Aktívna zložka Cistanche: Echinakozid s protizápalovým inhibičným a neuroprotektívnym účinkom

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

echinakozid, an Aktívne Konštituent z Cistanche Herba, Namáha a Neuroprotektívne Effect v a Kainic Kyselina Potkan Model podľa InhibíciaZápalové Procesy a Aktivuje sa a Akt/GSK3 Chodník

Cheng Wei Lu,a,b Hsi Lung Hsieh,c,d Tzu Yu Lin,a,b Ting Yang Hsieh,e Shu Kuei Huang,a a Su Jane Wang^*,f,g

Echinakozidje hlavnou zlúčeninou cistanche Herb a má aktivitu inhibujúcu uvoľňovanie glutamátu v mozgu. Vzhľadom na zapojenie excitotoxicity spôsobenej masívnym glutamátom do patofyziológie epilepsie sme skúmali antiepileptický účinok echinakozidu na záchvaty vyvolané kyselinou kainovou u potkanov. Potkanom boli podané intraperitoneálneechinakozid30 minút pred intraperitoneálnou injekciou kyseliny kaínovej. Výsledky ukázali, že vzorce správania podobné záchvatom vyvolané kyselinou kainovou, zvýšené koncentrácie glutamátu, spôsobili stratu neurónov a mikrogliálnu aktiváciu a stimulovali expresiu prozápalového cytokínového génu v hipokampe. Zistilo sa, že tieto alternácie vyvolané kyselinou kainovou sú zoslabenéechinakozidpredúprava. Okrem toho znížená fosforylácia Akt a glykogénsyntáza kinázy 3 (GSK3), ako aj expresia Bcl{2}} v hipokampe, boli zvrátené predošetrením echinakozidom. Tieto výsledky demonštrujú, že echinakozid uplatňuje svoje antiepileptické a neuroprotektívne účinky na modeli potkanov s kyselinou kainovou prostredníctvom potlačenia zápalovej reakcie a aktivácie signalizácie Akt/GSK3. Preto táto štúdia naznačuje, že echinakozid je potenciálne užitočný pri prevencii epilepsie.

Kľúčové slová:echinakozid; kyselina kaínová; epilepsia; neuroprotektívny účinok; hippocampus

Echinakozid v cistanche

Epilepsia je celosvetovo rozšírená porucha mozgu. Postihuje viac ako 65 miliónov ľudí, takmer 1 percento svetovej populácie.1) Syntetické antiepileptiká sú široko dostupné na farmaceutickom trhu; tieto lieky sú však účinné len u 60–70 percent pacientov a majú nepriaznivé vedľajšie účinky.2–4) Existuje teda nenaplnená potreba hľadať účinnejšie a bezpečnejšie liečivo. Potenciálnym zdrojom takýchto zlúčenín sú liečivé rastliny.^5,6)

V tradičnej čínskej bylinnej medicíne sa Cistanche Herba už dlho používa na liečbu epilepsie.7,8)Echinakozidje hlavnou zložkou Cistanche Herba9) a má mnoho farmakologických vlastností, ako je antioxidačná, protizápalová, antineoplastická, hepatoprotektívna a imunomodulačná aktivita.10,11) Okrem toho sa uvádza, žeechinakozidmôže vstúpiť do mozgu a vyvolať neuroprotekciu.12–16) Už sme predtým dokázali, že echinakozid znižuje uvoľňovanie glutamátu v cerebrokortikálnych nervových zakončeniach potkanov.17) Pretože glutamát je hlavným excitačným neurotransmiterom v mozgu cicavcov a hrá kľúčovú úlohu v patofyziológii epilepsie, 18, 19) sme navrhli, že echinakozid má antiepileptický účinok. Na objasnenie tejto hypotézy sa v tejto štúdii použil model potkana s kyselinou kainovou.

