Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Abstraktné

LC Technology je celosvetovo uznávaná metóda na hodnotenie kvality tradičnej čínskej medicíny (TCM). Kvalita TCM má priamy vplyv na jej účinnosť. Preto, aby sme dôkladne odhalili, ako TCM uplatňuje svoju účinnosť, je v prvom rade potrebné pochopiť materiálny základ jej účinnosti a potom kontrolovať kvalitu účinných látok. Pre stanovenie farmakologického materiálového základu je rozhodujúca aplikácia metódy vzťahu spektrum-účinok. Cieľom tohto článku bolo preskúmať základné korelácie medzi chemickými profilmi a estrogénovou aktivitouCistanchena odhalenie aktívnych zlúčenín. Chemické profilyCistanchesa zaznamenali pomocou HPLC/Q-TOF-MS/MS a estrogénová aktivita sa stanovila testom rastu maternice a testom MTT. Potom sa skombinovaním výsledkov bivariačnej analýzy, analýzy hlavných zložiek a metódy šedej korelačnej analýzy identifikovalo pätnásť aktívnych zlúčenín. Sú to 8-kyselina epilogánová, salidrozid, syringalid A 3'- -l-ramnopyranozid, cistanozid A, echinakozid, cistanozid F, cistanozid B, cistanozid C, osmanthuzid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, 2 '-acetylakteozid a dve neznáme zlúčeniny. Táto štúdia kladie základ pre štúdie in vivoCistanchea na rozvoj jeho klinickej aplikácie.

Cistanchetubulosa

Kľúčové slová:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; estrogénna aktivita; analýza hlavných komponentov (PCA); Test rastu maternice.

Skratky

TCM: Tradičná čínska medicína

HPLC/Q-TOF-MS: Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia/kvadrupólová hmotnostná spektrometria s časom preletu

BA: bivariačná analýza

PCA: analýza hlavných komponentov

GCAM: metóda šedej korelačnej analýzy

MTT :trypsín, 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazóliumbromid

DMSO: dimetylsulfoxid

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Úvod

V poslednej dobe sa TČM stáva čoraz populárnejšou v ázijských a západných krajinách pre jej stabilné terapeutické účinky a nízku toxicitu na klinike. V dôsledku toho je potrebné vyvinúť nové typy TCM a pochopiť účinné kompozície používané počas ich klinickej aplikácie [1-6].

Najprv sa študuje vzťah spektra a účinku, aby sa rozlíšila korelácia medzi chromatografickým odtlačkom prsta a farmakodynamickou účinnosťou. Potom pomocou vzťahu hľadať účinné komponenty v TCM a formulovať štandardy kontroly tak, aby odrážali ich vnútornú kvalitu. Vzťah spektra a účinku bol aplikovaný v mnohých oblastiach výskumu TCM, ako je materiálový základ jednoduchého a zloženého TCM, kompatibilita komponentov, mechanizmus spracovania, predpoveď farmakologického účinku a optimalizácia technológie [7-12]. Vzťah spektra a účinku sa používa na predkladanie nových nápadov a metód na skúmanie účinných látok, optimalizáciu receptúr, zlepšovanie procesov prípravy, sledovanie a separáciu cieľových zložiek a na vývoj nových liekov TCM [13-17].

Cistanchesa široko používa na liečbu sexuálnej dysfunkcie, zápchy, prostatitídy a nedostatku obličiek. Má široké spektrum biologických aktivít vrátane estrogénneho účinku, anti-aging, antioxidačného a imunitného účinku [18-19]. Vo všeobecnosti sa fenyletanoidové glykozidy (ako je cistanozid A, tubulozid A), lignany a iridoidné glykozidy považovali za farmakologické zložky a chemické markery na kontrolu kvality lieku Cistanche a jeho produktov [20-21]. Chemické spektrá Cistanche z rôznych oblastí boli zaznamenané pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) [22-23]. V tejto štúdii vyberáme test rastu maternice a test proliferácie buniek MCF7 na posúdenie ich estrogénnych aktivít. Na koreláciu estrogénovej aktivity s jednotlivými zložkami sa použili metódy analýzy hlavnej zložky, bivariačnej analýzy a sivej korelačnej analýzy. Cieľom tejto štúdie bolo identifikovať bioaktívne zlúčeniny Cistanche zodpovedné za estrogénne účinky in vivo. Štúdia vytvára základ pre hĺbkové štúdie Cistanche.

