Štúdia mechanizmu podobného estrogénu glykozidov Cistanche pomocou metabolomiky

Úvod

Estrogény hrajú dôležitú úlohu v mnohých vývojových, fyziologických a súvisiacich procesoch, vrátane vývoja maternice.1–3 Dlhodobé užívanie estrogénu však môže mať mnoho vedľajších účinkov, ako je zvýšenie rizika rakoviny prsníka, rakoviny endometria a iných gynekologických nádorov.4,5 Preto sa výskumníci zaviazali hľadať náhrady estrogénu, ktoré by sa mohli vyhnúť týmto vedľajším účinkom, známym ako selektívne modulátory estrogénových receptorov, z ktorých dôležitú kategóriu tvoria fytoestrogény.6 Fytoestrogénové zlúčeniny sa prirodzene vyskytujú v rastlinách s estrogénnou potenciou a môžu sa viazať na estrogénové receptory, aby prejavili svoju aktivitu. Preto by fytoestrogény mohli stimulovať rast maternice kombináciou s hojnými estrogénovými receptormi v maternici, čo znamená, že uterotrofný test by sa mohol použiť na predbežný skríning a hodnotenie fytoestrogénov.

Cistanchedeserticola (CD), v Číne známa ako Rou Cong-Rong, je údajne účinná na reprodukciu, vývoj a funkcie plodnosti a používa sa ako tonikum už viac ako 1800 rokov.8,9 Nedávno farmakologické štúdie preukázali, že tonikum má široké liečivé funkcie, ako naprhormonálna regulácia, aperientné, imunomodulačné, antioxidačné, antiapoptotické, neuroprotektívne, antinociceptívne, protizápalové, protiúnavové a estrogénne aktivity.10 Glykozidy cistanche (GC) extrahované z CD patria medzi hlavné aktívne zložky a vykazujú rôzne biologické aktivity.11 Hoci aktívne zložky CD boli objasnené už skôr,12 estrogénový mechanizmus GC nebol nikdy skúmaný.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE PREVENCIU OSTEOPOROZY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V tejto pokračujúcej štúdii sme sa zamerali na potvrdenie možného použitia GC ako fytoestrogénov a na vykonanie metabolomickej analýzy na preskúmanie mechanizmu GC podobného estrogénu. Najprv sa na potvrdenie estrogénnej aktivity GC použil uterotrofický test a histologická analýza. Najdôležitejšie je, že sme sa zamerali na metabolické zmeny v potkanom sére a moči pomocou metabolomickej analýzy založenej na UPLC-MS/MS. Kvôli nedostatkom necielenej metabolomiky, ako je opakovateľnosť a komplikovaná matrica, bola na špecifické monitorovanie metabolitov a indexov (vrátane energetického metabolizmu, oxidačného stresu, metabolizmu lipidov a metabolizmu aminokyselín) použitá pseudo metóda založená na MRM režime. súvisiaci s estrogénnymi účinkami, rastom a vývojom bol vybraný ako biomarkery na detekciu. Naše výsledky vrhajú svetlo na estrogénový mechanizmus GC, ktorý pomôže rozvoju a využitiu GC.

Experimentálne

Činidlá

L-leucín, L-kynurenín, L-tryptofán, 5-HTP, kyselina cholová, Nfenylacetylglycín, 5-HT, glutatión (GSH) a 2,4-dinitrofenylhydrazín (99 USD.{{{{101} 8}} %, HPLC) boli zakúpené od Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, Čína). N-Etylmaleimid (98%, HPLC), oxidovaný L-glutatión (GSSG, 98%, HPLC) a 1,1,3,3-tetraetoxypropán (TEP) boli zakúpené od Sigma (Madrid, Španielsko). L-fenylalanín (Ring-D5, 98 %, DLM-1258-5) bol zakúpený od Cambridge izotopových laboratórií (MA, USA). Metanol a acetonitril MS kvality boli zakúpené od ACS (Houston, USA). Dietylstilbestrol (čistota, 99 USD.0 %), kyselina mravčia, ľadová kyselina octová a hematoxylín a eozín (H&E) boli zakúpené od Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Naringenín (čistota, 98 % (HPLC)) bol zakúpený od Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, Čína). GC boli pripravené v našom laboratóriu a ich čistota bola stanovená na 60 % ultrafialovou spektrofotometriou s použitím akteozidu ako markera na stanovenie.

