrolýza odhalila, že 4 má rovnaké cukrové jednotky ako 3. Zlúčenina 4 bola teda identifikovaná ako 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O- (S)-hexahydroxydifenoyl- -D-glukóza.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

2.2. Testy protizápalovej aktivity

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50 uM. Uvádza sa, že známe flavonoly kaempferol(7)[26[, kvercetín (10)[27l a myricetín-3-O- -L-ramnopyranozid(12)28 majú protizápalovú aktivitu, ale kaempferol -3-ramnozid (8) [26] a kvercetín-3-O- -L-ramnozid (11)[29] nemajú protizápalovú aktivitu. Z experimentálnych výsledkov a literárnych údajov vyplýva, že flavonoidy v titulnej rastline majú lepšiu protizápalovú aktivitu ako ellagitaníny, môže ísť o účinnú látku zodpovedajúcu protizápalovému účinku tejto rastliny.

2.3. Testy inhibičnej aktivity tyrozinázy

Všetky zlúčeniny sa skúmali na potenciálnu inhibičnú aktivitu tyrozinázy. Ako je uvedené v tabuľke 3, nové zlúčeniny 2-4 vykazovali miernu aktivitu inhibície tyrozinázy. Nová zlúčenina 1 vykazovala slabú inhibičnú aktivitu tyrozinázy. Kvercetín (10)[30] má významnú tyrozinázovú inhibičnú aktivitu a jeho antityrozinázová aktivita je lepšia ako kvercetín-3-OwL-ramnozid(11)[26] a kaempferol (7) [26], čo je konzistentné s údajmi z literatúry. To naznačuje, že 3'- a 4/-hydroxy skupiny na kruhu B a 3-hydroxy skupiny na kruhu C vo flavonoloch boli rozhodujúce pre ich aktivity. Antityrozinázová aktivita kaempferolu (7)[26] je lepšia ako kaempferol-3-ramnozidu (8)[26]a zlúčeniny 8 a 12 [31] nemajú žiadnu významnú antityrozinázovú aktivitu, čo ďalej podporuje vyššie uvedené vzťahy medzi štruktúrou a činnosťou.

3. Experimentálne 3.1.Materiály

Korene M.normale boli zozbierané z mesta Yanshan, mesto Guilin, provincia Guangxi, v septembri 2018 a overené profesorom Yusong Huangom (Botanický inštitút Guangxi). Vzorka poukážky (20180912) bola uložená v kľúčovom laboratóriu pre výskum a využitie funkčných fytochemikálií v Guangxi Inštitúte botaniky v Číne.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

3.2. Všeobecné experimentálne postupy

Optické rotácie sa merali pomocou ADP440 plus polarimetra （λ 589 nm, dĺžka dráhy 1.0 cm). NMR spektrá boli získané na spektrometri Bruker Advance 50}0 (Bruker Biospin AG, Fällanden, Švajčiarsko) a piky zvyškového rozpúšťadla boli použité ako referencie. Vazbové konštanty a chemické posuny boli uvedené v Hz a na stupnici δ（ppm）v tomto poradí. Údaje ESIMS a HIRESIMS sa zaznamenali na hmotnostnom spektrometri BRUKER HCT a spektrometri LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japonsko). GC sa uskutočnila na systéme Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, USA) s 0,32 mm id x 25 ml-Chirasil-Val kolóna. Analytická HPLC sa uskutočnila na systéme Shimadzu LC-2030C HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) s použitím kolóny Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um) 4,6 id x 250 mm. semipreparatívna HPLC sa uskutočnila na systéme Shimadzu LC-20AT HPLC s použitím 20,0 id x 250 mm kolóny Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) pri prietokovej rýchlosti 4 ml/min. Stĺpcová chromatografia (CC) sa uskutočnila s použitím Sephadexu LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Švédsko）, silikagélová kolóna (200-300 sieť, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, Čína), MCI gél CHP 20P (75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japonsko) a stĺpce Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Nemecko).