Všetky experimentálne postupy boli preskúmané a schválené Etickým výborom pre zvieratá na Harbin University of Commerce.

Cistanchedeserticola (cd{0}}) bola zakúpená na drogovom trhu a identifikovaná prof. Zhangom Delianom (Harbin University of Commerce). Dietylstilbestrol bol zakúpený od HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 a RPMI1640 bez fenolovej červene boli zakúpené od HyClone Company (USA). MTT a DMSO boli všetky zakúpené od Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, USA). Bunkovú líniu ľudského karcinómu prsníka MCF7 poskytlo Výskumné centrum biologických vied a environmentálnych vied (Harbin University of Commerce). Použité štandardy boli nasledovné: akteozid (111530- 200505), echinakozid (111670-200503) a salidrozid (110736-200628) boli získané z Národného inštitútu pre kontrolu farmaceutických a biologických produktov (Peking , Čína). Acetonitril, metanol a kyselina mravčia boli MS triedy, zatiaľ čo voda bola ultračistá. Ostatné činidlá boli analytickej čistoty a boli komerčne dostupné.

2 Experimentálny postup

2.1 Materiály

Na analyticko-chemické experimenty a spracovanie údajov boli použité pracovné stanice Agilent 1290 HPLC, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) systém a chemické HPLC-3D pracovné stanice. Na prípravu vzoriek a štandardov bola použitá ultračistá voda Milli-Q. Medzi ďalšie prístroje patrili elektronické analytické váhy AR1140 (Ohaus International Ltd), čítačka mikrodoštičiek 680 (Bio-Rad Corporation) a vysokorýchlostná centrifúga 64R (Beckman Coulter Allegra).

Nedospelé samice myší Kunming (približne 21 dní od narodenia, odstavené) s hmotnosťou (12 ± 2) g boli zakúpené od Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Čína). Myši boli umiestnené v miestnosti s regulovanou teplotou (22 ± 2 stupne) s neobmedzeným prístupom k potrave a vode. Pokusy na zvieratách sa začali po piatich dňoch aklimatizácie. Pred podaním testovaných roztokov sa myši nechali cez noc hladovať s voľným prístupom k vode. Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami uvedenými v Príručke pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Národného inštitútu zdravia.

2.2 Príprava roztoku vzorky

Cistanchevzorky boli odobraté z desiatich rôznych biotopov, konkrétne Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan a provincia Hubei.

Roztok (1,{1}} g/ml)Cistanchevzorka bola pripravená v destilovanej vode na orálne podanie. Koncentrácia dietylstilboestrolu bola 20ug/ml a použil sa ako pozitívny kontrolný roztok. Roztok (1,{5}} g/ml) vzorky Cistanche bol pripravený v 50 percentách acetonitrilu. Akteozid, echinakozid a salidrozid (2,0 mg každý) sa rozpustili v 10 ml 50 % roztoku acetonitrilu. Vzorky aj štandardné roztoky boli pred analýzou filtrované pomocou 0,{9}}μm filtra.

2.3 Podmienky LC-MS

Na analýzu vzoriek sa použil Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm x 15 0 mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA). Mobilná fáza pozostávala z acetonitrilu (A) a 0,2 % (obj./obj.) vodného roztoku kyseliny mravčej (B) a čerpala sa prietokovou rýchlosťou 0,5 ml/min. Injekčný objem každej vzorky bol 10 ul. Program gradientovej elúcie bol nasledujúci: Mobilná fáza A bola iniciovaná pri 5 percentách a lineárne zvýšená na 23 percent po 35 minútach. Roztok A sa následne zvýšil na 25 percent (35 až 65 minút). Mobilná fáza A sa potom znížila na 5 percent na posledných 5 minút behu (65 až 70 minút). Teplota kolóny sa udržiavala na 30 °C. Chromatogramy sa monitorovali pri 254 nm. Tlak atomizačného plynu bol 30 psi a kapilárne napätie bolo 3,5 kV. Prietok suchého plynu bol nastavený na 8 l/min s teplotou 30 stupňov. Hmotnostné spektrá boli zaznamenané v rozsahu skenovania 100- 3,000 Da a boli v režime skenovania záporných iónov.

