Abstrkonať

Pozadie: Stále častejšie štúdie uvádzajú terapeutický účinok exozómov odvodených z mezenchymálnych kmeňových buniek (MSC), ktorými sú charakterizované proteín a miRNA. Proteomické a miRNA profily exozómov odvodených z ľudských embryonálnych kmeňových buniek (hESC) a ľudských indukovaných pluripotentných kmeňových buniek (hiPSC) však zostávajú nejasné.

Glykozid cistanche môže tiež zvýšiť aktivitu SOD v tkanivách srdca a pečene a výrazne znížiť obsah lipofuscínu a MDA v každom tkanive, účinne zachytáva rôzne reaktívne kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atď.) a chráni pred poškodením DNA. OH-radikálmi. Cystanche fenyletanoidové glykozidy majú silnú schopnosť zachytávať voľné radikály, vyššiu redukčnú schopnosť ako vitamín C, zlepšujú aktivitu SOD v suspenzii spermií, znižujú obsah MDA a majú určitý ochranný účinok na funkciu membrány spermií. Polysacharidy Cistanche môžu zvýšiť aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytoch a pľúcnych tkanivách experimentálne starnúcich myší spôsobenú D-galaktózou, ako aj znížiť obsah MDA a kolagénu v pľúcach a plazme a zvýšiť obsah elastínu. dobrý čistiaci účinok na DPPH, predĺženie doby hypoxie u starnúcich myší, zlepšenie aktivity SOD v sére a oddialenie fyziologickej degenerácie pľúc u experimentálne starnúcich myší Experimenty ukázali, že pri bunkovej morfologickej degenerácii má Cistanche dobrú antioxidačnú schopnosť a má potenciál byť liekom na prevenciu a liečbu chorôb starnutia kože. Zároveň má echinakozid v Cistanche významnú schopnosť vychytávať voľné radikály DPPH a dokáže vychytávať reaktívne formy kyslíka, predchádzať voľným radikálom vyvolanej degradácii kolagénu a má tiež dobrý reparačný účinok na poškodenie aniónom voľných radikálov tymínu.

Kliknite na Anti-aging Cistanche Powder Bulk

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Metódy: V tejto štúdii sme izolovali exozómy z hESC, hiPSC a ľudských mezenchymálnych kmeňových buniek z pupočníkovej šnúry (hUC-MSC) prostredníctvom klasickej ultracentrifugácie a filtra 0.22-μm, po čom nasledovala konzervatívna identifikácia. Tandemové hmotnostné značenie a kvantifikácia relatívneho peptidu bez označenia spolu definovali ich proteomiku. Na stanovenie profilov miRNA sa uskutočnilo vysokovýkonné sekvenovanie. Potom sme vykonali bioinformatickú analýzu, aby sme identifikovali dominantné biologické procesy a dráhy modulované exozómovým nákladom. Nakoniec sa uskutočnil western blot a RT-qPCR na detekciu skutočného zaťaženia proteínov a miRNA v troch typoch exozómov.

Výsledky: Na základe našej štúdie náklad z troch typov exozómov prispieva k sofistikovaným biologickým procesom. Na porovnanie, exozómy hESC (hESC-Exos) boli lepšie pri regulácii vývoja, metabolizmu a starnutia a exozómy hiPSC (hiPSC-Exos) mali podobné biologické funkcie ako hESC-Exos, zatiaľ čo exozómy hUC-MSCs (hUC-MSC-Exos) prispeli viac k regulácii imunity.

Závery: Údaje prezentované v našej štúdii pomáhajú definovať proteínové a miRNA krajiny troch exozómov, predpovedajú ich biologické funkcie prostredníctvom systematickej a komplexnej sieťovej analýzy na úrovni systému a odhaľujú ich príslušné potenciálne aplikácie v rôznych oblastiach na optimalizáciu výberu exozómov v predklinických a klinických štúdiách. skúšok.

