Zacielenie na laktátdehydrogenázu A s katechínom resenzibilizuje bunky rakoviny žalúdka SNU620/5FU na 5-fluóruracil, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.5. Spoločná liečba CA a 5Fu indukuje mitochondriálnu apoptózu závislú na ROS

Pretože inhibícia LDHA priamo zvyšuje mitochondriálny ROS a stratu jeho membránového potenciálu, následne indukuje apoptózu [16,29], skúmali sa faktory súvisiace s apoptózou sprostredkovanou mitochondriálnym ROS. Jednorazové ošetrenie CA alebo 5FU mierne zvýšilo mitochondriálnu hladinu ROS v bunkách SNU620/5FU pri meraní prietokovou cytometriou pomocou MitoSOX. Avšak spoločná liečba CA a 5FU významne zvýšila produkciu mitochondriálnych ROS. Táto zvýšená produkcia ROS bola zvrátená Mito-TEMPO, antioxidantom zameraným na mitochondrie (obrázok 5A-C). Inhibícia rastu po ošetrení CA a 5FU sa tiež obnovila po ošetrení Mito-TEMPO v bunkách SNU620/5FU (obrázok 5D). Ďalej sa apoptóza hodnotila prostredníctvom farbenia Annexin V-FITC/PI v bunkách SNU620/5FU. Súbežné ošetrenie s CA a 5FU zvýšilo počet apoptotických buniek medzi bunkami SNU620/5FU (obrázok 6A, B). Jadrová morfologická fragmentácia sa objavuje počas apoptózy a možno ju pozorovať farbením 4',6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI) [30,31]. Zistilo sa, že fragmentácia DNA sa významne zvýšila v skupine súbežne liečenej v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 6C). Nakoniec sa skúmali biomarkery apoptózy vrátane Bcl-2, Bax, kaspázy{30}}, kaspázy{31}} a PARP. Proapoptotická kaskáda sa zvýšila po spoločnej liečbe s CA a 5FU v bunkách SNU620/5FU (obrázok 6D). Tieto zistenia naznačujú, že spoločná liečba CA a 5FU indukuje apoptózu v bunkách SNU620/5FU.

Obrázok 5. Súbežná liečba katechínom (CA) a 5-fluóruracilom (5FU) zvyšuje produkciu mitochondriálnych ROS: bunky (A)SNU620/5FU boli ošetrené uvedenými koncentráciami CA,5FU（10 μM） a Mito -TEMPO (20 μM) počas 48 hodín. Mitochondriálny ROS buniek sa meral pomocou analýzy FACS pomocou MitoSOXTM Red; (B) stĺpcový graf ukazuje mieru buniek, ktoré boli pozitívne na farbenie MitoSOX; (C) snímky fluorescenčnej mikroskopie (X100) buniek SNU620/5FU zafarbených MitoSOX boli prezentované; (D) životaschopnosť buniek sa merala pomocou MTT testu. Výsledky sú uvedené ako priemer ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Obrázok 6. Zvýšenie apoptózy súčasnou liečbou katechínom (CA) a 5-fluóruracilom (5FU); Bunky SNU620/5FU boli ošetrené CA （10 uM） a/alebo 5FU（10 μM） počas 48 hodín∶（A） počet apoptotických buniek bol analyzovaný pomocou FACSanalýzy s použitím farbenia PI-Annexin V;(B) stĺpcový graf ukazuje percento buniek v skorej a neskorej apoptotickej fáze. Výsledky sú uvedené ako priemer ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

3. Diskusia

V tejto štúdii sme na charakterizáciu a vyhodnotenie chemorezistencie voči 5FU použili bunky SNU620/5FU, ktoré vznikli dlhodobou expozíciou 5FU so sériovým zvyšovaním koncentrácie liečiva [32]. Bolo hlásené, že rodičovské bunky SNU620 obsahujú mutant p53 s homozygotnou deléciou v exóne 5[33]. Na základe DNA mikročipu je v bunkách SNU620/5FU zvýšených niekoľko génov zapojených do chemorezistencie, vrátane tymidylátsyntetázy, proteínu viažuceho DNA 2 špecifického pre poškodenie, klusterínu a midkinu [32]. Niekoľko predchádzajúcich štúdií použilo bunkovú líniu SNU620/5FU ako model na vyhodnotenie in vitro účinnosti liekov proti rezistencii na 5FU prostredníctvom antimitózy, aktivácie AMPK a signalizácie kanabinoidných receptorov [34-36]. Metabolické charakteristiky a hladiny expresie génov súvisiacich s metabolizmom v bunkách SNU620/5FU a ich úlohy v chemorezistencii však neboli do značnej miery skúmané.