2.4 Vyhodnotenie odtlačkov prstov

Odtlačky LC vzoriek odobratých z 10 rôznych šarží boli vytvorené a automaticky spárované pomocou systému hodnotenia podobnosti pre chromatografické odtlačky prstov TCM (verzia 2012; Výbor pre čínsky liekopis, Peking, Čína). Okrem toho bola pomocou mediánovej metódy vytvorená referenčná chromatogramová mapa. Okrem toho sa na vyhodnotenie kvality vzoriek z desiatich rôznych biotopov použila zhluková analýza.

2.5 Analýza hlavných komponentov (PCA)

PCA je viacrozmerná štatistická metóda. Dokáže zachovať dostatok informácií zo zberu údajov. V tejto štúdii boli charakteristické píky z LC chromatogramov ďalej skrínované pomocou PCA s cieľom identifikovať aktívne zlúčeniny na základe vzťahu spektrum-účinok.

2.6 Test rastu maternice

Myši boli rozdelené do 12 skupín (10 na skupinu). Vzorkové roztoky, ktoré boli pripravené z Cistanche, sa odobrali z desiatich rôznych biotopov a podávali sa dvakrát denne (ráno a večer) sondou v dávke 30 g/kg telesnej hmotnosti počas štyroch dní. Slepé a pozitívne kontrolné skupiny obsahovali rovnaké objemy destilovanej vody a roztoku dietylstilboestrolu a boli podávané dvakrát denne počas štyroch dní. Na piaty deň sa anestetizovaným myšiam odobrali vzorky krvi obsahujúce liečivo. Vzorky boli centrifugované (5, 000 rpm, 10 min) a supernatanty (vzorky séra obsahujúce liečivo) boli oddelené. Vzorky séra obsahujúce liečivo sa inaktivovali zahrievaním na 56 stupňov vo vodnom kúpeli počas 30 minút a pred testom MTT sa prefiltrovali cez 0,{12}}μm filter. Súčasne boli myšiam okamžite vyrezané maternice a zvážené, aby sa vypočítali indexy hmotnosti maternice. Pokusy na zvieratách sa začali po piatich dňoch aklimatizácie. Myši hladovali cez noc s voľným prístupom k vode pred podaním testovaných roztokov. Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami Príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Národného inštitútu zdravia. Všetky experimentálne postupy boli preskúmané a schválené Etickým výborom pre zvieratá na Harbin University of Commerce. Všetky potenciálne stresujúce procedúry sa uskutočnili v anestézii pentobarbitalom sodným.

2.7 MTT test

Bunky MCF7 boli spoločne kultivované s RPMI 1640 bez fenolovej červene (obsahujúcej 5 percent CDT-FBS) počas štyroch dní. Bunky sa naočkovali na 96-jamkové platne v hustote 2,{7}} bunky/jamku. Dosiahla sa adherentná kultúra a po 72 hodinách kultivácie sa bunky spoločne kultivovali v médiu RPMI 1640 obsahujúcom vzorky séra od myší liečených Cistanche. Experimenty sa uskutočnili v šiestich opakovaniach. Následne sa do každej jamky pridalo 20 ul roztoku MTT (5 mg/ml v PBS) a bunky sa inkubovali 4 hodiny. Po odstránení média sa pridalo 150 ul DMSO, aby sa vytvoril formazanový produkt, a doštičky sa pretrepávali v tme, aby sa úplne rozpustili. Absorbancia sa merala pri 570 nm pomocou Microplate Reader. Rýchlosť proliferácie sa vypočítala ako priemerná hodnota absorbancie skupiny obsahujúcej liečivo séra delená priemernou hodnotou absorbancie slepej kontrolnej skupiny (bunky spoločne kultivované v RPMI 1640 bez séra).

2.8 Štatistická analýza

Na identifikáciu štatisticky významných rozdielov medzi hodnotami v slepej kontrolnej a experimentálnej skupine sa použil párový t-test (obojstranný). Rozdiely sa považovali za významné pri 95-percentnej úrovni spoľahlivosti (p <>

PCA sa použila na vyhodnotenie charakteristických oblastí píkov v chromatogramoch vzoriek z desiatich rôznych biotopov. Bivariačná analýza a Grayova korelačná analýza sa použili na posúdenie korelácie plôch píkov a ich estrogénnej aktivity. Korelácia bola vypočítaná štatistickým softvérom SPSS (SPSS pre Windows 21.0, SPSS Inc., USA). Rozdiely sa považovali za významné na 95-percentnej úrovni spoľahlivosti (obojstranné).