Kľúčové slová: Ľudské embryonálne kmeňové bunky, ľudsky indukované pluripotentné kmeňové bunky, mezenchymálne kmeňové bunky z ľudskej pupočnej šnúry, exozómy, proteomika, miRNA

Úvod

Extracelulárne vezikuly (EV) sú drobné vezikuly aktívne vylučované bunkami, ktoré obsahujú najmä exozómy, mikrovezikuly (MV) a apoptotické telieska [40, 56, 57]. Sú široko distribuované vo viacerých telesných tekutinách, ako sú sliny, materské mlieko, krv, cerebrospinálny mok, žlč a moč [57]. Medzi nimi majú exozómy lipidovú dvojvrstvu s priemerom 40–200 nm, hustotu nadnášania 1,13–1,18 g/ml v sacharózovom gradiente a miskovitý vzhľad pod elektrónovým mikroskopom [21, 53]. Rôzne bioaktívne zlúčeniny, vrátane proteínov, nukleových kyselín a lipidov, zabezpečujú medzibunkovú komunikačnú funkciu exozómov medzi bunkami [16, 17]. Lipidová dvojvrstva je jemná bariéra, ktorá chráni obsah exozómov pred enzymatickou degeneráciou telesných tekutín [49]. Stabilné exozómy môžu sprostredkovať komplikované fyziologické a patologické procesy prostredníctvom parakrinnej aktivity, vrátane orgánového a reprodukčného vývoja, prezentácie antigénu, neurónovej komunikácie, imunitnej odpovede, regulácie starnutia a bunkovej proliferácie [57, 62].

Tvorba a uvoľňovanie exozómov je plne regulovaný proces a triedenie obsahu enkapsulovaného v exozómoch prebieha mobilizáciou rôznych proteínov [22, 47]. Viacnásobné proteíny sú kľúčové pre tvorbu exozómov, ktoré obsahujú endozomálny triediaci komplex potrebný na transport (ESCRT), tetraspaníny (CD9, CD63 a CD81), gén interagujúci s apoptózou 2-proteínu X (Alix) a náchylnosť na nádory gén 101 (TSG101) [38, 55]. Intracelulárny prenos exozómov je poháňaný kolektívnou aktivitou série proteínov, vrátane molekulárnych prepínačov RAB GTPáz a cytoskeletálnych proteínov, ako je aktín a tubulín [24]. Následne je exozómová sekrécia doplnená komplexom SNARE a rodinou synaptotagmínu [22]. Výskum zistil, že pučanie a uvoľňovanie exozómov závisí od aktivity vápnika a náboru ESCRT [15]. Ako posol sa uvoľňovanie exozómov podieľa na presluchoch buniek v reakcii na bunkovú fyziológiu a patologické zmeny, ako je aktivácia, zmena pH, hypoxia, radiačné poškodenie alebo bunkový stres [61].

Na odhalenie komponentov exozómov a ich možných fyziologických a patologických funkcií sa často používajú proteomické, transkriptomické a iné techniky na štúdium exozómových RNA a proteínov z rôznych druhov, tkanív a buniek [44]. Analýza exozómovej proteomiky zvyčajne zahŕňa tri kroky: izoláciu, purifikáciu a charakterizáciu exozómov, identifikáciu proteínových komponentov pomocou hmotnostnej spektrometrie a analýzu hrubých údajov [14]. Bunkový stav významne ovplyvňuje zloženie bielkovín a početnosť exozómov. V súčasnosti sa kvantitatívne proteomické techniky na analýzu charakterizácie a množstva proteínov používajú na objasnenie mechanizmu, ktorý je základom produkcie exozómov, a na prehĺbenie nášho chápania fyziologických a patologických úloh exozómov v bunkách [39]. Spomedzi nich sú široko používané kvantitatívne proteomické technológie založené na hmotnostnej spektrometrii, najmä vrátane metód bez značenia a stabilných izotopovo značených metód [13, 42]. miRNA sú malé bioaktívne molekuly, ktoré sú úzko spojené s rôznymi životnými aktivitami. Technika vysokovýkonného sekvenovania sa vyznačuje vysokou citlivosťou a presnosťou a má široké uplatnenie pri sekvenovaní miRNA (18–30 nt) [6]. Vzhľadom na vývoj súčasnej technológie neexistuje žiadna prekážka pre pitvu proteínových a miRNA profilov exozómov.

