Štúdia o vplyve akteosidu (aktívna zložka v Cistanche Deserticola) na NAFLD indukciou autofágy

Abstrakt:

 

Cieľ:Preskúmať autofágovú funkciu aktívneho akteosidu aktívnej látky (ACT) v Cistanche Deserticola a jej účinku na nealkoholické mastné ochorenie pečene (NAFLD).

MetódyAk chcete vziať echinakozid a pôsobiť ako výskumné objekty, 1 0 0 μmol/l Act a echinacozid (ECH) sa kombinovali s inhibítorom inhibítora autofágy-lyzozómov bleomycín A1 na intervenčnú liečbu. Na detekciu relatívnej expresie Autofágového markerového proteínového proteínového proteínu 1 Svetlé reťazce 1 (LC {5}} II) sa použilo imunoblotovanie proteínu proteínu 1 (LC 3- II). Bunky HEPG2 boli zasiahnuté rôznymi koncentráciami ACT in vitro a životaschopnosť buniek sa detegovala pomocou metódy tetrazoliovej soli. V vitro intervencii buniek HEPG2 s rôznymi koncentráciami ACT kombinovaného s balofloxacínom A1 a detekciou LC {3-}} II hladín proteínu pomocou proteínovej imunoBlottingovej techniky. Model NAFLD skonštruovaný in vitro s intervenciou liečiva sa použil na zafarbenie lipidových kvapôčok pomocou metódy farbenia olej červeného O a detekcii intracelulárnych hladín triglyceridov. Pozorujte lokalizáciu proteínu LC3 a lipidových kvapôčok prostredníctvom imunofluorescenčnej technológie. Výsledky môžu významne vyvolať autofágiu v bunkách HepG2 a úroveň expresie LC 3- II proteín sa významne zvýši v porovnaní s kontrolnou skupinou (ošetrená samotnou ACT) (1,36 ± {0. s štatistickou významnosťou (p0.05). 50 μmol/l pôsobí významne indukovanou autofágiou v bunkách HepG2 a hladina expresie LC 3- II proteínu sa významne zvýšila (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18, respektíve). Hladina TG buniek HEPG2 v intervenčnej skupine ACT (19,11 ± 1,68) bola významne nižšia ako v skupine s bunkovými modelmi NAFLD in vitro (34,15 ± 1,90) a rozdiely boli štatisticky významné (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Kľúčové slová:Nealkoholické mastné ochorenie pečene;Púšť cistanche;Akteozid; Autofágia

 

TCM Herb Cistanche na liečbu nealkoholických mastných ochorení pečene (NAFLD)

Kliknutím na obrázok získate viac podrobností

 

V posledných niekoľkých desaťročiach nealkoholický mastnýochorenie pečene(NAFLD) sa stal najbežnejšímchronické ochorenie pečene, s globálnou prevalenciou približne 25% dospelej populácie a považuje sa za úzko spojený s metabolickým syndrómom [1]. Aj keď pravdepodobnosť komplikácií súvisiacich s pečeňou u pacientov s NAFLD je nižšia ako 10%, NAFLD je rizikovým faktorom pre choroby súvisiace s pečeňou, ako je cirhóza a primárna rakovina pečene, čo ukladá obrovské hospodárske zaťaženie pacientov [{{5}]. Napriek rastúcej pozornosti venovanej NAFLD, NAFLD ako dôležitej chronickej chorobe sa nevenovala dostatočná pozornosť. Preto sa ďalšie podrobné pochopenie patogenézy NAFLD a hľadania účinných stratégií liečby sa stali naliehavými problémami, ktoré sa majú vyriešiť [6-7].