Tu sme demonštrovali, že bunky SNU620/5FU majú pokročilé glykolytické fenotypy, vrátane zvýšenej produkcie laktátu a expresie enzýmov súvisiacich s konverziou pyruvátu na laktát, ako je LDHA. Fosforylácia PDHA1, ktorá predstavuje zníženú aktivitu PDH zvýšenou PDK2 a PDK3, sa tiež zvýšila v bunkách rezistentných na SNU620/5FU v porovnaní s fosforyláciou v rodičovských bunkách SNU620. OCR však nebola významne znížená v rezistentných bunkách. Možným vysvetlením tohto rozporu je plasticita živín rakovinových buniek pre cyklus TCA, to znamená, že aminokyseliny alebo acetyl-CoA odvodený od mastných kyselín, nielen acetyl-CoA odvodený od glukózy, by mohli dodávať substráty do cyklu TCA [37 V korelácii s tým 5FU-rezistentné rakovinové bunky žalúdka podporujú kmeň prostredníctvom mitochondriálnej oxidácie mastných kyselín [38]. Okrem toho rezistencia voči 5FU súvisí so zvýšenou mitochondriálnou hmotou a aktivitou, vrátane expresie enzýmov elektrónového transportného reťazca (ETC) a spotreby kyslíka [39,40]. Zamerali sme sa teda na moduláciu LDHA, aby sa resenzibilizovala rezistencia na 5FU. Na základe našich výsledkov inhibícia aktivity LDHA oxamátom alebo CA úspešne potlačila rast rezistentných buniek SNU620/5FU a resenzibilizovala ich na liečbu 5FU. Tieto zistenia ukázali dobrú koreláciu s výsledkami predchádzajúcich štúdií, ktoré uviedli, že genetická alebo farmakologická inhibícia LDHA úspešne znížila rezistenciu na chemoterapiu vrátane 5FU [19,41,42]. Predpokladali sme teda, že inhibícia LDHA môže byť dostatočná na potlačenie rezistencie voči 5FU v bunkách SNU620/5FU.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Niekoľko syntetických molekúl, ako napríklad oxamát, FX11, PSTMB a GNE-140, sa osvedčilo ako inhibítory LDHA s malými molekulami [11,43]. Spomedzi nich bol FX11 hlásený ako senzibilizátor na chemoterapiu u rezistentných nádorových buniek [44]. Napriek tomu, že mnohé inhibítory LDHA sú predmetom skúmania z hľadiska schválenia ako nových protirakovinových liekov, žiadny z nich ešte nebol schválený. Na vytvorenie nových inhibítorov LDHA je teda potrebných viac kandidátov podobných liekom [45]. Prírodné zlúčeniny sa považujú za potenciálne zdroje protirakovinových liekov, najmä pri prekonávaní chemorezistencie ako kombinovanej terapie [46,47]. Zameranie sa na metabolizmus rakoviny, najmä metabolizmus glukózy, prírodnými produktmi získanými z rastlín je preto novým výskumným trendom pre vývoj nových protirakovinových terapeutík [48].

Ďalej niekoľko správ naznačilo, že prírodné produkty, ako je gosypol, galloflavín, krocetín, stroj A a EGCG, sú silnými inhibítormi LDHA [43,49,50]. Hoci spomedzi nich má gosypol najsilnejší inhibičný účinok na LDHA (IC50=9,8 uM), inhibuje tiež aktivitu LDHB, ktorá premieňa laktát na pyruvát [51]. Naše výsledky ukázali, že EGCG, osvedčený inhibítor LDHA a senzibilizátor na chemoterapiu 5FU [22-25], má inhibičné účinky na aktivitu LDHA aj LDHB. Medzi inhibítory LDHA odvodené od prírodného produktu, ktoré vykazujú inhibičné aktivity špecifické pre LDHA, ako je stroj A(IC50 =84 μM）, crocetín （IC50 =54.9 μM） a CA （IC{{13} },69 μM）【49,50】, CA vykázala najlepší supresívny účinok na aktivitu LDHA vzhľadom na hodnotu ICsn. Hoci chemické štruktúry CA a EGCG sú veľmi podobné s výnimkou dodatočnej časti kyseliny galovej, ich inhibičné selektivity boli Okrem toho, napriek tomu, že CA je najjednoduchšia zlúčenina v porovnaní so svojimi derivátmi, vykazuje najlepší inhibičný účinok na produkciu laktátu aj aktivitu LDHA. Preto by sa mala vykonať rozsiahla štúdia vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou, aby sa preukázalo, že CA je potenciálnu novú kostru pre vývoj špecifických a silných inhibítorov LDHA.