hESC a hiPSC majú vysoký diferenciačný potenciál [36]. Ich priama aplikácia v liečbe je však obmedzená pre riziko malignity a etické problémy [31]. Na rozdiel od toho majú mezenchymálne kmeňové bunky (MSC) širšie uplatnenie pri intervencii pri viacerých ochoreniach v klinických podmienkach [8]. Ich priame použitie však stále čelí niekoľkým obmedzeniam, vrátane nízkej miery prežitia, imunologického odmietnutia a bezpečnostných problémov [8, 43]. V súčasnosti sa exozómom venuje veľká pozornosť kvôli ich biologickej bezpečnosti, stabilite, neaneuploidii a nízkej imunogenite [51]. Predchádzajúce štúdie dokumentovali porovnanie komponentov MSC odvodených z rôznych tkanív a ich exozómov obsahujúcich proteomické a miRNA profily [59]. Gong a spol. znázornili aj regulačnú sieť hESC extracelulárnych vezikúl (EV) z hľadiska proteómu, ale iba v dráhach súvisiacich so starnutím bez zamerania sa na iné [19]. Questa a kol. tkali EV proteomický atlas hiPSC odvodených z fibroblastov ľudskej predkožky (HFF) [45]. Hoci tieto štúdie čiastočne uvádzali proteínové zložky EV, nezamerali sa výlučne na exozómy a ich komplexná proteomická analýza nie je jasne vyjadrená. Najmä profily miRNA ešte neboli opísané. Na vyriešenie tohto problému boli v tejto štúdii vybrané exozómy izolované z hESC, hiPSC a hUC-MSC na ďalšie skúmanie zamerané na ich proteómové a miRNA profily, aby sa získali nové poznatky pre ich výskum a klinickú aplikáciu.

Metódy

Príprava a charakterizácia exozómov

hESC a hiPSC boli kultivované v médiu ncTarget (kat. č. RP01020; Nuwacell. Ltd, Čína), zatiaľ čo 3. generácia hUC-MSC bola kultivovaná v miesnom hMSC médiu bez séra (kat. č. RP02010; Nuwacell. Ltd, Čína). Ďalej sa zhromaždilo 350 ml supernatantu buniek v logaritmickej rastovej fáze (~ 80 percent konfluencie) na purifikáciu exozómov. Exozómy boli extrahované sériou uznávanej centrifugácie a ultracentrifugácie, ako už bolo opísané [34, 52]. Stručne povedané, kondicionované médium (CM) sa zozbieralo a podrobilo gradientovej centrifugácii (300 x g počas 10 minút, 2 000 x g počas 15 minút, 10, 000 x g počas 30 minút), aby sa oddelili bunkový odpad. Exozómy sa peletovali zo zozbieraných supernatantov pri 100, 000 x g počas 70 minút s použitím rotora Ti45 (Beckman Coulter, USA). Potom boli resuspendované v PBS na ďalšiu filtráciu s použitím 0,{21}}μm MF-Millipore™ membránového filtra (Sigma, USA). Filtrát sa podrobil ultracentrifugácii pri 100 000 x g počas 70 minút. Finálna exozómová peleta bola resuspendovaná v PBS na ďalšiu analýzu. Na meranie koncentrácie a veľkosti izolovaných exozómov sa použil systém dynamického rozptylu svetla (DLS) (Wyatt Technology, USA).

Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM)

Skenovanie TEM sa uskutočnilo na opísanie morfológie izolovaných exozómov, ako už bolo opísané. Resuspendované exozómy (1 ug v 10 ul PBS) sa umiestnili na uhlíkom potiahnutú medenú mriežku (200-sieťka) a nechali sa na nej adsorbovať 2 minúty, po čom nasledovali dve premytia dvakrát destilovanou vodou. Potom boli mriežky negatívne zafarbené 8 μl 2% roztoku uranylacetátu počas 1 minúty. Po prirodzenom vysušení sa vzorky skúmali pomocou systému Tecnai Spirit (Thermo Fisher, USA) pri 120 kV.