Kyselina kainová je derivát glutamátu a jej jediná systémová injekcia hlodavcom má za následok záchvaty, neurozápal a neuronálnu degeneráciu alebo smrť na selektívnej populácii neurónov v mozgu.20–22) Tieto patologické zmeny sú podobné epilepsii spánkového laloku u ľudí.23 ,24) Podávanie kyseliny kainovej hlodavcom sa všeobecne považuje za indukciu adekvátneho modelu epilepsie. Doteraz žiadna štúdia neskúmala antiepileptické a neuroprotektívne vlastnostiechinakozidna zvieracom modeli s injekciou kyseliny kaínovej. Naša štúdia sa preto zameriava na vyhodnotenie účinku a jeho možného mechanizmuechinakozidpredbežné podanie potkanom liečeným kyselinou kainovou.

MATERIÁLY A METÓDY

Zvieratá a záchvatová aktivita

Počas štúdie sa použili samce potkanov Sprague-Dawley (BioLASCO, Taipei, Taiwan) s hmotnosťou 150 až 200 g. Potkany boli náhodne rozdelené do štyroch skupín nasledovne: i) Skupina 1: skupina ošetrená dimetylsulfoxidom (kontrola); ii) Skupina 2: skupina ošetrená kyselinou kainovou; iii) Skupina 3:echinakozid10 mg/kg plus skupina kyseliny kaínovej; iv) Skupina 4:echinakozid50 mg/kg plus skupina kyseliny kaínovej. Echinakozid (ChemFaces, Wuhan, PRC) bol injikovaný (intraperitoneálne podanie) 30 minút pred intraperitoneálnou injekciou kyseliny kainovej (15 mg/kg). Záchvatová aktivita bola hodnotená počas 4 hodín po injekcii kyseliny kainovej podľa Racineho stupnice. Výbor pre starostlivosť a používanie zvierat na Katolíckej univerzite vo Fu Jen a vykonávané v súlade s vydanými protokolmi, ktoré sa riadili Príručkou pre starostlivosť a používanie laboratória Národného inštitútu zdravia (NAC 2011).

Stanovenie hladín glutamátu

Štyri hodiny po ošetrení kyselinou kainovou sa potkany usmrtili dekapitáciou. Celý mozog sa vypreparoval a hipokampus každého potkana sa odobral na analýzu. Koncentrácia glutamátu v tkanive mozgového hipokampu bola stanovená podľa metód opísaných v predchádzajúcich štúdiách.28,29)

Neutrálna červená a farbenie Fluoro-Jade B

Tri dni po injekcii kyseliny kaínovej boli potkany anestetizované pomocou chloralhydrátu (650 mg/kg) a transkardiálne perfundované fixačným roztokom obsahujúcim 4 percentá paraformaldehydu v 0,1 M roztoku fosfátového pufra (PBS, pH 7,4). Mozgy boli odstránené ihneď po perfúzii a uskladnené v 4 percentnom paraformaldehyde cez noc pri 4 stupňoch. Po postfixácii boli mozgy ponorené do 30 percent sacharózy pri 4 stupňoch na 24 hodín. Vzorky sa rýchlo zmrazili a pomocou zmrazeného mikrotómu sa narezali rezy s hrúbkou 30-µm. Voľne plávajúce rezy boli zafarbené neutrálnou červenou (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a Fluoro-Jade B (Millipore, CA, USA). Fluoro-Jade B-pozitívne bunky v oblasti CA3 hipokampu boli stanovené tak, ako bolo opísané vyššie.^30,31)

Imunohistochémia

Rezy boli premyté {{0}},1 M PBS a blokované 0,5 percentným normálnym kozím sérom v {{20}},1 M PBS počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Inkubácia primárnej protilátky (myšacia monoklonálna anti-OX{8}} protilátka, 1:1000; AbD Serotec, Oxford, UK) sa uskutočnila dve noci pri 4 stupňoch. Po opakovanom premytí PBS boli rezy inkubované s biotinylovaným anti-myším imunoglobulínom G (IgG) (1:200) počas 90 minút, ošetrené roztokom komplexu avidín-biotín (ABC) (1:1000) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. a reagovali s 0,025 percentami 3,3'-diaminobenzidínu a 0,0025 percentami H202, kým sa nedosiahla požadovaná intenzita zafarbenia. Rezy boli pripevnené na sklíčka pomocou štandardných protokolov. Zafarbené sklíčka sa skúmali a zobrazovali pod mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonsko).31) Analýza tela mikrogliálnej bunky a dĺžky procesu sa uskutočnila pomocou ImageJ.³²)