3.3. Extrakcia a separácia

Na vzduchu vysušené, práškové korene (10 kg) M. normale sa extrahovali 8{{20}}-percentným vodným acetónom (3x7 dní) pri teplote miestnosti a každý extrakt sa prefiltroval. Filtráty sa vysušili za zníženého tlaku, čím sa získal surový extrakt (0,6 kg). Extrakt sa suspendoval v H2O (1 1) a postupne sa rozdelil medzi petroléter (3 x 2 1), EtOAc (3 x 2 1). EtOAc extrakt (8 {{40}}} g) sa rozdelil do desiatich frakcií ( Fr.1-10)na silikagéli CC (8 id × 20 cm) elúciou s gradientom CH2Cl-MeOH (100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4 (32 g) bol nanesený na MCI gélovú kolónu (6i.d.x20 cm) a eluovaný gradientom MeOH-H,O（0~100-100~0,v/ř）do poskytnúť osemnásť podfrakcií（Fr4-1-4-18）. Separácia podfrakcie Fr4-14(3,0 g) sa uskutočnila pomocou ďalšej silikagélovej kolóny (3i.d.x20 cm) eluovaním s gradientom CH2CI{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) a Sephadex LH-20 CCelúcia s CH2CI2-MeOH (1:1, obj./obj.), čím sa získa zlúčenina 7 (11,3 mg 8 (10,6 mg), 9 (9,3 mg), 10 (20,6 mg), 11 (7,6 mg) a 12 (6,2 mg). Fr 6 (4,2 g) sa naniesol na kolónu ODS C18 a eluoval sa MeOH-H20 (20:80-80:20), čím sa získalo 9 subfrakcií (Fr 6-1-6-9). Ďalšou separáciou subfrakcie Fr 6-4 (1,2 g) použitím Sephadexu LH-20 CC (elúcia MeOH-H20,10:90-100:0) sa získali zlúčeniny 1(9,6 mg),5( 7,2 mg a 6 (7,3 mg). Zlúčeniny 2 (tR 130,5 min, 5,2 mg), 3 (tR 146,8 min, 9,6 mg) a 4 (tR 177,2 min, 15,3 mg) sa získali z Fr7 (2,5 g) semipreparatívnou HPLC elúciou s gradientom MeOH-H20( 20:{125}}:60, / u, 0-250 min).

3.4. Spektroskopické údaje

Whisky tanín C (1): hnedý amorfný prášok; [ ]-12,6 stupňa (c= 0,16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203(2,02）,276(1,19）); CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1H a 13C NMR údaje, pozri tabuľku 1;HRESIMSm/z:[MH]{{24} },1240 (vypočítané pre C4sH33027-, 1005,1215). 1-O-(4-metoxygalloyl)-6-O-galloyl-2,3-0-(S)-hexahydroxydifenoyl- -D-glukóza( 2): Hnedý amorfný prášok amorfný prášok; 【 】5-5.5 stupňa （c=0.17, MeOH）; UV (MeOH) 入max nm (log e) ~203 (2,52), 275 (2,01); CD（MeOH）λmax（△8）264（-8,0）,238（30,6）,218）1,3）.'H a13C-NMR dáta, pozri tabuľku 2; HRESIMS m/z: 799,0983[MH]-(vypočítané pre C3sH2022-, 799,099).

{{0}}O-galloyl-6-0-(3-metoxygalloyl)-2,3-0-(S)-hexahydroxydifenol-6- D-glukóza(3); Hnedý amorfný prášok;【 】7-33.5 stupňa （c=0.12, MeOH）; UV (MeOH) max nm (log e) -203 (2,40), 273 (1,68); CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR údaje, pozri tabuľku 2;HRESIMS m.106:7 [MH]-(vypočítané pre C35H2022-, 799,0999). 1-O-galloyl-6-O-vaniloyl-2,3-0-(S)-hexahydroxydifenoyl- -D-glukóza (4): hnedý amorfný prášok; 【 】7-20.6 stupňa （c=0.15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm(log e）∶203）(2,42）), 278（1.86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12,1）,239（42,5）, 219（0,9）.'H a 13CNMR údaje, pozri tabuľku 2;HRESIMS m/z: 10323MHz (vypočítané pre C35H27021-, 783,1050).

3.5. Kyslá hydrolýza 2-4

Na zlúčeninu 2 (2 mg) sa pôsobilo 1 M HCI (5 ml) pri 80 stupňoch počas 4 hodín a potom sa extrahovala etylacetátom (3x5 ml). Vodná fáza sa vysušila pod prúdom N2, čím sa vytvoril neutrálny zvyšok, ktorý sa analyzoval pomocou TLC (Si02) s EtOAc-pyridín-EtOH-H,0 (7:1:1:2) ako rozpúšťadlovým systémom. Hodnota R neutrálneho zvyšku bola rovnaká ako hodnota autentickej D-glukózy, čo naznačuje, že cukrovou zložkou 2 bola glukóza. Neutrálny zvyšok a 5 mg hydrochloridu metylesteru L-cysteínu sa postupne rozpustili v 3 ml bezvodého pyridínu a zahrievali na 80 stupňov počas 1 hodiny. Po odstránení rozpúšťadla odparením za zníženého tlaku sa reakčná zmes následne nechala reagovať s 0,6 ml N-trimetylsilylimidazolu pri 80 stupňoch počas 1 hodiny. Reakčná zmes sa rozdelila medzi n-hexán a H20 a potom sa n-hexánová vrstva analyzovala pomocou GC prístroja. Teploty injektora a detektora boli nastavené na 250 stupňov a 280 stupňov. Počiatočná teplota kolóny sa udržiavala na 160 °C počas 1 minúty, potom sa zvýšila na 280 °C pri 5 °C/min a udržiavala sa počas 10 minút. Autentická D-glukóza a autentická L-glukóza boli silylované a analyzované rovnakým spôsobom a ich retenčné časy boli 19,09 a 19,25 min. Výsledky GC analýzy ukázali, že cukrovou zložkou 2 bola D-glukóza (t 19,1 min). Cukrové zložky 3 a 4 boli stanovené použitím rovnakého postupu.