Dynamický rozptyl svetla

Distribúcia veľkosti exozómov bola opísaná pomocou analýzy sledovania nanočastíc pomocou dynamického rozptylového merača svetla (Wyatt Technology, USA) podľa pokynov výrobcu (271-DPN), ako už bolo uvedené[23]. Stručne, exozómová peleta bola resuspendovaná v 100 ul PBS. Desať, 50 ul vyššie uvedených exozómov sa pridalo k 1 450 ul PBS a vortexovalo sa 30 s. Exozómy (1,5 ml) sa preniesli do jednorazovej kyvety na ekvilibráciu pri 25 stupňoch počas 30 sekúnd. Hodnota indexu lomu dispergačného činidla bola 1,37 a veľkosť exozómových častíc určovali ako Z-priemer, tak polydisperzita (PDI). Pre každú vzorku sa vykonali merania nezávislé od stromu.

Značenie tandemovej hmotnostnej značky (TMT) a analýza relatívnej kvantifikácie peptidov bez označenia (LFQ).

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 a P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 a P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), ako aj štatistickú významnosť (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

analýza profilu miRNA

Celková RNA sa extrahovala z izolovaných exozómov pomocou súpravy mirVana™ miRNA Isolation Kit (kat. č. AM1560; Thermo Fisher, USA). Vzorky RNA boli podrobené kontrole kvality pre mikročipový test miRNA, ktorý vykonala spoločnosť LC-Bio Technology Co., Ltd. Analýza nespracovaných údajov sa uskutočnila tak, ako bolo uvedené vyššie [9]. Diferenciálne exprimované miRNA boli vybrané ako kandidátske miRNA pri p-hodnote<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) a maximálna voľná energia<−10 (miRanda).

Bioinformatická analýza

Nespracované údaje boli podrobené analýze pomocou softvérového balíka Maxquant (v1.6.0) a Swiss-Prot_ľudské údaje boli nastavené ako referenčné (20 600 proteínov) (Proteome ID: UP000005640) . Identifikované proteíny boli zmapované v génovej ontológii (GO) a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) na základe KOBAS analýzy [60], aby sa určili ich biologické a funkčné vlastnosti. Softvér Cytoscape a balík igraph v softvéri R (verzia 3.6.1) sa použili na nakreslenie prepletenej siete exozómových proteínov alebo miRNA medzi signálnymi dráhami.

Štatistická analýza

Všetky experimenty sa uskutočnili trojmo. Kvantitatívna opakovateľnosť proteínov a miRNA bola zvýšená prostredníctvom analýzy hlavných komponentov (PCA), relatívnej štandardnej odchýlky a Pearsonovho korelačného koeficientu. Výsledky sa analyzovali pomocou nepárového Studentovho t-testu. Údaje sú vyjadrené ako stredná štandardná chyba priemeru (SEM). P-hodnoty sa považovali za štatisticky významné pri *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Výsledky

Izolácia a identifikácia exozómov

Kultivácia a identifikácia troch ľudských pluripotentných kmeňových buniek bola popísaná v dodatočnom súbore 1. Exozómy boli izolované z upravených médií troch typov kmeňových buniek (doplnkový súbor 1: obr. S1) a identifikované na základe morfológie, veľkosti častíc, koncentrácie, a povrchové markery [19]. TEM odhalil, že tieto exozómy mali morfológiu v tvare pohára (obr. 1A) a DLS odhalilo, že ich distribúcia veľkosti bola v rozmedzí 50–200 nm (obr. 1B). Western blotting ukázal, že izolované exozómy niesli pozitívne markery CD63, TSG101 a HSP70, ale nie negatívny marker kalnexín (obr. 1C). Každý hESC mal podobný exozómový výťažok ako hiPSC a oba boli vyššie ako hUC-MSC (obr. 1D). Tieto výsledky naznačujú, že reprezentatívne exozómy boli zastavené bez rozdielov v tvare; boli však zistené rozdiely medzi koncentráciami exozómov izolovaných z troch typov kmeňových buniek.