Transmisná elektrónová mikroskopia Transmisná elektrónová mikroskopia

33) V stručnosti, oblasť CA3 hipokampu bola odstránená a fixovaná v pufri obsahujúcom 4 percentá paraformaldehydu a 2,5 percenta glutaraldehydu pri 4 stupňoch počas 24–36 hodín. Po premytí PBS boli oblasti CA3 dodatočne fixované v 1% oxide osmičelom počas 2 hodín, dehydratované etanolom a zaliate do epoxidovej živice. Ultratenké rezy (70 nm) boli pripravené s použitím ultramikrotómu (EM UC7, Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko). Rezy boli zafarbené octanom uranylom a citrátom olovnatým a pozorované pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (Model JEM-1400, JEOL Ltd., Tokio, Japonsko).

Kvantitatívna PCR v reálnom čase

Extrakcia RNA a kvantitatívna PCR v reálnom čase sa uskutočnili tak, ako bolo opísané vyššie.34,35) Celková RNA sa extrahovala z hipokampu pomocou miRNA Isolation Kit mirVana™ (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) podľa protokolu výrobcu. Genómová DNA sa odstránila inkubáciou s deoxyribonukleázou (DNázou) I. cDNA sa syntetizovala pomocou (súprava reverzného transkripčného systému NoScript; Promega, Madison, WI, USA) a použila sa na kvantitatívne reálne kvantitatívne meranie SYBR Green (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko). časová PCR amplifikácia so špecifickými primérmi pomocou systému LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Protokol pozostával z počiatočného denaturačného kroku pri 95 stupňoch počas 3 minút, po ktorom nasledovalo 45 cyklov denaturácie pri 95 stupňoch počas 10 s, žíhanie pri 56 stupňoch počas 30 s. Hladiny mRNA každého cieľového génu boli normalizované na hladiny mRNA glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH). Záhybová indukcia sa vypočítala pomocou metódy 2-AACT, ako je opísané v predchádzajúcej štúdii.³⁴)

Imunoblotting

Dvadsať mikrogramov proteínových extraktov z hipokampov sa oddelilo 10-percentnou elektroforézou na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE), po ktorej nasledoval elektroforetický prenos na polyvinylidéndifluoridovú (PVDF) membránu. Membrána bola blokovaná použitím 5 % odstredeného mlieka počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a inkubovaná s príslušnými protilátkami v 1 % odstredenom mlieku cez noc pri 4 stupňoch, po čom nasledovala inkubácia so sekundárnou protilátkou počas 1 hodiny. Primárne protilátky boli králičie monoklonálne protilátky namierené proti Akt (1: 2000), pAktSer473 (1: 2000), glykogénsyntáza kináza 3 (GSK3) (1: 2000), pGSK3 Ser9 (1: 500), Bcl-2 ( 1: 1000) a -aktín (1: 2000) získaný od Cell Signaling Technology (MA, USA). Sekundárna peroxidáza-konjugovaná kozia anti-králičia protilátka (1:5000) bola získaná od Santa Cruz (CA, USA). Pásy boli vizualizované zvýšenou chemiluminiscenciou (Amersham, Buckinghamshire, UK) s použitím gélového zobrazovacieho analytického systému. Intenzita každého pásu bola meraná pomocou softvéru Syngene (Synop tics, Cambridge, UK).