EGCG je známe ako kompetitívny inhibítor NADPH. Okrem toho EGCG inhibuje translokáciu a reprodukciu NADPH oxidázy [52-54]. Podľa výsledkov molekulárneho modelovania sa však CA a EGCG štrukturálne nachádzajú na rôznych miestach (obrázok 3A, B). Okrem toho nepreukázali koreláciu v špecificite v inhibícii aktivity LDHA a LDHB, ktoré využívajú NADH a NAD plus ako kofaktor, resp. Z týchto údajov sme predpokladali, že CA nemá žiadnu priamu koreláciu s EGCG v mechanizme konkurencie s NAD(P)H. Mimochodom, inhibícia LDHA niekoľkými inhibítormi, ako sú FX11, GSK 2837808A, NCI-737 a NCI-006, znížila produkciu NADt a zvýšila akumuláciu NADH, čím sa znížil pomer NAD plus /NADH[16,17,55]. Apoptóza indukovaná dráhou poškodenia DNA závislou od p53/NAD je tiež vyvolaná inhibíciou LDHA pomocou siRNA alebo chemického inhibítora, NH-2 [56]. Signálna dráha GCN2-ATF4 bola tiež hlásená ako ďalší mechanizmus zodpovedný za apoptotickú bunkovú smrť indukovanú inhibítorom LDHA, GSK 2837808A [17]. Keďže pomer NAD/NADH hrá kľúčovú úlohu pri redoxnej homeostáze a bunkovej proliferácii [5758], CA ako inhibítor LDHA môže ovplyvniť rakovinové bunky rezistentné voči 5FU prostredníctvom modulácie pomeru NAD plus/NADH.

CA indukovala bunkovú smrť v rodičovských SNU620 aj 5FU-rezistentných SNU620/5FU bunkách. Bunková smrť indukovaná CA však bola závislá od LDHA prostredníctvom deplécie shRNA v bunkách SNU620/5FU. Okrem toho spoločná liečba CA a 5FU ukázala ďalšie protirakovinové účinky na bunky rezistentné na 5FU. Ako už bolo uvedené [16,59], inhibícia LDHA zvyšuje ROS a následne potláča rast rakovinových buniek. Keď bola inhibovaná LDHA, energetický metabolizmus sa premenil z glykolýzy na cyklus TCA a mitochondriálnu oxidačnú fosforyláciu [60]. Rakovinové bunky teda produkujú viac ROS, čo vedie k poškodeniu mitochondriálnej membrány a mitochondriálne indukovanej apoptóze [61,62]. V dobrej zhode s predchádzajúcimi štúdiami, CA indukuje apoptotickú bunkovú smrť prostredníctvom mitochondriálnej ROS-dependentnej dráhy. Zvýšená schopnosť obrany proti ROS a znížené apoptotické signály sú bežnými vlastnosťami chemorezistentných rakovinových buniek, najmä v bunkách rezistentných na 5FU 3,63]. Okrem toho zmeny v metabolizme rakoviny, najmä v metabolizme glukózy, tiež vedú k rezistencii na chemoterapiu prostredníctvom zmeny bunkových aktivít, ako je aberantná oprava DNA, zvýšená autofágia, znížená apoptóza, obrana proti ROS a zvýšená sekrécia exozómov [9,64,651 . Zacielenie na glykolytické enzýmy, vrátane LDHA, pomocou CA teda môže byť alternatívnou stratégiou na prekonanie chemorezistencie, najmä pri rakovine žalúdka rezistentnej na 5FU. Vo všeobecnosti sú rýchlo sa deliace malígne nádory v porovnaní s normálnym tkanivom vysoko citlivé na inhibítory syntézy DNA vrátane 5FU. Niektoré rakovinové bunky si však môžu vyvinúť rezistenciu na liečbu prostredníctvom niekoľkých mechanizmov, ako už bolo opísané [34-36]. Súbežná liečba bioaktívnymi zlúčeninami a konvenčnou chemoterapiou má v porovnaní s jednou zlúčeninou vyšší účinok na spomalenie rozvoja rezistencie |66. Preto by biologické účinky špecifických fytochemikálií s preukázanými cytotoxickými účinkami podávaných s konvenčnou chemoterapiou na zacielenie na širšiu škálu signálnych dráh v rakovinových bunkách, vrátane rakovinového metabolizmu a mitochondriálnych funkcií, mali byť lepšie ako jednotlivé zlúčeniny pri liečbe rakoviny, pretože môžu oneskoriť rozvoj rezistencie [67]. V tejto štúdii kombinácia CA a 5FU preukázala vyššiu inhibíciu životaschopnosti buniek v porovnaní s inhibíciou jediného ošetrenia. Okrem toho sme demonštrovali, že inhibícia aktivity LDHA a následná mitochondriálna apoptóza sprostredkovaná ROS môže byť mechanizmom, ktorý je základom senzibilizačného účinku CA na bunky rezistentné na 5FU (obrázok 7).