Bioinformatika zdieľaných a top-loaded proteínov

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (test bez označenia). Nakoniec sa vybralo 554, 437 a 911 semien na analýzu proteínových profilov hESC-Exos, hiPSC-Exos a hUC-MSC-Exos (doplnkový súbor 1: Obr. S3A). Potom sa títo kandidáti podrobili testu Vennovho diagramu, aby sa vybrali zdieľané proteíny (doplnkový súbor 1: obr. S3B). Bioinformatická analýza odhalila, že regulácii v týchto signálnych dráhach dominovalo 303 zdieľaných proteínov vrátane regulácie aktínového cytoskeletu, fokálnej adhézie, PI3K-AKT, metabolizmu uhlíka atď. (Dodatočný súbor 1: Obr. S3C). GO analýza tiež ukázala, že zdieľané proteíny boli obohatené o extracelulárny exozóm, membránu, proteínovú väzbu a extracelulárnu oblasť (Dodatočný súbor 1: Obr. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (test bez označenia) (obr. 2A). Na základe týchto výsledkov sa skrínovalo 163, 187 a 451 proteínov v hESC-Exos, hiPSC-Exos a hUC-MSC-Exos, v danom poradí (doplnkový súbor 1: Obr. S3E). Potom sme opísali krivku množstva expresie troch typov exozómov a identifikovali sme desať najlepších génových symbolov naložených proteínov v exozómoch (obr. 2B). ThVysoko zaťažené proteíny boli podrobené bioinformatike založenej na algoritme KOBAS. Proteómy troch typov exozómov boli zapojené do komplexnej regulačnej siete signálnej dráhy a 20 najlepších dráh sa potom triedilo na základe hodnoty -log10 (hodnota P) (obr. 2C-E). Všetky proteómy boli obohatené o interakciu extracelulárnej matrice (ECM)-receptor a signálne dráhy PI3K-AKT. Analýza interakcie proteín-proteín (PPI) odhalila, že proteíny s najvyšším zaťažením v hESC-Exos aj hiPSC-Exos boliobohatené v bunkovom cykle a metabolickej dráhe, zatiaľ čo proteíny s najvyšším zaťažením v hUC-MSC-Exos boli obohatené o dráhy súvisiace s reguláciou imunity (obr. 2F-H).

Párové porovnanie exozómovej proteomiky

Aby sme vyhodnotili rozdiel medzi každým dvoma exozómovými proteómami, vytvorili sme Vennov diagram na rozpoznanie jedinečných a prekrývajúcich sa génových zhlukov kódujúcich proteíny. Zdieľané gény kódujúce proteín sa potom podrobili analýze sopky a tepelnej mapy a GSEA a rozdielne exprimované proteíny sa filtrovali pri P.<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Porovnanie medzi hESC-Exos a hUC-MSC- 1: Obr. S4 D) odhalilo, že jedinečné génové zhluky kódujúce proteíny hESC-Exos sa podieľali hlavne na EGFR, TGF-, bunkovom cykle, regulácii pluripotencie a Wnt signalizácia (Doplnkový súbor 1: Obr. S4E). Na rozdiel od toho, jedinečné klastre hUC-MSC-Exos boli obohatené o mnohé signálne dráhy súvisiace s imunoreguláciou, ako je systém komplementu, regulácia zápalu a mikrobiálna infekcia (doplnkový súbor 1: Obr. S4F). Prekrývajúce sa klastre boli vysoko obohatené o interakciu ECM-receptor, komplementové a koagulačné kaskády a signalizáciu PI3K-AKT (obr. 3D). Graf sopky znázorňuje rozdiely medzi hESC-Exos a hUC-MSC-Exos (obr. 3E). Upregulované proteíny v hUC-MSC-Exos (klaster 1) sa podieľali hlavne na odozve komplementu, aktivite prirodzených zabíjačských buniek a signalizácii Rap1 a PPAR. Na rozdiel od toho, hESC-Exos upregulované proteíny sa podieľali hlavne na signalizácii PI3K-AKT, MAPK a AMPK (obr. 3F). GSEA potvrdila vyššiu regulačnú schopnosť hiPSC-Exos v pluripotencii (doplnkový súbor 1: Obr. S6A a D) a hESC-Exos v imunoregulácii, vrátane cytotoxicity sprostredkovanej prirodzenými zabíjačskými bunkami (doplnkový súbor 1: Obr. S6B a E) a regulácia COVID19-SARS-CoV2 (doplnkový súbor 1: obr. S6C a F).