Posledné štúdie ukázali, že bunková autofágia hrá dôležitú úlohu vo fyziológii a patológii pečene [8]. Autofágová dysfunkcia alebo dysregulácia je spojená s rôznymi chorobami pečene, ako sú napríkladOchorenie pečene súvisiace s alkoholom[9], NAFLD [10], nealkoholická steatohepatitída [11] a hepatocelulárny karcinóm [12]. Patologickými charakteristikami NAFLD sú nadmerné ukladanie triglyceridov (TG) a ďalšie neutrálne lipidové kvapky (LD) v hepatocytoch pri nealkoholickej stimulácii. V prípade pečene sú dve hlavné dráhy regulujúce katabolizmus týchto LD lipolýzy a autofágia.
Lipolýza je regulovaná cytoplazmatickými neutrálnymi lipázami, ako je lipáza citlivá na hormón a tukovú Tg lipázu. V zodpovedajúcej lipoautofágskej dráhe sa LDS môže selektívne využívať priamym náborom proteínov súvisiacich s autofágou za vzniku autofagozómov a potom sa LDS enkapsulované autofagozómami ďalej dodávajú do lyzozómov a rozkladajú sa kyslou lipázou v lyzozómoch. Preto sa aktivácia lipoautofágy v hepatocytoch stala účinnou stratégiou prevencie a liečby NAFLD.
Cistanche Deserticola je vzácny čínsky bylinný liek, ktorý sa široko používa v klinickej praxi v tradičných vzorcoch čínskej medicíny. Zároveň sa dlho používa ako doplnok zdravia. Cistanche Deserticola obsahuje rôzne bioaktívne zložky, z ktorých najdôležitejšie sú glykozidy fenyletanol Cistanche Deserticola. Ako zástupcovia fenyletanoidných glykozidov, echinakoozidov (ECH) a slovesascosidu (ACT) majú mnoho dôležitých biologických aktivít, ako sú antioxidačné, neuroprotektívne, imunomodulačné a ochrana pečene [13]. Pokiaľ ide o ochranu pečene, štúdie zistili, že ECH môže chrániť pečeň redukciou zápalových mediátorov, inhibujúcim transformačný rastový faktor a zníži hladinu expresie génov súvisiacich s fibrózou pečene. ACT má významný ochranný účinok na chemické a liečivo vyvolané poškodenie pečene, ako je alkohol, tetrachlorid uhlíka a lipopolysacharid. ACT znižuje oxidačný stres spôsobený toxickými chemikáliami, odstraňuje reaktívny kyslík akumulovaný v pečeni a znižuje koncentráciu malondialdehydu. Zároveň významne zvyšuje aktivitu defutázy v pečeni a zníži obsah glutatiónu a významne zlepšuje histopatologické poškodenie a apoptózu pečene. Neexistuje však žiadna relevantná správa o literatúre o tom, či sa do procesu autofágy pri vykonávaní ochrany pečene podieľajú fenyletanoidné glykozidy Cistache Deserticola. Na základe toho táto štúdia použila konvenčné metódy bunkovej biológie a bunkový model in vitro na predbežné preskúmanie autofágy vyvolaného účinku cistanche Deserticola fenyletanoidov glykozidy a preskúmanie jeho možných farmakologických funkcií s cieľom poskytnúť vedecký základ pre budúci vývoj liekov.

 

1 materiály a metódy

1.1 Materiály

1.1.1 Výskumné predmety ECH a ACT sa použili ako výskumné subjekty.

1.1.2 Materiály HEPG2 Bunky boli zakúpené od spoločnosti Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (dávkové číslo: B21209) a ACT (dávkové číslo: B20715, HPLC čistota väčšia ako alebo sa rovná 98%). Trypsin bol zakúpený od spoločnosti Hyclone Company, USA, Fetal hovädzie sérum (dávkové číslo: 04-002-1 a) bol zakúpený od spoločnosti BI Company, Izrael, penicilín/streptomycín (dávkové číslo: SV30010.01) bol zakúpený od spoločnosti Hyclone Company. TG (dávkové číslo: BC0625) Detekčná súprava bola zakúpená od spoločnosti Solebao Company, Peking, Čína, ropná červená O (číslo šarže: O {{{}} g), dimetylsulfoxid (číslo časti: BCBZ1685) boli zakúpené od Sigma-Aldrich, USA; Inhibítor autofágy-lyzozómu Bafilomycin A1 (BAFA1, číslo šarže: TLRL-BAF1) bol zakúpený od Invitrogen v USA; Autofágový aktivátor Rapamycín (číslo šarže: S17098) bol zakúpený od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Čína; Svetlý reťazec 1 spojený s mikrotubulami 3 (LC3, číslo šarže: L7543, Druh: Rabbit, riedenie pomer: 1: {{{{{{{{{{{{{5 000}}}}}}}}}}) boli kúpené antibódami z réže: Sekundárna protilátka značená na peroxidázu (číslo šarže: 4010-05, druh: Kozí anti-králik, riedenie: 1: {1 000) bola zakúpená od Southern Biotech, USA, americká spoločnosť: 1: 1: 1: 1: 1: 1 Kúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich Company, USA a Bodipy 493/501 (číslo šarže: D3922) boli zakúpené od Invitrogen Company v USA.