Príprava GC

Briey,cistanche prášok(100 g) bol namočený v 75% etanole (1000 ml) počas 1 hodiny, potom bol trikrát extrahovaný reux počas 2,5 hodiny. Supernatant sa skoncentroval vo vákuu, čím sa získalaextrakt z cistanche(23,3 g). Extrakt sa zriedil vodou na koncentráciu 0,5 g ml- 1 (rozpustnosť stanovená so surovým liečivom). Po adsorpcii s AB-8 makroporéznou živicou počas 8 hodín sa kolóna eluovala postupne vodou a 85 % etanolom. Eluent 85 % etanolu sa skoncentroval, čím sa získal etanolový extrakt (8,4 g). Etanolový extrakt (0.02 g) sa presne odvážil a rozpustil v 50 % metanole (10 ml). 1 ml alikvot roztoku sa zriedil na 100 ml metanolom v odmernej nádobe. Nakoniec sa zriedený roztok meral pri 330 nm ultrafialovou spektrofotometriou. Absorpcia ultrafialového žiarenia bola 0,341 a lineárny vzťah pre akteozid prostredníctvom UV bol y ¼ 24,905 X + 0,0426 (R2 ¼ 0,9982). Pri obsahu 5,04 g GC bola miera čistenia 60 % (akteozid sa použil ako marker na stanovenie GC). Hodnotenie odtlačkov prstov GC je znázornené na obr. S1 ESI.

Pokusy na zvieratách a odber vzoriek

Samice potkanov SD s pohlavnou nezrelosťou (45–60 g) a pohlavnou zrelosťou (320–380 g) poskytlo Animal Center of Harbin Medical University, licencia pre laboratórne zvieratá, SCXK- (armáda): 2013-001. Zvieratá boli chované v laboratórnych podmienkach SPF a bola im poskytnutá štandardná laboratórna pitná voda z vodovodu ad libitum. Všetky postupy na zvieratách boli schválené Smernicami o dobrých životných podmienkach a starostlivosti o zvieratá provincie Heilongjiang a vykonávali sa podľa smerníc Národného inštitútu zdravia týkajúcich sa zásad starostlivosti o zvieratá (2004). Všetky potkany použité v tomto experimente sa týždeň aklimatizovali na vyššie uvedené prostredie.

Sexuálne nezrelé SD potkany boli náhodne rozdelené do troch skupín po 1 0 potkanoch: slepá skupina, dietylstilbestrolová skupina a GC skupina. Medzitým sa ako kontrolná skupina vybralo 10 SD potkanov sexuálnej zrelosti. Dietylstilbestrolovej skupine bol ig podávaný dietylstilbestrol (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g), skupine GC bol podávaný GC roztok (30 g kg- 1, 1 ml/100 g ) a slepá skupina a kontrolná skupina dostávali destilovanú vodu s rovnakým objemom dvakrát denne (ráno a večer) počas 3 dní. Tretí deň sa potkany po podaní umiestnili do metabolických klietok a vzorky moču sa kontinuálne odoberali počas 24 hodín. Potkany sa anestetizovali pomocou pentobarbitalu a odobrali sa vzorky krvi, ktoré sa odobrali z brušnej aorty a centrifugovali pri 3000 x g (15 minút, 4 °C), aby sa získalo sérum. Všetky vzorky boli uložené v - 20. C. Okrem toho sa maternica oddelila, zvážila a vyšetrila s použitím 10 % formalínu.

Histologická analýza

Z maternice boli vyrezané sériové tkanivá s hrúbkou 5 mm. Tkanivové rezy sa potom vložili do parafínu, zafarbili sa H&E s použitím rutinných metód a pozorovali sa optickým mikroskopom (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japonsko). Výška maternicových epiteliálnych buniek sa merala mikrometrom pod mikroskopom.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA PODPORU RASTU PRSÍ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metabolomika

Príprava séra zbaveného aktívneho uhlia

Špeciálne slepé sérum bolo pripravené z potkanieho séra, ktoré bolo zbavené endogénnych materiálov pomocou prášku aktívneho uhlia. Prášok aktívneho uhlia (6 g) sa pridal do potkanieho séra (10}0 ml), trepalo sa 2 hodiny pri teplote miestnosti a centrifugovalo sa pri 4 °C. C a 13 500 ot./min. počas 20 min. Supernatant bol zmenený s použitím Millipore expresných PES membrán (Merck Millipore, Ltd.) pripojených k 20 ml injekčnej striekačke v nasledujúcom poradí: 5 mm, 1,2 mm a 0,45 mm. Pomocou LC-MS/MS sa potvrdilo, že "stripované" sérum je bez biomarkerov.