Etické schválenie: Uskutočnený výskum nesúvisí s používaním u ľudí ani zvierat.

3. Výsledky a diskusia

3.1 Zhluková analýza a hodnotenie podobnosti

Relatívna štandardná odchýlka retenčného času a plochy píkov charakteristických píkov boli {{0}},58 a 0,34 percent pre presnosť, 0,52 a {{8} },31 percent pre reprodukovateľnosť a {{10}},19 a 0,13 percent pre stabilitu, v uvedenom poradí. Tieto zistenia ukázali, že naša metóda LC na stanovenie odtlačkov prstov bola primeraná a spoľahlivá. Podobnosti chromatogramov desiatich vzoriek boli väčšie ako 0,9. Spoločné píky pre všetky vzorky nemohli úplne reprezentovať charakteristické zložky Cistanche, pretože pík sa mohol stratiť. Preto bolo číslo zhody vzorky upravené z 26 na 20, aby sa získala presnejšia mapa chromatogramu. Celkovo sa získalo 26 píkov a súčet ich plôch bol väčší ako 0,8 v porovnaní s plochami celkovej plochy píkov vo vzorke. Preto sme dospeli k záveru, že tieto chromatografické píky by mohli účinne odrážať hlavné chemické zložky Cistanche. Výsledky zhlukovej analýzy sú znázornené na obrázku 1. Celkovo desať rôznych biotopov bolo rozdelených do troch kategórií takto: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang a 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia a 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Trend zhlukovej analýzy ukázal, že biotopy liečivých bylín sú na spodnej hranici prahu podobné. So zvyšujúcim sa prahom sa však klimatické a rastové podmienky biotopov približujú. Ukazuje, že klastrová analýza dokáže nielen dobre rozlíšiť rôzne biotopy, ale odráža aj príbuznosti medzi nimi.

3.2 Identifikácia chemických zložiek

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Čím vyššia je absolútna hodnota vlastného zaťaženia, tým vyšší je vplyv zlúčenín na estrogénne indexy.

Chromatogramy Cistanche a štandardných vzoriek sa porovnali, aby sa identifikovali jednotlivé zložky za rovnakých podmienok LC-MS. Ako je uvedené v tabuľke 1, celkovo bolo identifikovaných 26 zložiek na základe retenčného času a údajov MS [24-26]. Aktívne zložky sa podávajú perorálne vo forme zmesí, a nie monomérov, keďže tradičná čínska medicína hrá terapeutickú úlohu vo forme zmesi. Nezistilo sa, že by jediná zlúčenina po individuálnom oddelení zohrávala úlohu. Naším cieľom je odhaliť zlúčeniny, ktoré majú estrogénovú aktivitu v známych zložkách Cistanche [23-30], a preto sme nevybrali NMR a iné technické prostriedky na overenie ich identity. Vrchol 1 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 373 (C16H22O10), ktorý bol identický s elementárnym zložením kyseliny geniposidovej. Toto bolo podporené stratou glukózovej skupiny, ktorá poskytla fragmentový ión s pomerom m/z 211. Vrchol 2 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 461 (C20H30O12), ktorý bol identický s elementárnym zložením dekafeoylakteozidu a bol podporený stratou ramnosylovej skupiny, ktorá vytvorila fragmentáciu s pomerom m/z 315. Vrchol 4 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 375 (C16H24O10), ktorý bol identický s elementárne zloženie 8-kyseliny epilogánovej. Strata glukózovej skupiny, tvorená fragmentáciou s pomerom m/z 213, ďalej podporila záver. Vrchol 6 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 607 (C29H36O14), ktorý bol identický s elementárnym zložením syringalidu A3'- - l-ramnopyranozidu.

Strata caff časti, ktorá vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 445, ďalej podporila záver. Vrchol 8 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 799 (C36H48O20), ktorý bol identický s elementárnym zložením cistanozidu A. Strata caff časti vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 637, ďalej podporil záver. Vrchol 11 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 487 (C21H28O13), ktorý bol identický s elementárnym zložením cistanosidu F. Toto bolo podporené stratou ramnosylovej skupiny, ktorá poskytla fragmentový ión s m/z pomer 341 a strata ďalšej časti caff vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 179, čo ďalej podporilo záver. Vrchol 12 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 813 (C37H50O20), ktorý bol identický s elementárnym zložením cistanozidu B. Strata glukózovej skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 651, ďalej podporil záver. Vrchol 13 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 827 (C37H48O21), ktorý bol identický s elementárnym zložením tubulozidu A. Strata ramnosylovej skupiny vytvorila fragmentáciu s pomerom m/z 681, ďalej podporil záver. Vrchol 14 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 637 (C30H38O15), ktorý bol identický s elementárnym zložením cistanosidu C. Strata ramnosylovej skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 491, ďalej podporil záver.

