Štúdia o vplyve akteosidu (aktívna zložka v Cistanche Deserticola) na NAFLD indukciou autofágy

2 výsledky

2.1 Porovnanie LC 3- ⅱ Hladiny expresie proteínu v bunkách HepG2 ošetrených pomocouAct a ech relatívny výraz LC 3- ⅱ proteínV bunkách HepG2 ošetrených BAFA1 (0. 67 ± 0. Relatívny výraz LC {{1 {{2 {0}}} ⅱ proteín v bunkách hepg2 v skupine rapamycín+bafa1 (1,24 ± {{3 0} 0 6) bol vyšší ako v skupine rapamycin (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Expresia LC 3- ⅱ proteínu v bunkách HepG2 v skupine ECH+BAFA1 a skupiny ACT+BAFA1 [0,43 ± 0,02 a 1,36 ± 0,11] bola významne vyššia ako v skupine ECH a skupiny ACT [(0,18 ± 0,01 a 0,28 ± 0,02<0.05).

TCM Herb Cistanche na ochranu pečene

2.2 Porovnanie LC 3- ⅱ Hladiny expresie proteínu v bunkách HepG2 ošetrených rôznymi koncentráciami ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Hladiny expresie proteínu buniek Hepg2 v BAFA1 kombinovanom s 25, 5 {0 a 1 0 0}}}}}},}},},}},}},}},}},}},}}, 1,83 ± 0. 53 a 0. 97 ± 0,25, respektíve) boli významne vyššie ako v skupinách ACT 25, 50 a 100 μmol/l (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 a 0,30 ± 0,15<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Poznámka: A. Imunoblotting proteínov; B. Semikvantitatívne výsledky analýzy; v porovnaní so skupinou ACT bez BAFA1, AP<0.05.
Obrázok 1 Porovnanie LC 3- ⅱ Hladiny expresie proteínu v bunkách HepG2 ošetrených rôznymi koncentráciami ACT

2.3 Porovnanie životaschopnosti buniek HEPG2 ošetrených rôznymi koncentráciami ACT počas 24 a 48 hodín

Hodnoty OD buniek hepg2 po zásahu s 0, 2 0, 4 {{{{{{}}}, 6 {0, 8 {0 a 1 {{{{{{{{{}}}}}}}}}}} μmol/l 0. 98 ± {0. 17, {0. 0. 94 ± 0. 15 a 0. 94 ± {0. 20, respektíve; a hodnoty OD buniek HepG2 po intervencii počas 48 hodín boli 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 a 0,09 ± 0,22. Po 24 a 48 hodinách intervencie s rôznymi koncentráciami ACT nebol žiadny významný rozdiel v hodnotách OD buniek HEPG2 (F =0. 213, 0,213, p =0. 96, 0,36). Pozri obrázok 2.

Poznámka: A. bunky HepG2 boli ošetrené rôznymi koncentráciami ACT počas 24 hodín; Bunky HEPG2 boli ošetrené rôznymi koncentráciami ACT počas 48 hodín.

Obrázok 2 OD Hodnoty pri 570 nm po 24 a 48 hodinách liečby rôznymi koncentráciami ACT

2.4 Porovnanie hladín TG a zafarbenia červeného oleju v bunkovom modeli NAFLD in vitro po intervencii ACT

Hladina TG buniek HEPG2 v modelovej skupine (34,15 ± 1,90) bola významne vyššia ako v prázdnej kontrolnej skupine (14,17 ± 2,74) a skupine ACT Intervention (19,11 ± 1,68) a rozdiely boli štatisticky významné (P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Poznámka: A. úroveň TG; B. Farbenie olej červené O (20 ×); v porovnaní so skupinou modelu, AP<0.05.
Obrázok 3 Porovnanie hladiny TG a farbenia červeného oleju v modeli buniek NAFLD in vitro po ošetrení ACT

2.5 Porovnanie autofagozómov a lipidových kvapôčok po ošetrení ACT v porovnaní s slepou kontrolnou skupinou sa lipidové kvapôčky buniek HEPG2 v skupine s liečbou rapamycínom a ACT Intervention Group významne zvýšili a ko-lokalizovali sa autofagozómy LC3 v intervenčnej skupine ACT významne a ko-lokalizované s lipilovými kvapkami v priestore v priestore. Pozri obrázok 4.

3 Diskusia

NAFLD je najbežnejšou chronickou chorobou pečene na svete, čo predstavuje asi 1/4 celkovej populácie na svete a stala sa globálnym problémom verejného zdravia. Prenizácia je hlavným faktorom, ktorý riadi NAFLD. Nadmerný príjem živín pečeňovými bunkami spôsobuje nadmerné ukladanie tuku v bunkách, čo vedie k lipotoxickým reakciám, ako je bunkový stres (oxidačný stres a endoplazmatický stres retikula), aktivácia zápalu a bunkovú apoptózu a následne spôsobujúca sériu zmien v {{{{]. V posledných rokoch štúdie ukázali, že autofágia hrá dôležitú úlohu pri prevencii rozvoja ľudského NAFLD. Výsledky detekcie indexu súvisiaceho s autofágom u pečene pacientov s NAFLD a nealkoholickými mastnými pečeňovými ochoreniami a pečene obéznych a vysokotučných diét myší ukázali, že proces autofágy v hepatocytoch bol blokovaný, čo viedlo k masívnej akumulácii intracelulárnej TG a iných lipidových kvapiek [16]. Iné štúdie ukázali, že po kľúčovom géne 7 autofágy hepatocytov bola špecificky vyradená u myší kŕmených diétou s vysokým obsahom tuku, hladina TG v myších hepatocytoch sa významne zvýšila [17]. Avšak po nadmernej expresii génu ATG7 alebo intervenciou s autofágovými induktormi, ako je rapamycín a karbamazepín, bola mastná degenerácia v pečeni myši výrazne znížená [{{}}].
To naznačuje, že degenerácia mastnej pečene sa môže významne znížiť zlepšením aktivity autofágy pečene, čím sa poskytne účinná stratégia na liečbu NAFLD. Prírodné produkty, ako hlavný zdroj nového vývoja liekov, sa široko používajú pri prevencii a liečbe rôznych chorôb pečene. Ako vynikajúci produkt, ktorý sa bežne používa v tradičnej čínskej medicíne, priťahovala Cistanche Deserticola rozsiahlu pozornosť svojim farmakologickým účinkom, ako je neuroprotekcia, imunomodulácia, antioxidačná, protirakovinová a pečeňová ochrana. Doteraz bolo z Cistache Deserticola izolovaných viac ako 120 zlúčenín, vrátane fenyletanoidných glykozidov, terpenoidov a ich glykozidov, lignanov a ich glykozidov, oligosacharidov, polyolov a polysacharidov [21]. Medzi nimi sú fenyletanoidné glykozidy najviac študovanou triedou zlúčenín v aktívnych zložkách Cistche Deserticola. ECH a ACT sú reprezentatívne zlúčeniny cistanche dúšok fenyletanoidových glykozidov, ktoré majú pozitívne účinky v antioxidantoch, chránia pečeň, myokardium, nervové bunky a zvyšujú pamäť [{22-23]. Neexistuje však žiadna relevantná správa o literatúre o tom, či sa do procesu autofágy podieľajú glykozidy Cistanche Deserticola fenylenoidy.

Autofágia je proces samoliečby, ktorý je v tele všadeprítomný. Je to katabolický proces, v ktorom autofagozómy degradujú bunkový metabolický odpad. Proces autofágy všeobecne obsahuje tri procesy: iniciácia autofágy, predĺženie autofágovej membrány a autofagická lyzozómová tvorba, ktoré sú regulované hlavne cieľovým proteínom rapamycínu a fosfatidylinozitol -3 kinázovými signálnymi dráhami. Autofagozómy sú markery bunkovej autofágie. V procese tvorby autofagozómov zohráva dôležitú úlohu séria proteínov súvisiacich s autofágiou vrátane ATG5 ~ 12 a LC3. Preto táto štúdia skonštruovala systém vyhodnotenia autofágy, detegovala hladinu expresie autofágového markerového proteínu LC3 na molekulárnej úrovni a vyhodnotila schopnosť indukcie autofágy dvoch fenyletanoidných glykozidov Cistache Deserticola v bunkách HEPG2. Výsledky ukázali, že po pridaní liečby BAFA1 na základe zásahu autofágového induktora rapamycínu sa intracelulárny LC 3- buniek HEPG2 významne zvýšil, čo naznačuje, že systém vyhodnotenia autofágy môže presne vyhodnotiť autofágovú indukčnú aktivitu liekov; Po ECH a ACT boli ošetrené BAFA1, expresia LC 3- ⅱ proteínu v bunkách HepG2 v skupine ECH+BAFA1 a skupina ACT+BAFA1 bola významne vyššia ako v skupine ECH a skupiny ACT a rozdiely boli štatisticky významné (P<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and vyvíjanie ochrany pečenea ďalšie biologické funkcie. Po druhé, bezpečnosť je hlavným faktorom pri vývoji liekov. Aby sa vyhodnotila bezpečnosť ACT, táto štúdia ďalej testovala účinok ACT na životaschopnosť buniek HepG2. Výsledky ukázali, že životaschopnosť buniek HEPG2 nebola takmer nedotknutá intervenciou s rôznymi koncentráciami ACT, čo naznačuje, že ACT sa môže použiť ako kandidátske liečivo na ďalšie štúdium jeho farmakologických účinkov a molekulárnych mechanizmov.

Autofágia je vysoko konzervovaný biologický proces v bunkách a mierne zmeny v koncentráciách liečiva ovplyvnia hladinu bunkových autofagozómov. Na ďalšie určenie optimálnej koncentrácie ACT na vyvolanie tvorby autofagozómov v bunkách HepG2 použila táto štúdia rôzne koncentrácie ACT kombinované s BAFA1 na liečbu buniek HepG2 a detegovaných úrovni expresie LC 3- ⅱ proteín v bunkách. Výsledky ukázali, že 50 μmol/l ACT by mohlo významne zvýšiť hladinu autofagozómov v bunkách HepG2. Táto štúdia preto použila 50 μmol/l pôsobenie na zasahovanie do modelu NAFLD buniek skonštruovaného in vitro a predbežne preskúmala vzťah medzi jejochrana pečeneFunkcia a autofágia.
Súvisiace štúdie na modeloch buniek NAFLD ukázali, že po in vitro intervencii s voľnými mastnými kyselinami sa hladina TG buniek HepG2 významne zvýšila a agregácia olejových lipidových kvapôčok bolo možné jasne pozorovať v bunkách [24-25]. V tejto štúdii sa na intervenciu v bunkách HepG2 in vitro počas 24 hodín použilo 100 μmol/l PA. Hladina TG buniek HEPG2 v modelovej skupine bola významne vyššia ako v prípade slepej kontrolnej skupiny. Súčasne bolo možné v bunkách jasne pozorovať agregáciu lipidových kvapôčok, čo naznačuje, že model bunkových buniek NAFLD bol úspešne skonštruovaný. Aby sa ďalej pozoroval účinok ACT na model NAFLD buniek, použilo sa 50 μmol/l ACT na zasahovanie do bunkového modelu NAFLD in vitro a účinok ACT na NAFLD sa vyhodnotil detekciou hladiny TG a farbením olejom červenej O. Výsledky ukázali, že po intervencii ACT, hladina TG a počet olejových lipidových kvapôčok v bunkách HepG2 boli významne nižšie ako v modelovej skupine, čo naznačuje, že ACT má aktivitu zníženia TG v modeli NAFLD buniek vyvolaného PA. Aby sa ďalej študoval vzťah medzi aktivitou znižujúcou lipidy ACT a bunkovou autofágiou, táto štúdia použila LC 3- ⅱ špecifické proteínové protilátky a bodipy fluorescenčné sondy na spoločnú založenie autofagozómov a lipidových kvapiek. Zistilo sa, že počet autofagozómov v bunkách HEPG2 po intervencii ACT sa významne zvýšil v porovnaní s kontrolnou skupinou, čo bolo v súlade s výsledkami imunoblotovania proteínov v tejto štúdii, čo ďalej potvrdilo, že ACT má aktivitu indukujúcu autofágiu v bunkách HEPG2. Okrem toho, po zásahu liečiva, intracelulárne autofagozómy a lipidové kvapôčky sú ko-lokalizované, čo naznačuje, že vplyv ACT na zlepšenie PA-indukovanej NAFLD mastnej degenerácie môže zahŕňať zapojenie bunkovej autofágie. Avšak v modeli buniek NAFLD, či ACT vyvíja svoju farmakologickú aktivitu redukcie intracelulárnych hladín TG prostredníctvom lipofagickej dráhy, je potrebné ešte viac vysvetliť blokovaním intracelulárneho procesu autofágy.
Stručne povedané, medzi dvoma fenyletanolovými glykozidovými zlúčeninami Cistache Deserticola má významnú schopnosť indukovať autofágiu v bunkách HepG2. Zároveň v modeli buniek pečeňovej steatózy indukovanej PA CT významne znížil hladinu TG v bunkách HepG2. Po intervencii ACT mali autofagozómy a lipidové kvapôčky v bunkách HepG2 určitý ko-lokalizačný vzťah, čo naznačuje, že autofágia môže byť novou cestou zapojenou do farmakologického procesu ACT z hľadiska ochrany pečene. Pozri obrázok 5. V nasledujúcich štúdiách sa mechanizmus pôsobenia ACT pri znižovaní lipidov podrobne ďalej študuje pomocou autofágových blokátorov na položenie základu budúceho nového vývoja liekov.