Príprava štandardných roztokov

L-tryptofán (Try), L-kynurenín (Kyn), GSSG, N-fenylacetylglycín (N-Phe), 5- HTP, L-leucín (Leu), 5-HT a kyselina cholová ( CA) zásobné roztoky (1 mg ml- 1) ​​boli pripravené s použitím 100% metanolu. GSH sa pripravil v množstve 0,5 mg ml- 1 v 10 mM NEM PBS pufri a skladoval sa pri - 40. C v hnedých fľašiach. Kalibrátory boli vytvorené pomocou kombinovaného L-tryptofánu, L-kynurenínu, GSSG, N-fenylacetylglycínu, 5-HTP, L-leucínu, 5-HT, kyseliny cholovej a GSH-NEM, ktoré boli sériovo riedené destilovanou voda. Zásobný roztok IS L-fenylalanínu-d5 (d5-Phe) bol pripravený v 100 % metanole a bol pripravený pracovný roztok d5-Phe (10 ng ml- 1 ) v 100 % metanole a skladované pri - 40. C.

Počas analýzy bol potrebný derivatizačný krok, aby sa zabránilo degradácii GSH, čo zlepšilo stabilitu na detekciu a kvantifikáciu GSH. GSH bol stanovený po reakcii s NEM.15,16 Podľa predchádzajúcej správy sa pre GSH vybralo 50 mM NEM.

príprava vzorky

Pre vzorky séra sa ku vzorke (200 ml) pridalo 10 mM NEM (200 ml), potom metanol (1 000 ml obsahujúci IS Phe-d5 pri 10 ng ml- 1) a inkubovalo sa 20 minút pri { {9}}. C. Po centrifugácii pri 4 °C a 12 000 otáčkach za minútu počas 10 minút sa supernatanty (1000 ml) preniesli do 2 ml odstrediviek a odparili sa do sucha. Vysušený zvyšok sa rekonštituoval v destilovanej vode (100 ml) po centrifugácii počas 15 minút pri 4 °C. C a 13 500 rpm a 10 ml alikvot supernatantu bol injikovaný na analýzu.

Pre vzorky moču sa 100 ml vzorky umiestnilo do 2 ml skúmavky a do každej vzorky moču sa pridal 1 objem PBS (m/v) obsahujúci 50 mM NEM. Potom sa pridal metanol (1000 ml obsahujúci IS v 10 ng ml- 1) a vzorka sa inkubovala pri - 20. C počas 20 minút a potom centrifugujte pri 12 000 otáčkach za minútu počas 10 minút pri 4 °C. C. Supernatant (1000 ml) sa odparil do sucha pod miernym prúdom dusíka pri teplote miestnosti a potom sa zvyšok rozpustil v 60 ml mobilnej fázy a vortexoval sa 1 minútu pred centrifugáciou pri 13 500 otáčkach za minútu a 4 . C počas 15 min. Na analýzu sa vstrekol 10 ml alikvótny supernatant.

Validácia metodológie

Validácia testu bola vykonaná podľa „Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation“ (Food and Drug Administration, september 2013). Kalibrátory boli vytvorené pomocou náhradnej matrice pre Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe a CA zo štandardných pracovných roztokov v „stripovanom“ sére. Každý koncentračný kalibrátor bol duplikovaný. Štandardná krivka sa vypočítala pomocou 1/X váženej lineárnej regresie najmenších štvorcov koncentrácií kalibrátora štandardnej krivky a pomerov plôch píkov pre analyt k IS.