Porovnanie hiPSC-Exos a hUC-MSC-Exos (doplnkový súbor 1: Obr. S4G) odhalilo, že jedinečný súbor génov kódujúcich proteín hiPSCExos bol významne spojený s nehomológnym spájaním koncov, metabolizmom TGF- a vitamínu B6 (doplnkové súbor 1: Obr. S4H), zatiaľ čo hUC-MSC-Exos sa podieľal hlavne na dráhach súvisiacich s imunoreguláciou (doplnkový súbor 1: Obr. S4I). Ich prekrývajúce sa proteíny sa tiež podieľali na regulácii interakcií ECM-receptor, komplementových a koagulačných kaskád a signalizácie PI3K-AKT (obr. 3G). Graf sopky predstavuje rozdielne exprimované proteíny (obr. 3H). Proteíny klastra 1 v tepelnej mape ukázali, že hUCMSC-Exos reguluje hlavne imunitnú odpoveď a AMPK signálnu dráhu, zatiaľ čo hiPSC-Exos hlavne reguluje bunkový cyklus a signálne dráhy inzulínu, Hippo a mTOR (obr. 3 I). GSEA ďalej podporovala dominantnú úlohu hiPSC-Exos pri regulácii vývojových procesov (Dodatočný súbor 1: Obr. S7A a D) a udržiavaní pluripotencie (Doplnkový súbor 1: Obr. S7B a E), zatiaľ čo hUC-MSC-Exos boli väčšinou sa podieľajú na procese imunoregulácie (Doplnkový súbor 1: Obr. S7C a F).

Bioinformatika prekrývajúcich sa proteómov

Ďalej sme skúmali zdieľané proteómy troch typov exozómov. Celkovo sa GO a KEGG analýzam podrobilo 309 génov kódujúcich proteín (obr. 4A). Výsledky ukázali, že zdieľané súbory génov kódujúcich proteíny medzi tromi typmi exozómov sa podieľali hlavne na extracelulárnych aktivitách a biologických procesoch vrátane metabolických procesov bunkových proteínov, väzby signálneho receptora, väzby ATP, väzby NAD, hojenia rán a metabolických procesov lipidov (obr. 4B). Tiež prispeli k vybudovaniu komplexných regulačných sietí signálnych dráh, ako sú PI3K-AKT, glykolýza/glukoneogenéza, hroch, oxytocín, HIF-1, bunkový cyklus a dráhy AMPK (obr. 4C). Medzi týmito proteomickými a kanonickými signálnymi dráhami existovali zložité regulačné vzťahy (obr. 4D). Bublinový graf dokazuje rôzne množstvo každého proteínového klastra v kanonickej signálnej dráhe. Zatiaľ čo hESC-Exos a hiPSC-Exos môžu mať silnejšie regulačné schopnosti ako hUC-MSC-Exos, pokiaľ ide o bunkový cyklus a signálne dráhy AMPK, hUC-MSC-Exos môžu mať výrazné regulačné účinky na signálne dráhy VEGF a NF-KB (dodatočné súbor 1: Obr. S8).