Okrem účinnosti a špecifickosti inhibície LDHA je CA bezpečnejšia ako predtým zavedené inhibítory LDH odvodené od prírodných produktov. Navyše, CA je dobre známa chemická zložka zeleného čaju a jej bezpečnosť a farmakodynamické vlastnosti boli potvrdené v predchádzajúcich štúdiách [68-70]. Presné hodnotenie toxicity súbežného podávania CA a 5FU však ešte nebolo vykonané. Okrem toho sa v tejto štúdii neskúmala in vivo účinnosť CA v rakovinových bunkách rezistentných na 5FU. Predchádzajúce štúdie však uvádzajú in vivo protirakovinovú účinnosť CA a jej derivátov na prekonanie chemorezistencie, vrátane rezistencie voči 5FU pri ľudskej rakovine žalúdka a hrubého čreva [71-77]. V tejto štúdii sme sa zamerali na inhibíciu LDHA ako hlavný molekulárny mechanizmus CA na prekonanie rezistencie na 5FU. Preto, aby sa vyvinul CA ako nový adjuvans pre chemorezistentné rakovinové bunky, in vivo účinnosť a bezpečnosť súbežnej liečby CA a 5FU by sa mala vyhodnotiť prostredníctvom rozsiahlych štúdií na zvieratách, vrátane modelov xenoštepov a dobrých laboratórnych hodnotení toxicity.

4. Materiály a metódy

4.1.Materiály

Protilátky proti poly(ADP-ribóza)polymeráze, kaspáze-3 a kaspáze-9 boli zakúpené od spoločnosti Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Protilátky proti LDHA, glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáze (GAPDH) a PDHA1 boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a protilátky proti fosforu-PDHA1 a PDK3 boli zakúpené od Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, USA). Ďalej protilátky proti PDK2 a PDK4 boli zakúpené od Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), protilátky proti PDK1 boli získané od Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) a protilátky proti B-bunkám lymfóm-2(Bcl-2) a proteín X spojený s Bcl{14}} boli zakúpené od spoločnosti Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX bol zakúpený od spoločnosti Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Chemikálie a činidlá vrátane 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidu (MTT),4',{{22} }diamidino-2-fenylindol, oxamát, nikotínamid adenín dinukleotid, CA a deriváty CA (EC GC, EGC a EGCG) boli zakúpené od spoločnosti Merck (Merck, Darmstadt, Nemecko). -nikotínamidadeníndinukleotid (oxidovaná forma) bol zakúpený od Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan).

4.2. Bunková kultúra

Ľudská rakovina žalúdka SNU620, SNU620/5FU a AGS, rakovina pankreasu Panic-1 a MIA PaCa-2 a bunky rakoviny hrubého čreva LS174T a RKO boli získané z Korean Cell Line Bank (KCLB, Soul, Kórea Bunky SNU620, SNU620/5FU, AGS a LS174T sa kultivovali v médiu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) (Welgene, Daegu, Kórea), doplnenom 10 percentami tepelne inaktivovaného fetálneho bovinného séra (FBS )(Gibco, New York, NY, USA) a 1% penicilín/streptomycín (Invitrogen) a bunky Panc-1, MIA PaCa-2 a RKO boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (Welgene s obsahom 10 percent tepelne inaktivovaného FBS a 1 percenta penicilínu/streptomycínu. Všetky bunky boli kultivované vo zvlhčenom CO, inkubátore pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2.