Test presnosti a presnosti

Presnosť testu združených vzoriek kontroly kvality a neošetrených vzoriek séra/moču kontroly kontroly kvality potkana sa vyhodnotila pomocou jedného vnútrodenného a troch medzidňových analytických cyklov. Vzorky kontroly kvality s tromi rôznymi koncentráciami boli vytvorené pridaním L-tryptofánu, L-kynurenínu, GSSG, N-fenylacetylglycínu, 5-HTP, L-leucínu, 5-HT, kyseliny cholovej a GSH-NEM štandardné roztoky do "stripped" séra/PBS, ktoré boli potom spracované rovnakým spôsobom ako in vivo vzorky. Štandardné zásobné roztoky Try, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu a CA (1 mg ml- 1) boli pripravené za 10 0 % metanol, s výnimkou GSH, ktorý bol pripravený v množstve 0,5 mg ml- 1 v 10 mM NEM PBS pufri. Štandardné krivky v ôsmich rôznych koncentráciách boli vytvorené rovnakým spôsobom ako QC vzorky a analyzované 1/X váženou lineárnou regresiou najmenších štvorcov. Pre štúdiu validácie metódy sa súčasne vykonala ďalšia metóda kontroly kvality s použitím spojeného séra/moču (50 ml) z každej vzorky kontrolnej alebo modelovej skupiny, aby sa získala vzorka kontroly kvality a potom sa spracovala ako vzorky in vivo. Séria vzoriek QC a štandardných kriviek bola vykonaná pre každých 50 vzoriek zvierat.

Matricové efekty

Variácia matrice, definovaná ako odchýlka v presnosti testu pre rôzne šarže matrice, sa vyhodnotila pomocou šiestich rôznych grafov obohateného potkanieho séra/moču na analýzu a posúdenie zvýšenej výťažnosti.17 Vyhodnotenie celkového účinku matrice pre test endogénnej zlúčeniny je náročné . Jedným zo spôsobov, ako otestovať, či má test nejaký (celkový) účinok na matricu, je vyhodnotenie zvýšenej výťažnosti. Test návratnosti s prímesou zahŕňa pridávanie analytu do predextrakčných vzoriek, čo sa líši od testu matricových faktorov (MF), ktorý zahŕňa pridávanie analytu do vzoriek po extrakcii.18 MF sa vypočítala ako plocha píku analytu v prítomnosť biologickej matrice v porovnaní s neprítomnosťou biologickej matrice. Použil sa IS-normalizovaný MF: MF ¼ pomer plocha píku/IS v prítomnosti matrice verzus pomer plocha píku/IS v neprítomnosti matrice.

UPLC-MS/MS analýza

Na LC-MS sa použilo zariadenie MS vybavené analytickou kolónou Waters X BridgeTM BEH C18 XP (2,5 mm, 3.0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA). /MS analýza. Mobilná fáza Q s lineárnym gradientom zložená z 0,1 % kyseliny mravčej vody (rozpúšťadlo A) a metanolu (rozpúšťadlo B) sa použila podľa nasledujúceho gradientového programu: 0–3.0 min (0–1 % B); 3.0–10.0 min (1–3 % B); 10.0–14.{35}} min (3–50 % B); 14.{40}} – 18,0 min (50 – 95 % B); 18,0 – 22,0 min (95 – 0 % B), čas zastavenia je 25 min. Objem injekcie bol 10 ml a rýchlosť bola 0,6 ml min- 1. Konečná metóda používala nasledujúce parametre: typ skenovania, MRM; iónový režim, elektrosprejová ionizácia (ESI) v pozitívnych a negatívnych iónových režimoch; napätie iónového spreja, ± 4500 V; clonový plyn, 20; teplota, 450 °C; iónový zdrojový plyn 1, 40; iónový zdroj plynu 2, 40. Všetky údaje UPLC-MS sa získali pomocou softvéru AB Analyst (verzia 1.6.2) a m/z 171,1–125,2 pre vnútorný štandard d5-Phe (DP, 63 V; CE 8 V, CXP, 21 V EP, 24 V) a podrobné MS podmienky sú uvedené v tabuľke S1;

Štatistická analýza

Všetky hodnoty boli vyjadrené ako priemer ± SD. Významnosť rozdielov medzi skupinami sa porovnávala pomocou jednosmerného testu ANOVA, po ktorom nasledoval Dunnettov test pomocou programu Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Prah významnosti bol v tomto teste nastavený na p < 0,05.

Výsledky a diskusia

Účinok GC na maternicu

Hmotnosť maternice a histologická analýza sa použili na vyhodnotenie účinku GC na maternicu. Hmotnosť maternice bola významne zvýšená v dietylstilbestrolovej, GC a kontrolnej skupine v porovnaní so slepou skupinou (P < {{0}} 0,01). V slepej skupine bol endometriálny epitel nízko stĺpcový s malými žľazami, žľazový epitel kubického tvaru a bez intersticiálnych zápalových buniek. V skupine s dietylstilbestrolom boli glandulárny epitel a endometrium vysoko stĺpcovité a vykazovali hyperpláziu s množstvom intersticiálnych zápalových buniek. V skupine GC boli glandulárny epitel a endometrium vysoko stĺpcovité zúbkované a vykazovali hyperpláziu s množstvom intersticiálnych zápalových buniek a zhrubnutím intimy. V kontrolnej skupine bolo endometrium vysoko stĺpcovité a žľazový epitel bol nízko stĺpcovitý, s malým počtom intersticiálnych zápalových buniek. V porovnaní so slepou skupinou bola výška epiteliálnych buniek maternice v ostatných skupinách významne zvýšená (P < 0,01) (obr. 1).

Validácia metódy detegovaného biomarkera pomocou UPLC-MS/MS

Linearita a rozsah kalibrácie

Pre každé meranie bola zostrojená lineárna kalibračná krivka s váhovým faktorom 1/X v študovanej matrici. Kalibračné krivky pre analýzy v sére sa analyzovali v rôznych dňoch. Kalibračné rozsahy pre analýzy boli rozdelené pozdĺž siedmich kalibračných bodov, ako je uvedené v tabuľke 1.

Presnosť a presnosť. Ukázalo sa, že metóda je vhodná z hľadiska presnosti a presnosti, a to ako medzi-denné, tak aj vnútrodenné, pre všetky študované vzorky. Hodnoty týchto parametrov boli menšie ako 5 % pri nastavených koncentráciách pre GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, kyselinu cholovú, 5-HT a N-fenylacetylglycín s tromi replikátmi každej analyzovanej koncentrácie. Údaje zodpovedajúce medzidňovým a vnútrodňovým hodnotám presnosti a presnosti sú uvedené v tabuľke ESI S2.

Matricové efekty

Ako je uvedené v tabuľke ESI S3,† zvýšené výťažnosti boli 92,5–118,1 % po pridaní 1000 ng ml- 1 GSH, 2000 ng ml- 1 GSSG, 1000 ng ml- 1 Leu , 6000 ng ml- 1 Trp, 50 ng ml- 1 Kyn, 2 ng ml- 1 5-HTP, 400 ng ml- 1 kyseliny cholovej 8 ng ml- 1 5-HT a 2500 ng ml- 1 N-fenylacetylglycínu do troch rôznych grafov potkanieho séra a po pridaní 100 ng ml- 1 GSH, 200 ng ml- 1 GSSG, 1000 ng ml- 1 Leu, 6000 ng ml- 1 Trp, 50 ng ml- 1 Kyn, 2 ng ml{ {37}} 5-HTP, 400 ng ml- 1 kyseliny cholovej, 8 ng ml- 1 5-HT, 2500 ng ml- 1 N -fenylacetylglycínu do troch rôznych grafov potkanieho moču s rôznymi východiskovými hladinami. CV nameraných koncentrácií Trp a Kyn z týchto šarží boli #10 % (n ¼ 5). Tieto výsledky ukázali, že rôzne matrice významne neovplyvnili test.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE PREVENCIU RAKOVINY maternice PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analýza profilovania metabolitov metódou pseudo-cielenia

Pseudocielená metóda sa použila na skúmanie prolingu metabolitu MRM v sére a moči štyroch skupín (slepá, dietylstilbestrol, kontrola a GC).

Po prvé, model PCA bol zostavený tak, aby vykazoval metabolické rozlíšenie štyroch skupín. Z multivariačnej analýzy boli zrejmé metabolické rozdiely medzi skupinami GC (vrátane dietylstilbestrolu a kontrolných skupín) a slepou skupinou. Vzorky QC sa tesne zhlukovali v grafe skóre PCA, čo naznačovalo, že stabilita systému bola pre túto metabolomickú štúdiu akomodačná (obr. 2).

Potom bola kritická P-hodnota nastavená na 0,05 pre výrazne odlišné metabolity v tomto výskume. V súlade s tým, ako je uvedené v tabuľke 2, boli rozdielne metabolity v porovnaní so slepou skupinou predbežne identifikované nasledovne: 17 vo vzorkách séra a

12 vo vzorkách moču pre skupinu GC, 15 vo vzorkách séra a 9 vo vzorkách moču pre skupinu s dietylstilbestrolom, 12 vo vzorkách séra a 11 vo vzorkách moču pre kontrolnú skupinu a 11 vo vzorkách séra a 7 vo vzorkách moču, ktoré boli súčasne prítomný v GC, dietylstilbestrol a kontrolné skupiny. Na ďalšie pochopenie metabolických rozdielov medzi rôznymi skupinami bola vytvorená zhluková tepelná mapa pre všetky rozdielne metabolity, ktorá demonštruje relatívne zvýšenie (červená) alebo zníženie (zelená) (obr. 3).

Osemnásť rôznych metabolitov súčasne prítomných v GC, dietylstilbestrole a kontrolných skupinách bolo opísaných ako

nasleduje: glukóza, kyselina citrónová, prolín, betaín, ornitín, N-fenylacetylglycín, kyselina fenylpyrohroznová, inozín, C16:0LPC, kreatinín a xantozín v sére a benzénacetylglycín, kyselina pyroglutámová, acetylkarnitín a Pozorovalo sa, že N6-acetyllyzín v moči bol významne znížený (P < 0.05); zatiaľ čo taurín, ornitín, kyselina a-ketoglutarová a spermidín v moči boli významne zvýšené (P < 0.05). Okrem toho sa významne zvýšil taurín (sérum), zatiaľ čo kyselina a-ketoglutarová (sérum), C18:0LPC (sérum) a betaín (moč) boli významne znížené v skupinách s dietylstilbestrolom a GC (P < {{ 19}}.05); L-kynurenín (sérum) bol up-regulovaný v skupine s dietylstilbestrolom, ale down-regulovaný v skupine GC (P < 0,05); kyselina pyroglutámová (sérum) a prolín (moč) boli znížené a kyselina citrónová (moč) a nikotínamid (moč) boli výrazne zvýšené v kontrolnej skupine a skupine GC (P < 0,05); a fenylalanín bol down-regulovaný v skupine GC (P < 0,05).

V tejto štúdii sa skúmali účinky GC na maternicu nedospelých potkanov. Maternica je najcitlivejším orgánom na testovanie účinkov chemikálií závislých od ER.Herba Cistanchesbolo hlásené, že indukuje zvýšenie hmotnosti maternice zvýšením funkcie uvoľňovania lutropínu v hypotalamo-hypofýze-ováriách20, čo sa tiež pozorovalo pri GC v tejto štúdii. To naznačuje, že GC majú aktivitu podobnú estrogénu. Nedávno sa správy zameriavali hlavne na prevládajúci mechanizmus, ktorým sú estrogénne účinky vyjadrené väzbou na ER, 21–23, ale metabolický mechanizmus nebol do hĺbky študovaný. V tejto štúdii sa použila pseudometabolomická metóda na preskúmanie estrogénového mechanizmu GC.

Metabolické medziprodukty sekvenčnej série reakcií sa menili výraznejším spôsobom ako enzymatická kinetika alebo sa individualizujú.24 Sedemnásť metabolitov v sére, vrátane glukózy, kyseliny citrónovej, taurínu, prolínu, betaínu, ornitínu, kyseliny pyroglutámovej, kyseliny a-ketoglutarovej, N- fenylacetylglycín, kyselina fenylpyruvátová, inozín, C18:0LPC, C16:0LPC,

kreatinín, fenylalanín, L-kynurenín a xantozín a 12 metabolitov v moči, vrátane benzénacetylglycínu, betaínu, taurínu, kyseliny citrónovej, ornitínu, kyseliny pyroglutámovej, acetylkarnitínu, N6-acetyllyzínu, nikotínamidu, a-ketoglutarínu Zistilo sa, že kyselina, spermidín a prolín sa podieľajú na estrogénnom mechanizme GC. Niekoľko zmenených metabolitov bolo mimoriadne zaujímavé, pretože boli prítomné v sére aj v moči. Napríklad kyselina citrónová, ktorá vzniká kondenzáciou acetylkoenzýmu A a kyseliny oxaloctovej a hrá dôležitú úlohu v cykle kyseliny citrónovej súvisiacom s energetickým metabolizmom,25 bola down-regulovaná v sére skupiny GC, ale up-regulovaná v moči. . Okrem toho kyselina a-ketoglutarová s glutamínovým uhlíkovým rámcom, ktorá môže udržiavať celkovú dusíkovú rovnováhu a podporovať syntézu bielkovín a je ústredným materiálom cyklu kyseliny citrónovej, bola v sére skupiny GC znížená, ale zvýšená v moči.26 Cyklus kyseliny citrónovej nie je len konečnou metabolickou dráhou troch hlavných živín (sacharidov, lipidov a aminokyselín), ale aj spojovacím článkom medzi metabolizmom cukrov, lipidov a aminokyselín a hlavným spôsobom získavania energie pre telo.27,28 To ukázalo, že estrogénny mechanizmus GC súvisí s energetickým metabolizmom, ktorý je rovnaký ako pri dietylstilbestrole. Preto existovala jasná súvislosť medzi cyklom kyseliny citrónovej a zvýšením hmotnosti maternice u nedospelých potkanov liečených GC. Ako dôležitý donor metylu hrá betaín dôležitú úlohu pri raste a vývoji plodu, čo naznačuje, že betaín sa podieľa na zvyšovaní hmotnosti maternice.29 Je zaujímavé, že taurín bol upregulovaný v sére aj v moči, čo by mohlo podporiť trávenie a absorpciu lipidov. a bunkový príjem a využitie glukózy podporou metabolizmu glukózy. Bolo tiež hlásené, že nedostatok taurínu vedie k úbytku hmotnosti u mladých zvierat, čo naznačuje, že taurín hrá dôležitú úlohu v raste a vývoji.30 Okrem toho regulačný účinok betaínu a taurínu pomocou GC sledoval rovnaký trend pri použití dietylstilbestrolu, ale so zvýšeným účinok v porovnaní s dietylstilbestrolom.

Okrem toho sa výrazne zmenilo množstvo aminokyselín. Naše výsledky naznačujú, že GC spôsobili metabolické abnormality v aminokyselinách. Metabolizmus aminokyselín by sa mohol použiť na syntézu špecifických proteínov, peptidov a iných dusíkatých zlúčenín alebo dekarboxyláciu deamináciou, transamináciou v kombinácii s rozkladom amoniaku alebo na uvoľnenie energie prostredníctvom cyklu kyseliny citrónovej.31,32 Preto zmeny týchto zlúčeniny sa môžu podieľať na dôležitých signálnych udalostiach, ktoré spúšťajú zvýšenie hmotnosti maternice.

Okrem toho, pre podrobnú analýzu dráhy boli rozdielne metabolity kategorizované do niekoľkých hlavných dráh vrátane citrátového cyklu (cyklus TCA), metabolizmu glutatiónu,

metabolizmus arginínu a prolínu, metabolizmus D-glutamínu a D-glutamátu, biosyntéza fenylalanínu, tyrozínu a tryptofánu, metabolizmus fenylalanínu a ďalšie dráhy pomocou softvéru Pathway Analysis of MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca), ako je znázornené na obr. 4. Cesta súvisiaca s energetickým metabolizmom, vrátane cyklu TCA a metabolizmu glutatiónu (v sére aj v moči), bola jedným z hlavných cieľov estrogénnych účinkov. Kritická úloha estrogénových chemikálií v energetickom metabolizme bola overená ER regulujúcimi gény potrebné pre mitochondriálnu funkciu, cyklus TCA a ďalšie, podľa predchádzajúcich štúdií.33,34 Dalo by sa dospieť k záveru, že estrogénny mechanizmus GC bol podobný k dietylstilbestrolu, pričom oba do určitej miery súvisia s cyklom TCA a metabolizmom glutatiónu, ale GC fungujú lepšie ako dietylstilbestrol.

Aj keď možné mechanizmy nebolo možné v tejto štúdii objasniť, vybrali sa niektoré metabolity, ktoré by sa v budúcnosti mohli použiť na skúmanie iných estrogénových mechanizmov GC v maternici. Na lepšie preskúmanie mechanizmu sa preto v budúcom výskume použijú iné technológie, ako napríklad proteomika.

Závery

Aby sme to zhrnuli, sérová a močová pseudocieľová metabolomická metóda založená na UPLC-QTRAP MS bola založená na skúmanie estrogénových mechanizmov GC, ktoré poskytli robustné a spoľahlivé výsledky. Použitím zavedeného pseudocieleného prístupu bol odhalený holistický pohľad na zmeny v metabolomike séra a moču mechanizmu podobného estrogénu (GC).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%