Štatistická analýza

Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Štatistická analýza sa uskutočnila dvojstranným Studentovým t-testom pri porovnávaní dvoch skupín a jednosmernou analýzou ANOVA s Tukeyho viacnásobnými porovnaniami post hoc pri porovnávaní viac ako dvoch skupín. Analýza bola dokončená pomocou softvéru SPSS (verzia 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). p<0.05 was="" considered="" statistically="">

VÝSLEDKY

Účinok echinakozidu na záchvaty vyvolané kyselinou kainovou a zvýšenie hladín glutamátu v hipokampe

Na vyhodnotenie neuroprotektívneho účinkuechinakozidproti excitotoxicite vyvolanej kyselinou kainovou boli potkany vopred ošetrenéechinakozid(5, 10 a 50 mg/kg, intraperitoneálne podanie) počas 30 minút pred intraperitoneálnou injekciou kyseliny kaínovej (15 mg/kg). Intraperitoneálna injekcia kyseliny kainovej (15 mg/kg) viedla k záchvatom s latenciou a skóre 92,5 ± 5,3 min, respektíve 4,9 ± 0,1 (obr. 1A, B). Výrazné zvýšenie latencie záchvatov[F(2, 43)=40.2, s.<0.01; fig.="" 1a]="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" seizure="" score="" [f(2,="" 40)="21.5,"><0.001; fig.="" 1b]="" were="" observed="" in="" echinacoside="" (10="" or="" 50="" mg/kg)-pretreated="" rats.="" however,="" echinacoside="" at="" 5="" mg/kg="" had="" no="" significant="" effect="" on="" seizure="" latency="" and="" score="" (p="">0.05; Obr. 1A, B). Vzhľadom na silné zoslabenie záchvatovej aktivity, ktoré bolo pozorované pri dávke 10 alebo 50 mg/kg echinakozidu, sa tieto dve dávky echinakozidu použili v nasledujúcich experimentoch na vyhodnotenie mechanizmov, ktoré sú základom schopnosti echinakozidu inhibovať záchvaty vyvolané kyselinou kainovou. Obrázok 1C ukazuje, že zvýšenie hladín glutamátu v hipokampe bolo zaznamenané u potkanov liečených kyselinou kainovou po 4 hodinách v porovnaní so skupinou liečenou dimetylsulfoxidom (kontrola; p<0.001). however,="" decreased="" hippocampal="" glutamate="" levels="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" (10="" or="" 50="" mg/kg)="" [f(3,="" 16)="6.1,"><0.01; fig.="">

Účinok echinakozidu na neuronálne poranenia vyvolané kyselinou kainovou v oblasti CA3 hippocampu

Stupeň poškodenia neurónov bol hodnotený 3 dni po injekcii kyseliny kainovej prostredníctvom neutrálneho červeného farbenia alebo Fluoro-Jade B na detekciu prežívajúcich neurónov a degenerujúcich neurónov. Neutrálne červené farbenie odhalilo zjavnú stratu neurónov v CA3 potkanov s injekciou kyseliny kaínovej v porovnaní s potkanmi liečenými dimetylsulfoxidom (kontrola; p<0.001; figs.="" 2a,="" c).="" however,="">echinakozidpredbežná liečba (10 alebo 50 mg/kg) účinne znížila stratu neurónov vyvolanú kyselinou kainovou pri CA3 [F(2, 13)=11.6, s.<0.001; figs.="" 2a,="" c].="" similarly,="">echinakozid- liečené zvieratá vykazovali zníženú fluorescenciu Fluoro-Jade B FL v oblastiach CA3 hipokampu po injekcii kyseliny kainovej (p<0.001), compared="" with="" the="" strong="" damage="" observed="" in="" kainic="" acid-injected="" rats="" [f(2,="" 24)="6.9,"><0.001; figs.="" 2b,="" d].="" in="" addition,="" transmission="" electron="" microscopy="" shows="" that="" neuronal="" injury="" in="" ca3="" was="" not="" obvious="" in="" the="" dimethylsulfoxide-treated="" (control)="" group.="" however,="" in="" the="" kainic="" acid-treated="" group,="" nerve="" cells="" had="" ultrastructural="" changes.="" nerve="" cells="" exhibited="" autophagosome="" formations,="" deformed="" nuclei="" with="" the="" condensed,="" and="" disruptive="" cell="" plasma="" membrane.="" in="" contrast,="" the="" neuronal="" injury="" in="" the="" echinacoside-pretreated="" group="" was="" apparently="" attenuated="" compared="" with="" the="" kainic="" acid-injected="" rats="" (fig.="">