4.3. Test bunkovej životaschopnosti

Hladiny cytotoxicity CA a 5FU v bunkách SNU620 a SNU620/5FU sa merali pomocou testu MTT. Bunky sa kultivovali v 24-jamkových platniach (2x 104 buniek/jamka) s uvedenými koncentráciami CA a 5FU počas uvedeného dňa. Potom sa do každej jamky pridal roztok MTT (2,0 mg/ml) a nasledovalo 3-4 h inkubácie pri 37 stupňoch a 5 percentách CO v inkubátore bunkovej kultúry. Kultivačné médium sa následne odstránilo a absorbancia formazanových kryštálov sa stanovila zo živých buniek. Na rozpustenie formazanových kryštálov sa pridal DMSO a meralo sa pri 540 nm s použitím Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.4. Miera extracelulárnej acidifikácie (ECAR) a miera spotreby kyslíka (OCR)

ECAR a OCR, indikujúce bunkové rýchlosti glykolýzy a oxidatívnej fosforylácie, v uvedenom poradí, boli monitorované pomocou analyzátora Seahorse XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), ako už bolo opísané [78,79]. Stručne, 60,000 buniek SNU620 alebo SNU620/5FU na jamku sa naočkovalo na šesťjamkové doštičky Seahorse XF v médiu RPMI doplnenom 1 percentom penicilínu/streptomycínu. Po 30 minútach inkubácie sa médium z každej jamky nahradilo 80 ul predhriateho média bez séra s 5 mM oxamátom, štandardným inhibítorom LDH [11]. Bunky sa potom inkubovali pri teplote 37 °C počas 24 hodín. Po inkubácii sa médium z každej jamky nahradilo 180 ul predhriateho média XFbase (obsahujúceho 10 mM glukózu, 2 mM glutamín a 1 mM pyruvát sodný; pH 7,4) na meranie ECAR a OCR. Výsledky boli analyzované pomocou softvéru Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5. Kvantitatívnej reverznej transkripčno-polymerázovej reťazovej reakcie (qRT-PCR)

Celková RNA bola extrahovaná pomocou súpravy RiboEx Total RNA Extraction Kit (GeneAll Biotechnology, Soul, Kórea) a cDNA bola syntetizovaná pomocou súpravy reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI, USA). Pri reverznej transkripcii sa použil 1 ug celkovej RNA a celkové množstvo syntetizovanej cDNA je 20 ul. Každá súprava sa použila podľa pokynov výrobcu Kvantitatívna PCR sa uskutočnila pomocou systému StepOneTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), s Real HelixgPCR Kit (NanoHelix, Daejeon, Kórea), pre 40 cyklov pozostávajúcich z 15 s pri 95 stupňoch Cand 1 min pri 60 stupňoch Relatívne hladiny mRNA boli normalizované na hladiny 18S ribozomálnej RNA, ktorá slúžila ako endogénna kontrola. Sekvencie primérov používané pre qRT-PCR sú uvedené v tabuľke 1.

4.6. Analýza Wester" Blot

Bunky sa premyli 1 x PBS a celkové proteíny sa extrahovali z buniek pomocou RIPA pufra a 1 % NP-40 lyzačného pufra obsahujúceho koktailové tablety inhibítora proteázy (Roche, Basel, Švajčiarsko). Koncentrácie každého proteínu sa merali pomocou proteínového testu Bio-Rad. Rovnaké množstvá proteínu boli frakcionované z každej vzorky prostredníctvom 8-15 percent SDS-PAGE a potom boli proteíny prenesené na nitrocelulózové membrány (GE Healthcare, Mníchov, Nemecko) elektroforézou. Membrány boli blokované pri izbovej teplote (20-25 stupeň) počas 1 hodiny s použitím 5% odtučneného sušeného mlieka a inkubované s primárnymi protilátkami pri 4 stupňoch cez noc. Následne sa tieto membrány trikrát premyli 1 x Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom počas 10 minút. Špecifické pásy proteínov boli merané pomocou chemiluminiscenčného zobrazovacieho systému (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Expresia proteínov bola upravená pomocou GAPDH. 4.7. Test produkcie laktátu

Produkcia laktátu sa merala v kultivačnom médiu buniek SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T a RKO. Tieto bunky sa inkubovali počas 1 dňa pri 37 stupňoch a kultivačné médium sa následne nahradilo médiom bez fenolovej červene, po čom nasledovala inkubácia počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. Médium každej bunky sa potom vyhodnotilo pomocou komerčnej laktátovej fluorometrickej testovacej súpravy (BioVision, Milpitas, CA, USA).