Analýza teplotnej mapy ďalej odhalila rozdiely v expresii zdieľaných proteínov (obr. 4E). V klastri A boli proteíny zapojené do signálnych dráh PI3K-AKT, Hippo, VEGF a B-bunkového receptora obohatené o hUC-MSCExos a hESC-Exos. Proteíny v klastri B sa podieľali hlavne na regulácii signalizácie PPAR, metabolizmu cholesterolu a produkcii IgA a boli vyčerpané v hESC-Exos. hUC-MSC-Exos obsahoval hlavne proteíny Cluster C, ktoré regulovali odpoveď komplementu, mikrobiálnu infekciu, HIF-1 signalizáciu, MAPK signalizáciu, metabolické dráhy a NF-κB dráhu. Proteíny v klastri d, ktoré boli obohatené o hiPSC-Exos, sa podieľali na regulácii signalizácie Ras, oxidatívnej fosforylácii a signalizácii mTOR. Proteíny v klastri e boli hojnejšie v hiPSC-Exos aj hESC-Exos ako v hUC-MSCExos a podieľali sa na viacerých metabolických procesoch, ako je citrátový cyklus, bunkový cyklus, inzulínová signalizácia, metabolizmus mastných kyselín a signalizácia AMPK. . Proteíny v klastri f sa podieľali na regulácii reabsorpcie vápnika, glykolýze/glukoneogenéze, adrenergnej signalizácii a metabolizme pyruvátu a boli vyčerpané v hUC-MSCExos aj hiPSC-Exos. Proteíny v rôznych klastroch sú uvedené v dodatočnom súbore 4.

miRNA profily troch typov exozómov

Na skúmanie profilov miRNA troch typov exozómov bola z exozómov izolovaná celková RNA, aby sa spojili 5' a 3' konce pre následnú inverznú transkripciu. Získaná cDNA sa použila na konštrukciu knižnice a široké testovanie. Číslo integrity RNA (RIN) bolo 2,7, 2,6 a 2,6 v hESC-Exos, hiPSC-Exos a hUC-MSC-Exos, v danom poradí (doplnkový súbor 1: Obr. S9A). Stanovenie koncentrácie RNA odhalilo, že v záťaži RNA dominoval hESC-Exos, po ktorom nasledovali hiPSC-Exos a hUC-MSCExos (doplnkový súbor 1: Obr. S9B). Na kvantitatívne vyhodnotenie opakovateľnosti miRNA sa použil Pearsonov korelačný koeficient (doplnkový súbor 1: Obr. S9C) a PCA (doplnkový súbor 1: Obr. S9D). Teplotné mapy sa použili na reprezentáciu rozdielne exprimovaných miRNA v troch typoch exozómov (doplnkový súbor 1: Obr. S9E) a počet rozdielne exprimovaných miRNA v P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Na skúmanie miRNA zapojených do biologických procesov boli najlepšie miRNA filtrované pri P<0.05 and read count>1000 pre ďalšiu predikciu cieľového génu. Obohatené gény sa potom podrobili GO a KEGG analýzam. Výsledky ukázali, že miRNA hESC-Exos významne ovplyvnili nasledujúce procesy: Rap1, PI3K-AKT, vápnik, hroch, cAMP, ErbB, Foxo, bunkový cyklus, signálna dráha AMPK atď. (analýza KEGG) (obr. 5D) a bunkový cyklus, vývoj viacerých organizmov, intracelulárna signálna transdukcia, bunková diferenciácia, starnutie, Wnt signalizácia a metabolizmus mastných kyselín. (biologický proces) (obr. 5G). Obohatenie cieľových génov miRNA hiPSC-Exos naznačilo, že boli významne regulované nasledujúce procesy: signálna dráha PI3K-AKT, Rap1, Ras, vápnik, hroch, cAMP a cGMP-PKG atď. (analýza KEGG) a bunkový cyklus, vývoj viacerých organizmov, fosforylácia, diferenciácia buniek, migrácia buniek a odpoveď na hypoxiu. (biologický proces) (obr. 5H). V regulačnej sieti miRNA hUC-MSC-Exos boli najpravdepodobnejšie biologické procesy: Rap1, Ras, PI3K-AKT, vápnik, cAMP, Hippo, bunkový cyklus, JAK-STAT a signálna dráha HIF{19}} . (KEGG analýza) (obr. 5F) a fosforylácia, intracelulárna signálna transdukcia, väzba ATP, bunkové delenie, metabolizmus lipidov, kostimulácia T buniek, hojenie rán, väzba NF-KB a zápalová odpoveď. (biologický proces) (obr. 5 I). Bola tiež znázornená sieť piatich najlepších miRNA a ich regulačné dráhy (doplnkový súbor 1: obr. S10).

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】