Účinok echinakozidu na aktiváciu mikroglií indukovanú kyselinou kainovou a génovú expresiu prozápalových zápalov

Cytokíny v hipokampe V modeli pre záchvaty vyvolané kyselinou kainovou a smrť hipokampálnych neurónov je v hipokampe zvýšená mikrogliálna aktivácia a produkcia prozápalových cytokínov.36,37) Aby sa zistilo, čiechinakozidovplyvnila zápalovú odpoveď v hipokampe potkanov s injekciou kyseliny kaínovej, aktivácia mikroglií sa analyzovala pomocou protilátky anti-OX42. U potkanov liečených dimetylsulfoxidom (kontrolná skupina) boli telá mikrogliálnych buniek v oblastiach CA3 malé a ich výbežky dlhé a tenké (obr. 4A). Počet aktivovaných mikrogliálnych buniek v oblasti CA3 u potkanov s injekciou KA sa však výrazne zvýšil, telá mikrogliových buniek sa zväčšili (p<0.01; figs.="" 4a,="" b),="" and="" their="" cellular="" processes="" became="" shorter="" and="" thicker=""><0.001; figs.="" 4a,="" c).="" in="" the="" animals="" pretreated="" with="">echinakozid(10 alebo 50 mg/kg)-predošetrených potkanov, počet aktivovaných mikrogliálnych buniek sa výrazne znížil a telá mikrogliových buniek boli tenké [F(2, 13)=6.2, s.<0.01; fig.="" 4b]="" and="" their="" cytoplasmic="" processes="" were="" ramified="" [f(2,="" 28)="47.5,"><0.001; fig.="" 4c].="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" interleukin-1β,="" interleukin-6,="" and="" tumor="" necrosis="" factor-α="" mrna="" in="" the="" hippocampus="" were="" apparently="" elevated="" at="" 1="" d="" after="" kainic="" acid="" injection,="" compared="" to="" dimethylsulfoxideinjected="" animals="" (control)=""><0.001). however,="" decreased="" mrna="" levels="" for="" these="" pro-inflammatory="" cytokines="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" [interleukin-1β,="" f(3,="" 18)="154.7,"><0.001; interleukin-6,="" f(3,="" 17)="17.9,"><0.001; tumor="" necrosis="" factor-α,="" f(3,="" 16)="31.1,"><0.001; figs.="">

Účinok echinakozidu na pokles hladín hipokampálnej fosfo-Akt, fosfo-glykogénsyntázy kinázy 3 a Bcl-2 indukovaný kyselinou kainovou

Hladiny fosforylovaného Akt (pAkt) (Ser473), fosforylovaného GSK3 (pGSK3) (Ser9) a Bcl-2 boli testované v hipokampe (obr. 6). Podstatné zníženie expresie pAkt, pGSK-3 a Bcl{7}} v hipokampe sa pozorovalo u potkanov liečených kyselinou kainovou po 4 hodinách v porovnaní s potkanmi liečenými dimetylsulfoxidom (kontrola) (p<0.001). however,="" pretreatment="" with="">echinakozid(10 alebo 50 mg/kg) významne zvýšili hladiny pAkt, pGSK3 a Bcl-2 v porovnaní s liečbou samotnou kyselinou kainovou [pAkt, F(3, 19)=69.5, s.<0.001; pgsk3β,="" f(3,="" 17)="60.3,"><0.001; bcl-2,="" f(3,="" 18)="26.1,"><0.001; figs.="">