4.8. Testy aktivity LDHA a LDHB

Na detekciu aktivity LDHA boli uvedené koncentrácie CA inkubované počas 2 0 minút v pufri obsahujúcom 2 mM pyruvát, 20 μM NADH a 20 mM HEPES-K plus （pH 7,2）. Na aktivitu LDHB sa použil pufor obsahujúci 1 M Tris-HCI (pH 8,0), 25 mM NAD plus a 2 M L-laktát sodný. V stručnosti, 10 nanogramov každého z purifikovaných rekombinantných LDHA a LDHB proteínov sa použilo na in vitro testy aktivity LDHA a LDHB. Jeden mikrogram celkového proteínu z bunkových lyzátov sa použil na intracelulárne testy aktivity LDHA a LDHB ako zdroj enzýmu. Fluorescencia NADH pri excitačnej vlnovej dĺžke 340 nm a emisnej vlnovej dĺžke 460 nm bola detegovaná pomocou spektrofluorometra (Spectramax M2; Molecular Devices), ako už bolo opísané [80]. Aktivita LDHA bola meraná zníženým množstvom NADH, zatiaľ čo aktivita LDHIB bola hodnotená meraním množstva NADH konvertovaného z NAD plus.

4.9. Interakcia proteín-malá molekula

Interakcia medzi proteínom a malými molekulami bola predpovedaná pomocou programu Pyrex. V Pyrexe sa použili molekuly LDHA (PDB ID: 1110) a 2D štruktúry CA a EGCG získané z databázy zlúčenín NCBI PubChem. ID CA bolo 9064 a ID EGCG bolo 65064. Relatívna distribúcia povrchového náboja bola znázornená s kyslou oblasťou červenou, bázickou oblasťou modrou a neutrálnou oblasťou bielou. Vodíkové väzby v komplexoch LDHA s CA alebo EGCG boli znázornené ako čierne bodkované čiary. Sekvencie boli získané od UniProt (https://www.uniprot.org, prístupné 9. novembra 2020) s prístupovými číslami P00338 (LDHA).

4.10. Transfekcia krátkej vlásenkovej RNA (shRNA)

Použili sa falošný vektor pLKO.1 a vektor LDHA zacielený na shRNA, ako už bolo opísané [50]. Bunky sa naočkovali na šesťjamkové doštičky (2 x 10° bunky/jamku) a inkubovali sa cez noc. Bunky SNU620/5FU boli transfekované s použitím polyetylénimínu (PED) (Polyplus-transfection, llkirch, Francúzsko), pomer génu a PEI je 1:3. Potom boli transfekované bunky ošetrené 1 ug/ml puromycínu počas 1 týždňa. Kontrolná bunková línia sa vytvorila po infekcii zmiešaným plazmidom.

4.11. Nadmerná expresia LDHA

Plazmid pDEST27-LDHA bol skonštruovaný subklonovaním LDHA cDNA (zakúpenej od Korea Human Gene Bank, Daejeon, Kórea) do vektorov pDEST27(Invitrogen). Boli uskutočnené dve sady subklonovania pre LDHA. Na rekonštrukciu LDHA boli bunky SNU620/5FU-shLDHA transfekované pDEST27-LDHA a prázdnym plazmidom pDEST27. Stručne povedané, bunky sa kultivovali až do 70 percent konfluencie. Potom boli bunky ošetrené zmesou obsahujúcou 3 ug DNA a Lipofectamine 2000 (Invitrogen) počas 48 hodín. Po inkubácii boli bunky selektované s 200 ug/ml G418 počas 1 týždňa. Potom, aby sme potvrdili účinnosť transfekcie, sme vykonali test Western blot.

