Štúdia o neuroendokrinno-imunitnej funkcii Cistanche Deserticola a jej produktov na pare z ryžového vína na modeli potkanov indukovaných glukokortikoidmi-Ⅱ

3.2.4. Imunohistochémia

Neurónová apoptóza je riadená mnohými apoptotickými a antiapoptotickými génmi, najmä génom Bax podporujúcim apoptózu a antiapoptotickými génmi rodiny génov Bcl{1}}. Bcl-2 je lokalizovaný v reaktívnych organelách produkujúcich kyslík, ako sú mitochondrie, endoplazmatické retikulum a jadrové membrány. Bcl-2 má malý vplyv na voľné kyslíkové radikály, ale môžezabraňuje oxidačnému poškodeniu buniek. Bax transportuje z cytoplazmy do mitochondriálnej membrány, mení štruktúru mitochondriálnej membrány a podporuje uvoľňovanie cytochrómu c a indukciu apoptózy.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V cytoplazme nadobličiek došlo k expresii proteínu Bax a Bcl{0}}. Farbenie ukázalo všetky žlté častice. V porovnaní so skupinou BC sa priemerná optická hustota proteínu Bax v skupine MC výrazne zvýšila (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Obrázok 5(b) ukazuje, že v porovnaní s BC skupinou sa priemerná optická hustota Bcl-2 proteínu v MC skupine významne znížila (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Proteín kaspázy -3 je lokalizovaný hlavne v cytoplazme vo svojej pôvodnej forme v normálnych tkanivách a má nízku expresiu. Pozitívne signály sú svetložlté alebo hnedožlté. V porovnaní so skupinou BC sa výrazne zvýšila expresia kaspázy-3 v skupine MC (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

V normálnych tkanivách bola expresia génu Fas znížená a pozitívny signál pre hybridizáciu in situ bol hnedožltý. Ako je znázornené na obrázku 5(d), v porovnaní so skupinou BC sa priemerná optická hustota proteínu Fas v skupine MC zvýšila (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Proteín FasL sa nachádza hlavne v bunkovej membráne alebo cytoplazme a jeho pozitívne signály sú hnedé. V porovnaní so skupinou BC sa priemerná optická hustota génu FasL v skupine MC výrazne zvýšila (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Výsledky ukázali, že CD a WCD môžuindukovať apoptózu v zápalových bunkácha znížiť poškodenie nadobličiek podporou expresie proteínu FasL a naviazaním sa na proteín Fas, aktiváciou proteínu kaspázy-3 a spustením kaskády kaspáz. Najlepší bol efekt skupiny WCD-HD.

3.3. Stanovenie funkcie imunity

3.3.1. Index imunitného orgánu

V porovnaní s tými v skupine BC sa koeficient týmusu a index sleziny v skupine MC výrazne znížili (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Detekcia podskupín T lymfocytov v periférnej krvi

Percento CD4+ buniek v ľavom hornom kvadrante a CD8+ buniek v pravom dolnom kvadrante v BC a každej liekovej skupine bolo vyššie ako v skupine MC. V porovnaní s pomerom v skupine BC sa pomer CD4+ThCD8+ výrazne znížil v skupine MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Stanovenie hladiny IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α a IFN-C v sére

Obrázok 8 ukazuje, že v porovnaní so skupinou BC sa hladina IL-6, TNF- a IFN-c významne zvýšila (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Výsledky experimentu pozorovania pomocou mikroskopického mikroskopu Lymus

Obrázok 9 ukazuje, že v skupine BC bol prítomný veľký počet lymfocytov. Lymfocyty a retikulocyty boli voľne usporiadané v strede s rozptýlenými okrúhlymi alebo oválnymi tymocytmi. Nevyskytla sa žiadna nekróza, žiadna zápalová bunková infiltrácia a žiadne abnormálne zmeny.

Skupina MC vykazovala veľké množstvo tkaniva lymfoidnej nekrózy s neusporiadaným usporiadaním lymfocytov a retikulocytov v strede. Guľaté alebo oválne tymocyty zmizli, bola evidentná masívna degenerácia buniek alebo nekróza a došlo k zápalovej bunkovej infiltrácii s abnormálnymi patologickými zmenami.

V skupinách CD sa morfologické charakteristiky lymfocytov vrátili do normálu a usporiadanie centrálnych lymfocytov a retikulocytov bolo takmer normálne. Okrúhle alebo oválne tymocyty sa zotavili, ale zostalo malé množstvo degeneratívnych alebo nekrotických lymfocytov a infiltrujúcich zápalových buniek.