DISKUSIA

Dôkazy naznačujú, že glutamát hrá kľúčovú úlohu v patofyziológii epilepsie.^17,18) Glutamátergická hypotéza epilepsie naznačuje, že epileptogénny proces súvisí so zvýšenou koncentráciou glutamátu v mozgu a zníženie koncentrácie tohto neurotransmiteru je schopné vyvolať antiepileptický účinok.^38–40) Štúdia z nášho laboratória to preukázalaechinakozidmôže redukovať uvoľňovanie glutamátu z nervových zakončení a naznačuje, že echinakozid má pravdepodobne antiepileptický účinok.17) Tento návrh bol potvrdený v súčasnej štúdii s použitím modelu potkana s injekciou kyseliny kaínovej. Kyselina kainová, derivát glutamátu, sa široko používa na vyvolanie epilepsie v štúdiách na zvieratách, pretože jej neuropatologické a biochemické vlastnosti sú podobné ako u ľudí.^23,24)

Intraperitoneálna injekcia kyseliny kainovej potkanom spôsobuje záchvaty a poškodenie neurónov, najmä v oblastiach CA3 hipokampu.^41–43Okrem toho tieto patologické zmeny produkované kyselinou kainovou súvisia s masívnym uvoľňovaním glutamátu.^41,44,45) V súlade s týmito zisteniami sme pozorovali, že intraperitoneálne podanie kyseliny kainovej (15 mg/kg) vyvolalo záchvatové správanie, zvýšilo hladiny glutamátu v hipokampe a spôsobilo stratu pyramídových buniek v oblasti hipokampu CA3. Tieto patologické zmeny vyvolané kyselinou kainovou boli zoslabené intraperitoneálnou predbežnou liečbouechinakozid(10 alebo 50 mg/kg). Okrem toho poškodenie hipokampálnych nervových buniek CA3 hodnotené ultraštrukturálnym striedaním s transmisnou elektrónovou mikroskopiou bolo zmiernenéechinakozidu potkanov s kyselinou kainovou. Okrem toho bol v bunkách CA3 po podaní kyseliny kainovej pozorovaný zvýšený počet autofagozómov. Predbežná liečba echinakozidom potlačila zvýšenú tvorbu autofagozómov. Predchádzajúce štúdie naznačili, že aktivácia autofágy sa podieľa na neurónovej smrti indukovanej kyselinou kainovou a inhibícia procesu autofágy sa zdá byť neuroprotektívna.^46,47) Hoci mechanizmus, ktorý je základom antiepileptického účinkuechinakozidvyžaduje ďalšie skúmanie, neuroprotektívny účinok echinakozidu na zvieracom modeli s kyselinou kainovou mohol byť výsledkom antiepileptickej aktivity prostredníctvom inhibície glutamátovej excitotoxicity a aktivácie autofágy.

Neurozápal značne prispieva k oneskorenému poškodeniu mozgu po akútnom poranení a má škodlivý vplyv na neurologický výsledok.²⁷) Zápalové reakcie, ako je aktivácia mikroglií a produkcia zápalových cytokínov, boli opísané u ľudskej epilepsie a v experimentálnych modeloch epilepsie.^36,48Okrem toho uvoľňovanie týchto prozápalových cytokínov z aktivovaných mikrogliálnych buniek podporuje poškodenie neurónov v hipokampe vyvolané kyselinou kainovou.^36,37) Ukázali sme, že zatiaľ čo kyselina kainová zvyšuje aktiváciu mikroglií a génovú expresiu prozápalových cytokínov (interleukín-1, interleukín-6 a tumor nekrotizujúci faktor-) v hipokampe, tieto účinky boli potlačenéechinakozidpredúprava. Preto to navrhujemeechinakozidprostredníctvom potlačenia zápalových procesov môže prispieť k jeho antiepileptickým a neuroprotektívnym účinkom na zvieracom modeli s kyselinou kainovou. Ako už bolo pozorované v našich predchádzajúcich štúdiách, viaceré liečivá a prírodné produkty majú aj antiepileptické účinky a neuroprotekciu proti záchvatom vyvolaným kyselinou kainovou prostredníctvom ich protizápalového účinku.^31,33,35)