3.6. Protizápalová aktivita

3.6.1. Produkcia NO pomocou buniek RAW 264.7 stimulovaných LPS

Bunky RAW 264.7 sa kultivovali v DMEM doplnenom 10 percentami FBS pri 37 stupňoch vo zvlhčenej atmosfére s 5 percentami CO2 počas 24 hodín. Bunky v 24-jamkovej doštičke (5 x 104 buniek/jamka) sa ošetrili 200 ng/ml LPS a testovanými zlúčeninami. Po 22 hodinách sa médium zhromaždilo a merala sa hladina dusitanov pomocou systému Griess Reagent System (Promega, Madison, WI, USA).

3.6.2. Životaschopnosť buniek

MTT test sa uskutočnil na meranie cytotoxicity testovaných vzoriek na RAW264.7 bunkovej línii. Bunky, ktoré boli v logaritmickej rastovej fáze, sa naočkovali na 96-jamkovú doštičku v hustote 5×10 plus -6×10* buniek/jamku a inkubovali sa pri 37 stupňoch s 5 % CO2 počas 24 h. Ďalej boli bunky ošetrené 100 ul kultivačného média pri rôznych koncentráciách testovaných vzoriek počas 24 hodín. Médium sa odstránilo a do každej jamky sa pridalo 100 ul média bez FBS obsahujúceho MTT (1 mg/ml). Po inkubácii v inkubátore počas 4 hodín sa supernatant odstránil a do každej jamky sa pridalo 100 ul DMSO, aby sa rozpustil formazan. Absorbancia sa merala pri 570 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek.

3.7. Anti-Ty/rozinázová aktivita

Anti-tyrozinázové aktivity izolátov sa skúmali podľa postupu opísaného v Aoki et al. s miernymi úpravami [21]. L-DOPA a kyselina kojová sa použili ako substrát a pozitívna kontrola. Roztok L-DOPA v koncentrácii 5.0 mM, hubová tyrozináza v koncentrácii 100 U/ml, ako aj vzorky v rôznych koncentráciách boli pripravené vo fosfátovom pufri (pH 6,8）,20 μl roztoku vzorky a 10 μl roztoku hubovej tyrozinázy sa zmiešalo a predinkubovalo pri 37 stupňoch počas 10 minút, potom sa pridalo 40 ul roztoku L-DOPA a inkubovalo sa pri 37 stupňoch 5 minút. Reakčný systém experimentu s anti-tyrozinázovou aktivitou je uvedený v tabuľke 4. Absorbancia sa merala pri 475 nm s použitím multimódovej čítačky mikrodoštičiek Spark 10M (Tecan Trading AG, Zurich, Švajčiarsko). Všetky testy sa opakovali trikrát a zakaždým v troch vyhotoveniach. Percento inhibície aktivity tyrozinázy sa vypočítalo pomocou nasledujúceho vzorca:

kde T predstavuje absorbanciu so vzorkou a tyrozinázou; To predstavuje absorbanciu so vzorkou, ale bez tyrozinázy; C predstavuje absorbanciu s tyrozinázou, ale bez vzorky; Co predstavuje absorbanciu bez tyrozinázy a vzorky.

4. Závery

Cieľom štúdie je preskúmať viac protizápalových a enzýmových inhibičných aktivít polyfenolov z koreňov M.normale na základe našich predchádzajúcich prác [20]. Ako sa očakávalo, dvanásť polyfenolov sa získalo z továrne na dlaždice po prvýkrát a zlúčenina 1-4 bola novým ellagitanínom. Úspešná izolácia a identifikácia štruktúry ellagitanínu poskytujú materiály na skríning protizápalových liečiv a inhibítorov enzýmov a tiež prispievajú k rozvoju a využitiu M.normale. Ellagitaníny 1-4 nemajú žiadne významné inhibičné účinky na tyrozinázu a protizápalové účinky, takže je menej pravdepodobné, že budú potenciálnym protizápalovým liekom alebo inhibítorom enzýmov. Našťastie majú nové účinky, napríklad proti obezite [6,7]. Flavonoidy majú lepšie protizápalové a inhibičné enzýmové aktivity ako ellagitaníny v koreňoch M. normale a je pravdepodobnejšie, že sú protizápalové a antienzýmové inhibítory. Štúdium vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou je užitočné pri hľadaní nových protizápalových liečiv a inhibítorov enzýmov.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules