Štrukturálna charakterizácia polysacharidu cistanche Deserticola a jeho ochranný účinok na HK -2 poranenie buniek vyvolané vysokou glukózou
Jan 23, 2025
1.2.5.8 Detekcia potenciálu mitochondriálnej membrány
HK -2 bunky boli naočkované v 6- do platničiek a kultivovaných. Po zodpovedajúcej stimulácii sa aspirovalo kultivačné médium v 6- do platniek a do skupiny sa pridala silná pozitívna kontrolná skupina (POS) v rámci „1.2.5.6“. Opláchnite raz PBS, pridajte 1 ml bunkového kultivačného média a 1 ml JC -1 Farbovacie pracovné roztoky sa dôkladne zmiešali a umiestnili sa do inkubátora buniek v tme počas 20 minút. Bunky boli dvakrát premyté JC -1 farbiacim pufrom (1 ×) a obrázky sa zbierali pomocou fluorescenčného mikroskopu.
Výnosy z cistanche
1.2.5.9 HOECHST33258 Metóda na detekciu bunkovej apoptózy
Bunkové sklíčka sa umiestnili do 6- do dosiek a HK -2 bunky v logaritmickej rastnej fáze boli nasadené do 6- doštičiek pri hustote buniek 1 x 105 buniek/jamky. Po zodpovedajúcich liekových zásahoch sa na farbenie použila farbenie HOECHST33258. Bola detegovaná bunková apoptóza a obrázky sa zbierali pomocou fluorescenčného mikroskopu.
1.2.5.10 Western blotting na detekciu
Expresia proteínov súvisiacich so signálnou dráhou TLR4/NF-KB sa analyzovala zoskupením a ošetrením buniek podľa metódy podľa „1.2.5.6“. Potom sa celkový proteín v bunkách extrahoval podľa pokynov súpravy na extrakciu proteínov. Kvantifikácia proteínu sa uskutočňovala s použitím metódy kvantifikácie proteínu kyseliny bicinchonínovej (BCA) a proteín bol denaturovaný a uložený v chladničke stupňa -20.
10% sodný dodecylsulfát polyakrylamidový gélová elektroforéza (SDS-PAGE), prenos membrány polyvinylidén fluorid (PVDF), vložte membránu do TRIS-obsahujúceho TWEEN {{3}
Bunky boli inkubované v TRIS pufrovanom soľnom roztoku s tween -20 (TBST) a blokované pri teplote miestnosti. Primárne protilátky proti TLR4, NF-KB P65, P-NF-KB P65 a-aktín boli použitédetegovať obličkové tkanivo(Protilátky boli zriedené do roztoku TBST pri objemovom pomere 1: 2000) pri 4 stupňoch cez noc. Tbst
Membrána sa zriedila sekundárnou protilátkou (roztok protilátky a TBST sa zriedili pri objemovom pomere 1: 2000) a inkubovali sa pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Po premytí membrány trikrát TBST sa na detekciu pridalo ECL luminiscenčné činidlo a expresia proteínu sa detegovala gélom. Softvér Image J sa použil na analýzu hodnoty proteínovej šedej, s vnútorným odkazom.
1.3 spracovanie údajov
SPSS 23. 0 a softvér GraphPad Prism 6.01 sa použili na analýzu údajov. Test Shapiro-Wilk sa použil na testovanie normality údajov o vzorke a na testovanie homogenity rozptylu údajov o vzorke sa použil test hnedej alebo Bartlettovej skúšky. Údaje o meraní s normálnou distribúciou a homogenitou rozptylu boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. (x ± S) Označuje opis, na testovanie sa použila jednosmerná ANOVA a Dunnetova metóda sa použila na párové porovnanie, ak je štatisticky významná.
Na post hoc párové porovnania nerovnakých odchýlok sa použila metóda Dunnett T3, s p <0.
2 výsledky a analýza
2.1 Stanovenie celkového obsahu cukru, kyseliny urónovej a bielkovín v CDP
Lineárna regresná rovnica obsahu polysacharidu bola: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Experiment ukázal, že medzi 7 a 70 ug/ml existoval dobrý lineárny vzťah medzi štandardnou koncentráciou glukózy (X) a hodnotou absorbancie (Y). Vypočítané percento obsahu polysacharidu vo vzorke je: 81,02%.