Vrchol 15 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 591 (C29H36O13), ktorý bol identický s elementárnym zložením osmanthuzidu B. Strata ramnosylovej skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 445, ďalej podporil záver. Vrchol 16 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 623 (C29H36O15), ktorý bol identický s elementárnym zložením akteozidu. Strata caff časti, ktorá vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 461, ďalej podporila záver. Vrchol 18 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 623 (C29H36O15), ktorý bol identický s elementárnym zložením izoakteozidu. Strata caffovej skupiny, predný vrchol 15 indikovala prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 591 (C29H36O13), ktorý bol identický s elementárnym zložením osmanthuzidu B. Strata ramnosylovej skupiny vytvorila fragmentový ión s m/z pomer 445, ďalej podporil záver. Vrchol 16 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 623 (C29H36O15), ktorý bol identický s elementárnym zložením akteozidu. Strata caff časti, ktorá vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 461, ďalej podporila záver. Vrchol 17 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 623 (C29H36O15), ktorý bol identický s elementárnym zložením cis-akteozidu. Strata časti caff, ktorá vytvorila fragment jódu a fragmentový ión s pomerom m/z 461, ďalej podporila záver. Vrchol 21 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 653 (C30H38O16), ktorý bol identický s elementárnym zložením kamneozidu Ⅰ.

Strata caff časti vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 491 a strata ďalšej ramnosylovej skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 345, čo ďalej podporuje záver. Vrchol 22 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 665 (C31H38O16), ktorý bol identický s elementárnym zložením tubulozidu B. Strata skupiny CH3 CO vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 623, a strata ďalšej časti caff vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 461, čo ďalej podporuje záver. Vrchol 23 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 639 (C29H36O16), ktorý bol identický s elementárnym zložením kamneozidu. Strata ramnosylovej skupiny, ktorá vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 493, ďalej podporila záver. Vrchol 24 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 665 (C31H38O16), ktorý bol identický s elementárnym zložením 2'-acetylakteozidu. Strata Ac skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 623 a strata ďalšej caffovej skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 461, čo ďalej podporuje záver. Vrchol 25 indikoval prevládajúci deprotonovaný ión s pomerom m/z 445 (C20H30O11), ktorý bol identický s elementárnym zložením cistanozidu G. Strata ramnosylovej skupiny vytvorila fragmentový ión s pomerom m/z 299, ďalej podporil záver. Štruktúry zlúčenín sú uvedené na obrázku 2.

3.3 DPS

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Tieto vrcholy boli nasledovné: 9, 12, 14 a 15. Následne boli echinakozid, cistanozid B, osmanthuzid B a akteozid, zodpovedajúci celkovo 4 vrcholom, vybrané ako reprezentatívne premenné pre estrogénnu aktivitu (obrázok 3).

.

3.4 Stanovenie estrogénovej aktivity

Vypočítal sa pomer vlhkej hmotnosti maternice k telesnej hmotnosti každej myši (obrázok 4). Zvieratá vystavené Cistanche z deviatich biotopov vykazovali významné estrogénne aktivity zvýšením ich hmotnosti maternice v porovnaní s myšami v slepej kontrolnej skupine. Obrázok 4 ďalej ukazuje rýchlosť proliferácie buniek MCF7 ošetrených sérom myší ošetrených Cistanche. Bunky ošetrené sérom myší, ktorým bol podaný Cistanche z desiatich biotopov, vykazovali výrazne vyšší rast v porovnaní s bunkami bez ošetrenia.