V skupinách WCD a PC skupine boli morfologické charakteristiky lymfocytov lepšie opravené. Lymfocyty a retikulocyty v strede boli dobre zarovnané, okrúhle alebo oválne tymocyty boli takmer normálne, ale zostal malý počet infiltrujúcich a degeneratívnych lymfocytov.

3.4. Expresia génu CaM proteínu

Hodnota RQ (CaM mRNA-aktín mRNA) sa považovala za skúmanie expresie CaM mRNA. RQ skupiny BC bola 1. Výrazne sa zvýšila expresia CaM mRNA v hypotalame v skupine MC (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Diskusia

Čínsky liekopis [2] uvádza, že CD a WCD sa môžu používať na klinike ako hlavné typy odvarov. Po naparení s ryžovým vínom saproti starnutiu a tonizujúcim obličkovo-jangovým účinkomboli vylepšené. Prostredníctvom UPLC-QqQ-MS sme zistili kvantitatívne zmeny v chemickej materiálovej báze počas procesu parenia ryžového vína. Iridoidné glykozidy boli nestabilné a obsah týchto glykozidov sa znížil, dokonca sa stal nedetegovateľným. Zmenil sa aj obsah fenyletanolových glykozidov, čo mohlo vyvolať zmeny vo farmakodynamike a klinickom účinku.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klasický model obličkovo-jangovej deficiencie bol replikovaný subkutánnou injekciou kortikosterónu [19]. Predávkovanie kortikosterónom môže inhibovať sekréciu CRH v hypotalame. Medzitým bolo tiež inhibované tajomstvo ACTH. Znížila sa hladina hormónu kôry nadobličiek a tým sa znížila aj funkcia HPA osi. Hypofunkcia HPA osi je bežnou charakteristikou obličkovo-jangovej deficiencie [20]. Potom potkany vykazujú fenomén "vyčerpania" a symptómy sú v súlade s príznakmi nedostatku jangu obličiek na klinike.

V skupine MC sa hladina CRH, ACTH, T a CORT v potkanom sére významne znížila (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Modulácia podielu členov rodiny Bcl{0}} je jedným zo základných mechanizmov, ktorými FasThFasL sprostredkúva dráhu receptora smrti a rodina Bcl{1}} reguluje mitochondriálnu dráhu [21]. Faktor Bcl-2 inhibujúci apoptózu a faktory indukujúce apoptózu, ako je Bax, všetky patria do rodiny Bcl-2 [22]. Bunková apoptóza môže byť určená relatívnym pomerom faktorov inhibujúcich apoptózu a faktorov indukujúcich apoptózu [23]. Mitochondrie majú funkciu centrálnych kontrolných bodov pre mnohé formy apoptózy [24]. Táto štúdia ukázala, že CD-MD a WCD môžu odvodiť expresiu Bax a zvýšiť Bcl{13}} nazlepšiť nedostatok jangu obličiek. Fas je hlavný receptor smrti, ktorý indukuje apoptózu ligáciou s Fas ligandom (FasL) [25]. Expresia Fas a FasL v skupine MC sa zvýšila, zatiaľ čo táto expresia sa výrazne zvýšila v skupine WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Nedostatok imunitných funkcií je jedným z dôležitých prejavov obličkovo-jangovej deficiencie [28]. V tejto štúdii sme zistili, že index sleziny a týmusu v skupine WCD-MD sa významne obnovil (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Os HPA je najdôležitejším regulačným systémom, pretože reguluje sekréciu glukokortikoidov a endokrinný systém na udržanie sekrečnej funkcie kôry nadobličiek [32]. Nadmerná expresia CaM mRNA v tkanive hypotalamu súvisela s nedostatkom jangu obličiek. CD a WCD by mohli blokovať vápnikové kanály, inhibovať expresiu CaM mRNA v hypotalame a znižovať prílev vápnika, čím by sa znížila aktivita komplexu Ca2+·CaM.

Tvorba deficitu obličiek a jangu je proces vývoja chronického ochorenia. Obličky už nie sú čisto anatomickým pojmom a je to všeobecný pojem pre neuroendokrinnú imunitu a urogenitálny systém. Neuroendokrinno-imunitná (NEI) sieť je dôležitým integrovaným regulačným systémom [33]. CD a WCD môžu regulovať funkciu HPAT osi a zlepšiť obnovu obličkovo-jangového deficitu. Tento výsledok poskytuje experimentálny základ pre klinickú prevenciu a liečbu nedostatku jangu obličiek.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%