Lineárna regresná rovnica štandardnej kyseliny urónov je: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Experiment ukázal, že medzi 20 a 100 ug/ml existoval dobrý lineárny vzťah medzi štandardnou koncentráciou kyseliny urónovej (x) a hodnotou absorbancie (Y). Obsah kyseliny urónovej vo vzorke je: 4,43%.
Štandardná proteínová lineárna regresná rovnica je: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Experiment ukázal, že medzi 20 a 1 00 µg/ml existoval dobrý lineárny vzťah medzi štandardnou koncentráciou proteínov (x) a hodnotou absorbancie (Y). Obsah bielkovín vo vzorke je: 4,00%.
2.2 Distribúcia molekulovej hmotnosti CDP
Molekulová hmotnosť CDP bola stanovená vysoko výkonnou detekciou tandemovej stĺpcovej chromatografie gélu. S RT AS (X) a LGMP AS (Y) bola rovnica kalibračnej krivky LGMP-RT vypočítaná ako: y=-0. 1951x + 11. 661, R²=0. 9956; RT je (x), lgmw je (y), kalibračná rovnica LGMW-RT je: y=-0. 1973x + 11. 738, R²=0. 9956; Rt je (x), lgmn je (y), kalibračná krivka LGMN-RT Rovnica je: y=-0. 1964x + 11. 7, R²=0. 9955; Na základe štandardnej krivky sa na výpočet molekulovej hmotnosti každej vzorky získa vzor výpočtu. Spektrum molekulovej hmotnosti vzorky je nasledujúce a výsledky výpočtu sú uvedené v tabuľke 2. Výsledky ukázali, že CDP mali viac elučných píkov a molekulová hmotnosť polysacharidov bola distribuovaná hlavne medzi 3 a 8 kDa, čo bola heterogénna molekulová heteropolysabacharidová hmotnosť. Ako je znázornené na obrázku 1.
2,3 zloženie monosacharidu CDP
CDP sa analyzovali iónovou chromatografiou a chromatogram je znázornený na obrázku 2. Výsledky ukázali, že v porovnaní s retenčným časom 16 monosacharidových štandardov sa v CDP zistilo 5 monosacharidov. Porovnaním spektier s spektrami s monosacharidovými štandardmi boli CDP zložené hlavne z glukózy, galaktózy, ramózy, manózy a sacharózy. , arabinóza. Molárny pomer je 0. 734 0 5: 0. 0 5381: {0. 0502: 0,0255: 0,0178. Z molárneho pomeru je zrejmé, že CDP sú zložené hlavne z glukózy, galaktózy a ramózy. Medzi nimi predstavuje glukóza 73,405%, galaktóza predstavuje 5,381%a Rhamnose predstavuje 5,02%.
POZNÁMKA: Man.Mannose, GLC N.Glukosamín Hydrochlorid, RHA.RHRAMNOSE, GLC-UA.Glucurónová kyselina, gal-ua.galakturónová kyselina, gal N.Galaktosamín hydrochlorid, glc.glukóza, gal.galaktóza, xyl.xylóza, ara. arabinóza, fuc.fukóza.
2,4 CDP Fourierovi infračervená analýza
Vrchol blízko 3246 cm -1 je spôsobený OH napínajúcou vibráciou hydroxylovej skupiny, absorpčným vrcholom pri 2900 cm {{} {9} {9} {10 {10} {10} {10} {10} {10} {10} {10} {10} {10} {10} {10 {} s názvom CDP, CDP, CDP, ITATIC THE THE kyseliny urónovej, 1374,31 cm -1: Tento absorpčný pík môže súvisieť s deformačnými vibráciami CH väzieb, najmä v skupinách metylu (-ch3) alebo metylénových (-h 2-) skupín polysacharidov. Absorpčný vrchol pri 1018,38 cm -1 môže súvisieť s napínajúcimi vibráciami väzby Co, ktorá sa bežne vyskytuje v éterových väzbách alebo esterových väzbách polysacharidov. Tri slabé absorpčné píky v rozsahu 1200-1000 cm -1 označujú prítomnosť pyranózy v CDP. Absorpčné vrcholy pri 870 a 930 cm -1 označujú, že v CDP môžu existovať glykozidné väzby -type. Pozri obrázok 3.