 

1.2 Metódy

1.2.1 Bunková kultúra

Bunky HEPG2 sa kultivovali v modifikovanom glukózovom médiu Dulbecca obsahujúceho 10% fetálne hovädzie sérum, 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu v 37 -stupňovom inkubátore oxidu uhličitého. Keď sútok buniek dosiahol 85%, vykonali sa subkultúra, pokovovanie, intervencia a ďalšie operácie.

 

1.2.2 Detekcia imunoblotovania proteínov

1.2.2.1 ACT a ECH Liečba

LC 3- ⅱ Hladina expresie proteínu v bunkách HepG2 BAFA1 ako inhibítor protónového pumpy môže spôsobiť LC 3- proteín na agregáciu vo veľkých množstvách v bunkách, čím sa zosilní schopnosť indukcie autofágy. Preto sa kombinované použitie BAFA1 môže použiť ako monitorovací systém autofágy na vyhodnotenie schopnosti indukcie autofágy. Bunky HepG2 vo fáze logaritmického rastu sa preniesli do 3,5 cm bunkových kultúrnych misiek pre nočnú kultúru. Na intervenciu 12 hodín sa použilo 100 μmol/l ACT, ECH a BAFA1. Bunky sa premyli vopred chladeným roztokom fosfátového pufra (PBS) a okamžite sa lyzovali v RIPA proteínovom tlmivom tlmivom roztoku počas 10 minút. Supernatant sa centrifugoval a celková koncentrácia proteínov bola stanovená pomocou testu koncentrácie proteínov kyseliny bicinchonínovej. Po kvantifikácii tlmivom roztoku dodecylsulfátu sodného sa vzorka zahrievala na 95 stupňov počas 10 minút, aby sa proteín denaturoval. Potom sa odobralo 30 ul vzorky s mikropipetou a elektroforézovalo na polyakrylamidovom géli.
Po elektroforéze sa proteín preniesol z gélu na nitrocelulózovú membránu, blokovanú 1 {0% mlieka cez noc, inkuboval sa so špecifickou primárnou protilátkou pri teplote miestnosti počas 1 hodiny, premytý fosfátovým pufrom obsahujúcim 0,5% tritonu a inkuboval so špecifickou sekundárnou protilátkou pri miestnej teplote počas 1 h. Metóda ECL sa použila na vývoj farieb. Boli nastavené ako Blank Control Group, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group a ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Rôzne koncentrácie ACT zasiahli úroveň expresie LC 3- ⅱ proteín v bunkách HepG2

Bunky Logaritmickej fázy rastu HEPG2 sa preniesli do 3,5 cm bunkových kultivačných misiek pre nočnú kultúru a 25, 50 a 100 μmol/l Act s BAFA1 sa použili na intervenčné ošetrenie počas 12 hodín a hladina expresie LC {{8} ⅱ proteínu bola detegovaná proteínovou imunoblotnou. Nadviazaná bola kontrolná skupina (CON Group, Blank Control), Group Starvation Group (Group STA, Bunky HepG2), 25, 50 a 100 μmol/l a BAFA1 kombinovaná s 25, 50 a 100 μmol/l ACT Group.

1.2.3 MTT Metóda na detekciu rýchlosti prežitia buniek HEPG2 ošetrených rôznymi koncentráciami ACT počas 24 a 48 hodín
Bunky HepG2 vo fáze logaritmického rastu boli naočkované do platne 96- s miernou hustotou očkovania a kultivované v inkubátore na 12 hodín. 2 0, 40, 60, 80 a 100 μmol/l sa pridali 24 a 48 hodín. Roztok 0,5 mg/ml MTT sa pridal v tmavom prostredí a inkuboval sa v inkubátore. Po 4 hodinách sa supernatant vyhodil, do každej jamky sa pridalo 100 ul dimetylsulfoxidu a bunky sa otriasli v trepačke s konštantnou teplotou pri 37 stupňoch počas 10 minút. Hodnota optickej hustoty (OD) pri vlnovej dĺžke 490 nm bola detegovaná enzýmovým markerom a vypočítala sa miera prežitia buniek.