3.5 Bivariačná analýza

V tejto štúdii sme pozorovali, že hmotnosti maternice nedospelých samíc myší Kunming sa zvýšili a podporila sa proliferácia buniek ľudského karcinómu prsníka MCF7. Tieto zistenia potvrdili estrogénnu aktivitu Cistanche. Obrázok 5 ukazuje maternicové indexy a rýchlosti proliferácie buniek MCF7 týchto zložiek. Na výpočet relatívnych plôch píkov, ktoré zodpovedali estrogénovej aktivite vzoriek, sa použil Pearsonov korelačný koeficient. Korelačné koeficienty vyššie ako 0,3 sa považovali za významné (p < 0.05),="" zatiaľ="" čo="" korelačné="" koeficienty="" vyššie="" ako="" 0,5="" sa="" považovali="" za="" veľmi="" významné="" (p="">< 0,01).="" na="" základe="" výsledkov="" sa="" preukázalo,="" že="" cistanche="" má="" estrogénnu="">

Celkovo deväť zlúčenín významne korelovalo so zvýšením hmotnosti maternice (p < {{0}}="" 0,05),="" zatiaľ="" čo="" desať="" zlúčenín="" významne="" korelovalo="" s="" proliferáciou="" buniek="" mcf7="" (p="">< 0,05).="" zlúčeniny,="" ktoré="" významne="" korelovali="" s="" hmotnosťou="" maternice="" a="" proliferáciou="" buniek,="" boli="" 8-kyselina="" epiloganová,="" salidrozid,="" syringalid="" a3'-="" -="" l-ramnopyranozid,="" cistanozid="" a,="" cistanozid="" b,="" cistanozid="" c,="" osmanthuzid="" b,="" akteozid,="" izoakteozid,="" tubulozid="" b,="" 2'-acetylakteozid="" a="" dve="" neznáme="" zlúčeniny="" (obrázok="" 5).="" týchto="" trinásť="" zlúčenín="" vykazovalo="" estrogénne="">

3.6 Metóda Grayovej korelačnej analýzy

Obrázok 6 ukazuje relatívnu koreláciu charakteristických píkov 26 zlúčenín s maternicovými indexmi a Obrázok 7 ukazuje relatívnu koreláciu charakteristických píkov 26 zlúčenín s ich rýchlosťami bunkovej proliferácie. Celkovo tri zlúčeniny vykazovali najvyššiu koreláciu s maternicovými indexmi, menovite 8-epilogánová kyselina, cistanozid F a akteozid (obrázok 6, v zostupnom poradí); zatiaľ čo šesť zlúčenín, ktoré vykazovali najvyššiu koreláciu s proliferáciou buniek MCF7, boli echinakozid, cistanozid F, cistanozid B, osmanthuzid B, izoakteozid a tubulozid B (obrázok 7, v zostupnom poradí). Relatívne korelácie echinakozidu, osmantusidu B, akteozidu a izoakteozidu boli vyššie ako 0.5.

3.7 Optimalizácia podmienok LC-MS

Na získanie lepšej chromatogramovej mapy sa porovnávali metanol a acetonitril. Nakoniec bola najlepšou mobilnou fázou na separáciu kombinácia vodnej kyseliny mravčej (0,2 percent, obj./obj.) - acetonitrilu. V rozsahu skenovania s plnou vlnovou dĺžkou 200-400nm bola ako optimálna zvolená 254 nm. Okrem toho boli vylepšené aj parametre MS. Režim skenovania záporných iónov bol vybraný, pretože zlepšil hodnoty odozvy väčšiny zložiek v Cistanche.

4. Záver

Technológia LC-Q-TOF-MS bola použitá na identifikáciu estrogénovo aktívnych zložiek Cistanche. Táto štúdia ukázala, že 8-kyselina epilogánová, salidrozid, syringalidA3'- -l-ramnopyranozid, cistanozid A, echinakozid, cistanozid F, cistanozid B, cistanozid C, osmanthuzid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, 2'-acetylakteozid a dve neznáme zlúčeniny boli hlavnými aktívnymi zložkami Cistanche. Tieto zistenia si však vyžadujú ďalšie štúdie na preskúmanie in vivo účinkov a mechanizmu účinku zložiek.

Poďakovanie:

Tento projekt podporila Národná nadácia pre prírodné vedy Číny (č. 81073015), Prírodovedná nadácia provincie Heilongjiang (ZD2017014) a plán prípravy mladých inovatívnych talentov Kolégia v provincii Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . Autori vyhlasujú, že v súvislosti s publikovaním tohto článku neexistuje konflikt záujmov.