2.5 toxické účinky CDP na normálne HK -2
V porovnaní s CON, 24 hodín po podaní, životaschopnosť buniek sa začala významne znižovať po dosiahnutí koncentrácie CDPS 1000 ug/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.
3 Diskusia a záver
Polysacharidysú polyméry s vysokou molekulovou hmotnosťou zložené z viac ako 10 monosacharidov. Uvádza sa, že polysacharidy majúimunomodulačné, antioxidačné, protizápalové a hypoglykemické účinky[15]. Ako jedna z hlavných farmakologicky aktívnych látok v Cistanche Deserticola má CDP významnú liečivú hodnotu. Táto štúdia predbežne charakterizovala štruktúru CDP a zistila, že môžu zlepšiť poškodenie buniek HK -2 vyvolaných prostredím s vysokým obsahom cukru.
Komplexná štruktúra polysacharidov úzko súvisí s ich biologickou aktivitou, medzi ktorou sú typ a podiel monosacharidov, relatívna molekulárna hmotnosť polysacharidov a typ glykozidných väzieb sú kľúčovými ovplyvňujúcimi faktormi [16]. Mierna relatívna molekulárna hmota poskytuje polysacharidy aktívnejšie miesta a môže vykazovať silnejšiu biologickú aktivitu.
Veľká molekulová hmotnosť však zvýši transmembránovú rezistenciu, bráni absorpcii polysacharidu a ovplyvňuje aktivitu. Naopak, polysacharidy s malou molekulovou hmotnosťou nemusia byť schopné tvoriť účinné aktívne štruktúry, čo vedie k zníženej aktivite [17]. Pri skúmaní biologickej aktivity polysacharidov je potrebné komplexne zvážiť monosacharidové zloženie, relatívnu molekulárnu hmotnosť a typ glykozidnej väzby [18]. V tejto štúdii iónová chromatografia určila, že CDP boli zložené hlavne z glukózy, galaktózy a ramózy, čo je v súlade so správou Xu et al. [19]. Priemerné molekulové hmotnosti CDP merané vysoko výkonnou chromatografiou kvapalného gélu boli 3444, 4198 a 8031 kDa. Molekulové hmotnosti troch cistanchových polysacharidov zo štyroch liečivých materiálov typu cistanche merané Yangom et al. [20] boli podobné. CDP môžu obsahovať glykozidické väzby typu typu a môžu obsahovať -glukózu alebo -manózu. Polysacharidy zložené z -glukózy alebo -Manózy sú ľahšie rozpoznávané receptorom 4 (TLR4) alebo TLR2 [21].
DN je jednou z najzávažnejších mikrovaskulárnych komplikácií cukrovky a jej patogenéza úzko súvisí s oxidačným stresom, mitochondriálnou dysfunkciou a bunkovou apoptózou [22]. Táto štúdia skúmala ochranný účinok CDP na HK {}} bunky vyvolané vysokou glukózou reguláciou signálnej dráhy TLR4/NF-KB a jej molekulárnym mechanizmom.
V podmienkach vysokej glukózy vykazujú bunky HK -2 významný oxidačný stres [23]. Štúdie zistili, že vysoké hladiny cukru významne zvyšujú produkciu intracelulárnych ROS. Toto nadmerné množstvo ROS môže priamo poškodiť lipidy bunkovej membrány, čo vedie k zvýšeniu obsahu produktu peroxidácie lipidov MDA [24]. Zároveň sa významne znížila aktivita SOD a GSH-PX, dôležitých antioxidačných obranných systémov, čo naznačuje, že antioxidačná kapacita buniek bola vážne poškodená [25]. Táto nerovnováha v oxidačnom antioxidačnom systéme ďalej podporuje expresiu a aktiváciu TLR4 [26]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že nadmerné ROS možno rozpoznať pomocou TLR4 ako molekulárne vzorce spojené s nebezpečenstvom (DAMP), čím tvoria pozitívnu spätnú väzbu [27]. V tejto štúdii predbežné ošetrenie CDP významne znížilo hladiny ROS, zvýšené aktivity SOD a GSH-PX a znížili obsah MDA. Tento komplexný antioxidačný efekt naznačuje, že CDP môžu regulovať reakcie oxidačného stresu prostredníctvom viacerých cieľov.
V signálnej dráhe TLR4/NF-KB aktivovaný TLR4 podporuje aktiváciu komplexu IKK náborom downstream adapterových proteínov, čo následne vedie k fosforylácii a degradácii IκB [28]. Táto štúdia pozorovala, že vysoká glukóza významne zvýšila hladinu fosforylácie IkB, čo viedlo k translokácii NF-KB p65 z cytoplazmy do jadra. Štúdie ukázali, že jadrová translokácia p65 nielen zhoršuje oxidačný stres, ale tiež ovplyvňuje mitochondriálnu funkciu [29].
Zafarbením JC -1 bolo pozorované, že ošetrenie glukózy s vysokým obsahom glukózy spôsobilo významné zníženie mitochondriálneho membránového potenciálu, ktorý ukazuje posun od červenej fluorescencie na zelenú fluorescenciu, čo naznačuje, že sa narušila protónový gradient medzi vnútornými a vonkajšími membránami mitochondrií. Mitochondriálna dysfunkcia ďalej zhoršuje produkciu ROS a vytvára začarovaný cyklus [30]. Predbežné ošetrenie CDP si môže zachovať stabilitu mitochondriálneho membránového potenciálu a tento ochranný účinok sa môže dosiahnuť inhibíciou expresie TLR4 a aktiváciou NF-KB.
Mitochondriálna dysfunkcia a pretrvávajúci oxidačný stres nakoniec vedú k bunkovej apoptóze [31]. Farbenie Hoechst odhalilo, že bunkové jadrá v skupine s vysokou liečbou glukózou vykazovali zjavné typické apoptotické morfologické zmeny, ako je kondenzácia, kondenzácia a fragmentácia [32]. Tieto zmeny úzko súvisia s mitochondriálnou sprostredkovanou vnútornou dráhou apoptózy: strata mitochondriálneho membránového potenciálu vedie k uvoľňovaniu cytochrómu C, aktivácii kaspázovej kaskády a nakoniec bunkovej apoptóze [33]. Jadrová morfológia buniek v skupine s predbežnou liečbou CDP bola v podstate normálna a farbenie bolo rovnomerné, čo naznačuje, že CDP bránili bunkovej apoptóze udržiavaním mitochondriálnej funkcie a inhibíciou oxidačného stresu.
Stručne povedané, táto štúdia systematicky detegovaná indikátory oxidačného stresu (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), mitochondriálna funkcia (JC -1) a bunková apoptóza (HOECHST), kombinovaná s TLR4/NF-KB signalizačnými kľúčovými molekulami, ktoré elikidáty elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu elikidátu.
Po prvé, zlepšením antioxidačnej kapacity buniek, znížením hladiny ROS a znížením aktivácie TLR4; Po druhé, inhibíciou expresie TLR4 a fosforylácie IKB, blokujúcou jadrovú translokáciu NF-KB; Nakoniec, zlepšením mitochondriálnej funkcie, inhibujúcou bunkovú apoptózu. Smrť, a tak zohráva ochrannú úlohu proti DN. Tento multi-cieľ synergický efekt spôsobuje, že CDP vykazujú dobré vyhliadky na aplikáciu pri liečbe DN. V nasledujúcich štúdiách bude polyacharidová štruktúra ďalej stanovená rôntgenovou difrakciou, jadrovou magnetickou rezonanciou a spektrometriou plynovej chromatografie. Okrem toho priemerné výsledky molekulovej hmotnosti ukazujú, že CDP sú heterogénne polysacharidy. Ďalej sa oddeľujeme a očisťujeme homogénne polysacharidy, detekujeme poysacharidovú štruktúru a biologickú aktivitu a objasňuje vzťah vzťahu štruktúry a aktivity.