4.12. Analýza apoptózy

Apoptotické bunky boli detegované pomocou Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. V stručnosti, bunky sa naočkovali na šesťjamkové platne (2 x 10 stupňov buniek/jamku) a ošetrili sa uvedenými koncentráciami CA a 5FU počas 2 dní. Po 2 dňoch liečby sa bunka premyla 1 x PBS. Bunky boli suspendované v 500 ul väzbového pufra a ošetrené 5 ul anexínu V-FITC a 5 ul propidium jodidu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), po čom nasledovala inkubácia počas 15 minút pri teplote miestnosti v tma. Intenzity fluorescencie sa skúmali pomocou BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Test detekcie mitochondriálnych reaktívnych druhov kyslíka (ROS).

Produkcia mitochondriálnych ROS bola detekovaná pomocou MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Thermo Fisher Scientific). Bunky sa naočkovali na šesťjamkové doštičky (2x 10° bunky/jamku) a Mito-TEMPO (20 uM; Sigma-Aldrich） bola vopred ošetrená 1 hodinu pred liečbou liekom. Bunky sa resuspendovali v 1 ml 1 x fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS), potom sa pridalo 5 uM MitoSOX. Bunky sa potom inkubovali 10 minút pri 37 stupňoch. Intenzita fluorescencie sa analyzovala pomocou BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Fluorescenčný obraz bol detegovaný fluorescenčným mikroskopom (zväčšenie, 100x) (mikroskop Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko).

4.14. Farbenie jadra DAPI

SNU620/5FU sa naočkoval na 24-jamkovú doštičku (5 x 104 buniek/jamku) a ošetril sa s uvedenými koncentráciami CA a 5FU počas 48 hodín. Po premytí 1 x PBS boli bunky resuspendované v 1- ml 1 x PBS. Bunky sa potom farbili 4 ug/ml DAPI počas 30 minút pri teplote miestnosti a skúmali sa pod fluorescenčným mikroskopom (zväčšenie, 200x) (Carl Zeiss).

4.15. Štatistická analýza

Výsledky bunkovej životaschopnosti, produkcie laktátu, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB aktivít, apoptózy a mitochondriálnych ROS boli uvedené vo vzťahu ku kontrolným hodnotám a vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru troch nezávislých experimentov. Rozdiely nad priemernou hodnotou každej skupiny boli analyzované Studentovým t-testom, zatiaľ čo rozdiely medzi skupinami boli analyzované jednosmernou analýzou rozptylu s Tukeyho post hoc testom pomocou GraphPad Prism (Version5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

5. Závery

Celkovo vzaté, bunky rezistentného karcinómu žalúdka SNU620/5FU majú glykolytické fenotypy, vrátane zvýšenej produkcie laktátu a vyššej expresie LDHA ako v rodičovských bunkách SNU620. Obmedzenie glykolýzy pomocou CA, ako LDHA-špecifického inhibítora, senzibilizuje bunky SNU620/5FU na 5FU. Okrem toho spoločná liečba CA a 5FU zvýšila mitochondriálne ROS a apoptotickú bunkovú smrť v bunkách rezistentných na 5FU. Naše zistenia naznačujú, že CA môže byť sľubným kandidátom na vývoj adjuvantného lieku, ktorý znižuje rezistenciu na chemoterapiu založenú na 5FU obmedzením aktivity LDHA.

Doplnkové materiály: Nasledujúce materiály sú dostupné online na https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, Obrázok S1: Účinok 5FU na životaschopnosť buniek SNU620/5FU, Obrázok S2: Rast SNU620 a bunky SNU620/5FU merané počítaním buniek, Obrázok S3: Hladiny produkcie laktátu buniek SNU620 a SNU620/5FU, Obrázok S4: Expresie izotypov PDK v bunkách SNU620 a SNU620/5FU, Obrázok S5: Účinok oxamátu na životaschopnosť buniek SNU620 a Bunky SNU620/5FU, Obrázok S6: Účinky EGCG na aktivity LDHA a LDHB, Obrázok S7: Účinky katechínu (CA) na hladiny expresie proteínov p-PDHA1, PDHA1 a PDKs, Obrázok S8: Analýza izotermickej titračnej kalorimetrie (ITC) LDHA a CA, Obrázok S9: Expresia LDHA v bunkách SNU620/5FU transfekovaných shLDHA, Obrázok S10: Meranie glykolytických fenotypov a životaschopnosti buniek v rôznych rakovinových bunkách, Obrázok S11: Nespracované údaje testu Western blot.

Tento článok je prevzatý z Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms