Štrukturálna charakterizácia polysacharidu cistanche Deserticola a jeho ochranný účinok na HK -2 poranenie buniek vyvolané vysokou glukózou
Jan 23, 2025
Abstrakt:
Cieľ: Študovať štruktúru cistanchských pútnikov polysacharidov (CDP) a ochranný účinok a mechanizmus ľudských proximálnych tubulárnych epitelových buniek (HK {{{0}}). Metódy: Chemické zloženie, molekulová hmotnosť, monosacharidové zloženie a možná štruktúra CDP sa detegovali metódou fenol kyseliny sírovej, metóda hydroxylovej bifenylovej metódy, metóda brilantnej modrej Coomassie, metóda iónového chromatografu, vysoko výkonná gélová permeatografia chromatografie a infračervená chromatografia. Ochranný účinok CDP na bunky HK -2 a jeho mechanizmus sa hodnotil vytvorením modelu poškodenia HK {{}} vyvolaných vysokým glukózou.Results: priemerná molekulárna hmotnosť CDPS bola 8 {{{21} 31,4198,3444 kDa, ktorá bola hlavne zložená z Glacózy, galactose, Mann rhamna, rhamna. a arabinóza a môže existovať -glykozidická väzba. Môže znížiť oxidačné poškodenie buniek HK -2 vyvolaných vysokým glukózou a poškodenie mitochondriálneho membránového potenciálu buniek HK -2 indukovaných vysokou glukózou. Relatívna expresia proteínu receptora 4 (TLR4) podobného receptora (TLR4) a pomer p -nukleárnych faktorov (NF) -KB p65 / -aktínu a p -IκB / -cítínu v bunkách HK -2 sa po zásahu významne znížil s rôznymi koncentráciami CDP (p <0,05, p <0,01). Záver: CDP môžu znížiť vysokéglukóza indukovaná renálnou rúrkovou epitelovou bunkouPoranenie inhibíciou TLR4 / NF-KB na podporu proliferácie buniek a inhibuje oxidačný stres a apoptózu.
Kľúčové slová: Cistanche Deserticola polysacharid; Ľudské renálne tubulárne epitelové bunky; Oxidačný stres; Dráha TLR4/NF-KB
CISTANCHE pre diabetes nefropatia (DN)
Diabetes nefropatia (DN)je hlavnou príčinou ochorenia obličiek v konečnom štádiu a vážne ohrozuje život a zdravie pacientov [1]. Renálne tubulárne poškodenie hrá kľúčovú úlohu pri výskyte a vývoji DN. Hemodynamické abnormality, oxidačný stres, zápalová reakcia a metabolické abnormality spôsobené prostredím s vysokým obsahom cukru môžu indukovať apoptózu a nekrózu obličkových tubulárnych epitelových buniek, čo vedie k poškodeniu tubulárnych tubulárnych obličiek [2,3]. TLR4 v obličkách je členom rodiny TLRS a jej príbuzná transdukcia signálu hrá dôležitú úlohu pri výskyte a vývoji DN [4]. V podmienkach vysokej glukózy môže vysoká expresia TLR4 v obličkách aktivovať dráhu NF-KB, zhoršuje bunkové oxidačné poškodenie a spôsobuje HK -2 bunkovú apoptózu [5, 6].
Cistanches Herba je sušená mäsitá stopka s fosformi listom Cistanche Deserticola ycma a (alebo) cistanche tubulosa (Schenk) Wight, tradičná liečivá a jedlá rastlina. Chutí sladké, slané,
Je otepľovanie a vstupuje doMeridiány obličiek a veľké črevá. Má účinky tonifikácie obličkových jang, zlepšovania podstaty a krvi a zvlhčovanie čriev a zmiernenie zápchy. [7] Polysacharidy sú jednou z hlavných aktívnych zložiek Cistache Deserticola. Obsah polysacharidov v vodnom extrakte z Cistche Deserticola je relatívne vysoký, pričom literatúra uvádza, že obsah je 29,598 až 39,609 mg/g [8]. Je zložený hlavne z glukózy, galaktózy, ramózy, arabinózy, fruktózy atď. Je zložený z monosacharidov a má mnoho farmakologických účinkov, vrátane regulácie imunitnej aktivity, proti starnutiu, zlepšenia učenia a pamäte, ochrany nervov, odoláva poškodeniu pečene, antivírusom a anti-Tumorom [9]. V posledných rokoch veľké množstvo štúdií ukázalo, že polysacharidy v tradičnej čínskej medicíne môžu zlepšiť diabetickú nefropatiu. Viaccieri, charakteristiky viacerých cestujúcich a významné účinky čínskych rastlinných polysacharidov vykazujú veľký potenciál pri zasahovaní do diabetickej nefropatie [10]. V štúdii Wang et al. [11], Banyanské polysacharidy vykazovali významné účinky pri zlepšovaní metabolizmu glukózy a lipidov, znižovali zápalové reakcie a regulovali črevnú mikrobiotu diabetických myší typu 2 prostredníctvom osi čreva. Predchádzajúce štúdie výskumného tímu ukázali, že vodný extrakt z Cistanche Deserticola môže zvýšiť mieru prežitia buniek HK -2 v prostredí s vysokým obsahom cukru a vysokého tuku, regulovať bunkovú apoptózu, oxidačný stres a úrovne zápalu a má potenciálny terapeutický účinok na diabetickú nefropatiu [12]. Experimentálne výsledky na zvieratách ukázali, že CDP môžu účinne zlepšiť diabetickú nefropatiu u myší a patologické výsledky ukázali, že renálna tubulárna fibróza sa významne zlepšila [13]. Existuje však len málo štúdií o úlohe cistanchských pútnikových polysacharidov pri ochrane bunkového modelu HK -2 vyvolaného vysokým glukózou. Vzhľadom na potenciálnu farmakologickú aktivitu a mechanizmus polysacharidov je táto štúdia zameraná na detekciu chemického zloženia, molekulárnej štruktúry a molekulárnej štruktúry CDP pomocou metódy fenolu kyseliny sulfurovej, metódy hydroxybiphenylovej metódy, brilantnej modrej metódy iónov, vysokej výkonnej gélovej permeačnej chromatografie a infračervenej chromagrafie. Analyzovala sa hmotnosť, monosacharidové zloženie a možná štruktúra a bol zavedený model buniek HK -2 buniek indukovaných vysokou glukózou na vyhodnotenie ochranného účinku CDP na poškodenie HK -2 a jej mechanizmus účinku. Poskytnite teoretický základ a experimentálne dôkazy o potenciálnom aplikácii CDP pri liečbe DN.
1 materiály a metódy
1.1 Materiály a nástroje
CDP (obsah polysacharidu> 8 0%, dávkové číslo: 2306019, Shaanxi Xintianyu Company); dapagliflozin (DAPA, dávkové číslo: BMS -512148, Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); ľudské renálne tubulárne epitelové bunky HK -2 (dávkové číslo: 20231014, Actt Company, USA); Mem Culture Médium, sérum Fetal Bovine Serum (číslo šarže: 20231014, 20231014, Gibco Company, USA); Buffer PBS (číslo šarže: 20230906, Hyclone Company, USA); 0,25% EDTA obsahujúce roztok trypsínu (číslo šarže: 20240411, spoločnosť Anhui Biosharp Company); CCK -8 súprava na detekciu životaschopnosti bunky (číslo šarže: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Superoxidovci dismutázy (SOD), malondialdehyd (MDA), glutatión peroxidáza
Peroxidáza, GSH-PX) Detekčná súprava (dávka č.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); HOECHST33258 KITINÁCIA APOPTózy (dávka č.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 farbenie
Súprava na detekciu mitochondriálnej membrány (šarža č.: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Dichlórofluoresceín diacetát (DCF-DA) Reaktívne kyslíkové druhy (ROS) Detekčné činidlo
Kit (Lot No.: 20231225, Peking Solebow Technology Co., Ltd.); TLR4 monoklonálna protilátka, fosforylovaný jadrový faktor-kB P65 (fosfo-NF-KB P65, P-NF-KB P65) Monoklonálna protilátka (šarža č.
ICS5000 iónový chromatograf, MUL-TIGO čítačka mikroplatín (Thermo Fisher, USA); PowerPac HC+Mini proteín elektroforéza prístroj (Biorad, USA); Invertovaný mikroskop TS2 (Nikon, Japonsko); LC -10 Vysoko výkonný kvapalný chromatograf, ri -20 detektor diferenciálu (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japonsko); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) tandemový gélový stĺpec (BRT Company, UK); Elektronická rovnováha CPA225D, EPPendorf5424 Centrifuge (Sartorius, Nemecko).
1.2 Experimentálne metódy
1.2.1 Stanovenie celkového obsahu cukru, kyseliny a bielkovín v CDP
Táto metóda bola nasledovaná podľa odkazu [14]. Celkový obsah cukru v CDP bol stanovený metódou kyseliny fenol-tufulovej; Obsah kyseliny urónovej v CDP bol stanovený metódou M-Hydroxybipenyl kolorimetrickej metódy; a obsah proteínu v CDP bol stanovený metódou Coomassie Brilant Blue.
1.2.2 Stanovenie molekulárnej hmoty
Distribúcia molekulovej hmotnosti polysacharidov bola detegovaná vysoko výkonnými tandemovými stĺpcami pre permeatografie gélu. Séria štandardného dextran (dextran p {{{0}}, p -10, p {{}, p {-50, p {-100, p {}}, p} 0. 0 5 mol/l Pred použitím. Konečná koncentrácia bola 5 mg/ml, vortexovaná tak, aby sa rozpustila, a centrifuged pri 12 0 00 r/min počas 10 minút. Supernatant bol nasávaný a filtrovaný s 0,22 μm vodnou mikroporéznou membránou. Po vysokorýchlostnej centrifugácii sa ako mobilná fáza použila 0,05 mol/l NaCl. Chromatografický stĺpec bol BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); Prietok bol 0,7 ml /min; Teplota stĺpca: 40 stupňov; Objem vstrekovania: 25 μl; detektor: diferenciálny detektor Rid -20 a; Čas analýzy: 62 min. Vyberte vyššie uvedenú chromatografickú metódu pre analýzu, získajte čas retencie a vykreslite logaritmus maximálnej molekulovej hmotnosti (MP) na súradnici (LGMP) a retenčného času (RT) na Abscissa (LGMP-RT). Štandardná krivka: Podľa vyššie uvedenej metódy sa vytvorili štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT štandardná krivka LGMN-RT. Vzorec výpočtu. Nahradenie doby zadržiavania vzorky do vzorca sa môže získať molekulová hmotnosť (MP, MW, Mn).
1.2.3 Monosacharid zloženie
Monosacharidové zloženie bolo stanovené pomocou iónovej chromatografie. Take appropriate amounts of 16 monosaccharide standards (fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose, fructose, ribose, galacturonic acid, glucuronic acid, aminogalactose hydrochloride) , glucosamine hydrochloride, N-acetyl-D-glucosamine, guluronic acid, mannuronic acid) were added with 2 mL z 3 mol/l kyseliny trifluóroctovej (TFA), hydrolyzovaná pri 120 stupňoch počas 3 hodín, sušená dusíkom a pridala sa na odstránenie Vortexu deionizovaná voda, aby sa dobre premiešal a pripravil štandardný zásobný roztok. Vezmite každý štandardný roztok monosacharidu a presne pripravte koncentračný štandard ako zmiešaný štandard. Podľa metódy absolútnej kvantifikácie sa stanovili hmotnosti rôznych monosacharidov a molárny pomer sa vypočítal na základe molárnej hmotnosti monosacharidov.
Pridajte 2 ml 3 mol/l TFA do polysacharidu a reagujte pri 12 0 stupni počas 3 hodín. Počas reakcie sa N2 použil na ochranu. Rozpustite sa po odparovaní pri zníženom tlaku. Pridajte 5 ml vody a víru do zmesi. Vezmite 5 0 µl a pridajte 950 µl deionizovanej vody. Odstredivka pri otáčkach po dobu 5 minút. Supernatant sa filtroval cez mikrofiltračnú membránu 0,22 um a analyzovaný iónovou chromatografiou. Stĺpec bol Dionex CarbopactM PA20 (3 mm x 150 mm); Mobilná fáza bola: H2O; B: 15 mol/Lnaoh; C: 15 mol/ l NaOH a 100 mol/ l NAAC; Prietok: 0,3 ml/min; Objem vstrekovania: 25 ul; Teplota stĺpca: 30 stupňov;. Detektor: elektrochemický detektor; Elučný gradient Pozri tabuľku 1.
Tabuľka 1 Tabuľka elúcie mobilného fázového gradientu
1.2.4 Detekcia infračerveného spektra
Zvážte 1 mg suchého polysacharidu a prášku KBR, brúste a premiešajte ich do malty a zatlačte ich do tenkých listov pomocou lisu tabliet. Analýza sa uskutočňovala s použitím infračerveného spektrometra Fourier Transformácie v rozsahu čísla vlny 4500 ~ 400 cm -1.
1.2.5 Ochranný účinok CDP na HK {}} bunky vyvolané vysokou glukózou pri diabetickej nefropatii
1.2.5.1 HK -2 Cell Culture
Po oživení buniek HK {0} sa kultivovali v MEM kompletnom médiu obsahujúcom 10% fetálne hovädzie sérum a 1% dvojitou protilátkou a bunky sa umiestnili do bunkovej kultúry inkubátora na 37 stupňov, 5% CO2 a nasýtenej vlhkosti na dodržiavanie steny. . Keď bunky rastú na 80% až 90%, trávia sa 0,25% trypsínom a subkulturované. HK -2 bunky vo fáze logaritmického rastu sa použili na následné experimenty.
1.2.5.2 Príprava zásobného roztoku CDP a koncentrácie dávkovania.
Presne vážte 3 0 mg CDP, pridajte 6 ml kompletného média MEM s vysokým obsahom glukózy na prípravu 5 mg/ml zásobného roztoku CDP a uložte ho do 4 stupňov chladničky. Pri použití, zmerajte určitý objem matky CDP, pridajte kultivačné médium, dobre premiešajte, sterilizuje sterilným filtrom 0,22 um a pripravte roztok vzorky vhodnej koncentrácie.
1.2.5.3 Účinky CDP na normálne HK -2 bunky
HK -2 bunky vo fáze logaritmického rastu boli nasadené do 96- doštičiek s hustotou 3 000 buniek/jamky. Podľa predbežných experimentálnych výsledkov boli bunky rozdelené do normálnej kontrolnej skupiny (kontrolná skupina, CON), rôzne koncentrácie hmotnosti (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml)
Bola zriadená prázdna skupina obsahujúca iba kultúrne médium; Po kultivácii s kultivačným médiom alebo liečivami počas 24 hodín a 48 hodín sa do každej jamky pridalo 100 ul kultivačného média obsahujúceho 10% CCK -8 a bunky sa inkubovali vo výške 37 stupňov, aby sa zabránilo opusteniu vo svetle 1,5 hodiny. Optická hustota (OD) každej jamky sa merala pri vlnovej dĺžke 450 nm s použitím čítačky mikroplatov a životaschopnosť buniek (%) sa vypočítala podľa vzorca „Živabilita buniek (%)=[(OD slepého drogového jamky) (OD slepka na každú skupinu liečiva v rámci liečivého liečiva na každej miere liečiva v rámci liečivého liečiva do normálnych buniek.
1.2.5.4 HK -2 Čas modelovania glukózy a skríning koncentrácie
Pripravte glukózu (glukóza, GLC) zásobný roztok (10 mg/ml) a zriedite ho pomocou kompletného kultivačného média na modelovanie koncentrácií 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 a 80 mmol/l na použitie. Bunky HK -2 v logaritmickej rastickej fáze boli nasadené do 96- doštičiek s 3000/studňami a CON, Model Group (Model, MOD) a slepá skupina na úpravu a podanú kompletné kultivačné médium a vysoké glukózové kultivačné médium s rôznymi koncentráciami. , Rovnaké množstvo kompletného kultivačného média, kultúra 24 hodín a 48 hodín a detegujte životaschopnosť buniek podľa metódy podľa „1.2.5.3“.
1.2.5.5 Vplyv CDP na mieru prežitia modelových buniek
Podľa experimentálnych výsledkov „1.2.5.4“ boli bunky HK -2 vo fáze logaritmického rastu nasadené do 96- do platniek v hustote 3 000 buniek na jamku. Bunky boli rozdelené na CON, Mod a rôzne hmotnostné koncentrácie 50, 100 a 200 buniek sa kultivovali pri 400 ug/ml, 400 ug/ml a 800 ug/ml CDP. Bola nastavená prázdna skupina na úpravu bez buniek. Skupiny CON a prázdne nastavenie boli pridané s rovnakým množstvom úplného média. MOD a každá skupina ošetrená liečivom sa pridávala so 60 mmol/l GLC a kultivovala sa 24 hodín. , zlikvidujte kultivačné médium, pridajte kultivačné médium alebo zodpovedajúce lieky a kultiváciu počas 24 hodín a 48 hodín a detekujte mieru prežitia buniek podľa metódy podľa „1.2.5.3“.
1.2.5.6 Účinky CDP na ukazovatele oxidačného stresu v modelových bunkách
Podľa výsledkov experimentu v „1.2.5.5“ boli bunky rozdelené na CON, MOD, Skupina CDPS s vysokou dávkou (CDPS-H, 400 mg/kg), skupiny CDP strednej dávky (CDPS-M, 200 mg/kg), skupina CDPS-L, s nízkym obsahom CDPS-L, bez podniku CDPS-L, CDPS-L, a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a CDPS-L) a skupine s CDPS-L) a CDPS-L) a DAPAGLOZIN GROUP (DAPAGLOZIN GROUP (DAPA, 10 μMOL/A. V skupine s nulovým prispôsobením sa po modelovaní pridalo kultivačné médium alebo zodpovedajúce lieky a kultivovali sa 24 hodín. Zhromaždili sa proteíny a lyzáty sa normalizovali na rovnakú hladinu korekciou koncentrácie proteínu. Podľa pokynov každej súpravy ukazovateľov sa detegoval obsah MDA, GSH-PX a aktivita SOD v každej skupine buniek.
1.2.5.7 Detekcia ROS v bunkách HK -2
Pridajte bunkovú suspenziu do platne 6- a vložte ju do inkubátora bunkovej kultúry, až kým bunky nevyrastú do monovrstvy a nedostanú zodpovedajúcu stimuláciu. Bunky umyte trikrát vopred chladeným PBS a zriedite sa bez sérového MEM média. Fluorescenčné farbivo DCF-DA sa zriedilo na konečnú koncentráciu 10 umol/l. Farbivo sa pridalo do platne 6-, bunky sa premyli trikrát vopred chladeným PBS a fluorescenčné farbivo DCFH-DA sa zriedilo na konečnú koncentráciu 10 umol/l médiom bez séra. µmol/l, farbivo sa pridalo do platne 6-, farbivo sa zlikvidovalo, bunky sa premyli trikrát médiom bez séra a potom sa obrázky zozbierali pod fluorescenčným mikroskopom.