Referencie

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fytochémia, farmakológia , kontrola kvality a budúci výskum Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Prehľad, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Použitá integrovaná a globálna pseudotargeted metabolomics strategy na skríning markerov kontroly kvality citrusových TCM, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM Stratégia aplikovaná na analýzu kvality injekcií tradičnej čínskej medicíny: Použitie KuDieZi injekcie ako prípadovej štúdie, Molecules., 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Skríning bioaktívnych markerov kontroly kvality tabliet na kvapkanie QiShenYiQi na základe vzťahu medzi odtlačkom prsta s ultra vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou a vaskulárna ochranná aktivita, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Aplikácia viacrozmernej štatistickej analýzy a myslenia pri kontrole kvality čínskej medicíny, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, údaje o komponentoch orientovaných na HPLC/qTOF-MS súbor a chemometrická analýza na holistickú kontrolu kvality komplexných prípravkov TCM: pilulka Niuhuang Shangqing ako príklad, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, High Negative Predictive Value, Low Prevalence, and Spectrum Effect: Warning in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa od UHPLC-QTOF/MS na základe vzťahu medzi spektrom a toxicitou, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Skríning a identifikácia hepatotoxickej zložky v Evodia rutaecarpa na základe vzťahu spektrum-účinok a UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestická mierna kognitívna porucha: Aké sú klinické dôsledky?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Vzťahy so spektrom ako systematický prístup k výskumu tradičnej čínskej medicíny: súčasný stav a budúce perspektívy, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Vzťah spektrálneho efektu medzi odtlačkami prstov UPLC a bioaktivitami surových sekundárnych koreňov Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) a jeho troch spracovaných produktov na mitochondriálny rast spojený s kanonickou korelačnou analýzou, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spectrum-Effect Relationships Between Chemical Fingerprints a antibakteriálne účinky Lonicerae Japonicae Flos a Lonicerae Flos Base na UPLC a mikrokalorimetriu, predná strana. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Spektrálny efekt v testoch na predikciu rizika, skríning a diagnostiku, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Sledovanie nových hemostatických zlúčenín z produktov zahrievania celkových flavonoidov vo Flos Sophorae podľa spektra -vzťahy účinku a stĺpcová chromatografia, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Výskum vzťahov medzi spektrom a účinkom Da-Huang-Fu- Zi-Tang u potkanov metódou UHPLC-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Štúdia vzťahu spektrálneho účinku rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus a ich vzorca, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotická aktivita echinakozidu u ovariektomizovaných potkanov, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Antihyperglykemické a hypolipidemické účinky Cistanche tubulosa u diabetických DB/DB myší typu 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., acylované fenyletanoidové glykozidy echinakozid a akteozid z Cistanche tubulosa, zlepšujú toleranciu glukózy u myší, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Fenyletanoidové glykozidy s protizápalovými aktivitami zo stoniek Cistanche deserticola kultivovaných v púšti Tarim, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Kvantitatívna analýza Cistanches Herba pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s detekciou diódového poľa a vysokou hmotnostná spektrometria s rozlíšením kombinovaná s chemometrickými metódami, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Štrukturálna charakterizácia a identifikácia fenyletanoidných glykozidov z Cistanches deserticola YC Ma podľa UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferatívna aktivita fenylpropanoidov izolovaných z Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Simultánne stanovenie komponentov so širokými rozsahmi polarity a obsahu v Cistanche tubulosa použitím sériovo viazanej chromatografie s hydrofilnou interakciou s reverznou fázou a tandemovej hmotnostnej spektrometrie, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Aplikácia metabolomiky založenej na 1H NMR na rozlíšenie rôznych častí a vývoj nového pracovného postupu spracovania pre Cistanche deserticola, Acta. Pharm. Sin. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Štúdie o zložkách a bioaktivite čerstvého Cistanche tubulosa, Ph.D. Diplomová práca, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Čína, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Metabolický profil akteozidu produkovaného ľudskými alebo potkaními črevnými baktériami alebo črevným enzýmom in vitro využívaným UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Systematická charakterizácia metabolitov echinakozidu a akteozidu z Cistanche tubulosa v potkanej plazme, žlči, moči a výkaloch na základe UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Metabolický spôsob skúmania súvisiacich prekážok spôsobujúcich zlú biologickú dostupnosť pri orálnom podávaní izoakteozidu u potkanov pomocou ultra vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie/ kvadrupólová tandemová hmotnostná spektrometria s časom letu, Rapid. komun. Hmotnostné spektrum, 2017(4), 371-380.