 

1.2.4 In vitro konštrukcia modelu bunky NAFLD

Určitá hmotnosť kyseliny palmitovej (PA) bola zvážená a úplne rozpustená v určitom objeme izopropanolu na prípravu zásobného roztoku 100 mmol/l PA, ktorý sa potom rozdelil a uložil v chladničke -20 na neskoršie použitie. Akciový roztok PA bol zriedený na 100 μmol/l pomocou kompletného kultivačného média a pridal sa 1% hovädzí albumín bez mastných kyselín. Bunky boli inkubované pri 37 stupňoch počas 3 hodín na prípravu indukčného roztoku. Bunky HEPG2 vo fáze logaritmického rastu sa preniesli do 3,5 cm bunkovej kultúry pri vhodnej hustote pre nočnú kultúru a potom sa na intervenciu použil pripravený indukčný roztok.

 

1.2.5 Intervencia ACT NAFLD in vitro model TG Detekcia a farbenie červeného oleju

 

1.2.5.1 Tg Detekcia

Bunky HepG2 vo fáze logaritmického rastu boli prenesené do 3,5 cm bunkovej kultúry pre kultúru pre kultúru podľa prázdnej kontrolnej skupiny, modelovej skupiny a intervenčnej skupiny ACT. Modelová skupina bola indukovaná s indukčným roztokom 100 μmol/l PA a intervenčná skupina ACT bola indukovaná pomocou 100 μmol/l PA indukčného roztoku a súčasne sa pridal 50 μmol/l ACT. Čas intervencie bol 24 hodín. Opatrne odstráňte staré kultivačné médium, pomaly umyte bunkový povrch s vopred chladeným PBS raz, pridajte 100 ul/misu vopred ochladzovaného roztoku RIPA, plne lýz na ľad počas 15 minút, odstredivka pri 4 stupňoch a 12 000 r/min počas 10 minút, zbera Pokyny TG Kit a nakoniec opravte hladinu TG na mg proteínu.

1.2.5.2 Olej červené o farbenie

Bunky HepG2 vo fáze logaritmického rastu sa preniesli do kultivačnej misky 3,5 cm pokryté sterilným krytom sklíčka pre nočnú kultúru. 100 μmol/l PA indukovalo bunky za vzniku lipidových kvapiek. Súčasne sa pridalo 50 μmol/l ACT na intervenciu počas 24 hodín.
Bunkové sklíčka sa odobrali, premyli sa trikrát vopred chladeným PBS, fixovaným 4% formaldehydom pri teplote miestnosti počas 10 minút, premyli sa bunkový povrch PBS, pridal pripravený pracovný roztok na farbenie červeného oleju, zafarbený pri teplote miestnosti v tme počas 15 min. a fotografovaný pod mikroskopom.

 

1.2.6 Imunofluorescenčné pozorovanie autofagozómov a lipidových kvapiek po liečbe ACT

Bunky HepG2 vo fáze logaritmického rastu sa preniesli do kultivačnej misky 3,5 cm pokryté sterilným krytom sklíčka pre nočnú kultúru. 1 0 0 μmol/l PA sa použil na vyvolanie tvorby lipidových kvapiek v bunkách. Zároveň bol pridaný ACT na intervenčnú liečbu 24 hodín. Bunkové sklíčka sa odobrali, premyli sa trikrát vopred ochladeným PBS, fixované pri teplote miestnosti počas 10 minút 4% formaldehydom, permeabilizované pri laboratórnej teplote počas 15 minút pomocou permeabilizačného pufra obsahujúceho 0,1% saponín, blokované pri laboratórnej teplote, pri primárnom mravčení, pri primárnom mravčení, pri primárnom mravčení, pri primárnom mravčení, pri primárnom mravčení a pl Pridané so špecifickou fluorescenčnou sekundárnou protilátkou, inkubovanou pri teplote miestnosti a mimo svetla počas 1 hodiny. Po inkubácii protilátky sa sklíčka premyli trikrát s PBS, kontrastne farbené lipidovými kvapkami špecifickými pre sondu 493/503 pri laboratórnej teplote počas 10 minút, premyté PBS a utesnené anti-výbuchovým tesniacim médiom, vysunuté v tme, pozorované laserovým konfokálnym mikroskom a zaznamenané. Bola stanovená slepá kontrolná skupina, skupina liečby rapamycínu a intervenčná skupina ACT.

 

1.3 Štatistická analýza

SPSS25. 0 Štatistický softvér sa použil na analýzu údajov. Kvantitatívne údaje boli vyjadrené ako x ± s. Bola použitá jednosmerná analýza rozptylu a testu LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.