Je známe, že mnohé proteínkinázové signálne kaskády sú aktivované kyselinou kainovou, ktorá hrá dôležitú úlohu pri neuroprotekcii. Medzi tými, ktoré sa javia ako obzvlášť významné, patrí Akt.^49,50,) Akt sprostredkováva svoje neuroprotektívne účinky aktiváciou rôznych downstream substrátov vrátane GSK-3 a Bcl-2. Akt fosforyluje GSK-3 na Ser9, čo vedie k jeho inaktivácii a posilneniu prežívania neurónových buniek51), pretože aktívna forma GSK-3 aktivuje dráhu mitochondriálnej smrti.^52,53) Bcl-2 je kľúčovým členom rodiny antiapoptotických Bcl-2 a zohráva kľúčovú úlohu pri potláčaní mitochondriálne sprostredkovanej apoptotickej bunkovej smrti. Bcl-2 môže napríklad chrániť integritu mitochondriálnej membrány a blokovať uvoľňovanie cytochrómu C z mitochondrií, čo vedie k prežitiu buniek a inhibícii apoptózy.⁵⁴) Tiež sa uvádza, že nadmerná expresia Bcl{0}} chráni neuróny pred excitotoxickými urážkami in vitro a in vivo. 54,55) Táto štúdia pozorovala zníženú fosforyláciu Akt (Ser473) a GSK3 (Ser9), ako aj expresiu Bcl-2 v hipokampe potkanov po expozícii kyseline kainovej, čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami.^56,57) Okrem toho predbežné ošetrenie echinakozidom zachránilo zníženie expresie pAkt a pGSK3, ako aj Bcl-2 vyvolané kyselinou kainovou. Neuroprotektívne účinky tedaechinakozidna zvieracom modeli s kyselinou kainovou môže byť čiastočne sprostredkované zabránením zníženia regulácie Akt/GSK-3/Bcl-2 dráhy, čím sa zvýši prežitie neurónov.

Echinakozidje potenciálnym novým terapeutickým kandidátom. To je preto, žeechinakozidmôže vstúpiť do mozgu a vykazuje množstvo výhod.⁵⁸) Dokázali to početné štúdieechinakozidzmierňuje poškodenie mozgu a zmierňuje motorické alebo pamäťové poškodenie v niekoľkých experimentálnych modeloch in vivo.^12,14,15,59) Hoci mechanizmy, ktoré sú základom neuroprotektívnych účinkovechinakozidv mozgu vyžadujú objasnenie, sú zahrnuté inhibované neurozápaly, antioxidácia, zachytávanie voľných radikálov a zvýšená neurogenéza.^14–16) Okrem týchto možných mechanizmov náš predchádzajúci¹⁷) a súčasné výsledky naznačujú, že inhibícia nadmernej excitácie sprostredkovanej glutamátom môže čiastočne prispieť k neuroprotektívnym a antiepileptickým účinkomechinakozidv mozgu. Podporuje to skutočnosť, že záchvatová aktivita vyvolaná kyselinou kainovou, neurozápal a poškodenie mozgu sú spojené s nadmerným uvoľňovaním glutamátu a aktiváciou glutamátových receptorov.^44,45Okrem toho sa ukázalo, že niekoľko klinicky používaných antiepileptík zmierňuje záchvatovú aktivitu vyvolanú kyselinou kainovou60,61) a znižuje uvoľňovanie glutamátu v mozgových tkanivách ľudí a potkanov.^62,63) Tieto zistenia poukázali na to, že znížené hladiny glutamátu sú dôležité pre farmakoterapeutické účinky antiepileptík.

Na záver, naše výsledky to dokazujúechinakozid, prostredníctvom potlačenia zápalových procesov, zníženia nadmernej excitácie sprostredkovanej glutamátom, ako aj zvýšenia aktivácie Akt/GSK-3 a expresie Bcl{2}}, má významný antiepileptický a neuroprotektívny účinok u potkanov, ktorým bola podaná kyselina kainová. Hoci úloha oechinakozidna pacientoch s epilepsiou si vyžaduje ďalšie hodnotenie, naše zistenia naznačujú, že by to mohol byť hodnotný prístup v terapii epilepsie.

Poďakovanie

Autori by chceli poďakovať pánovi Yen-Sheng Wu z laboratória elektrónového mikroskopu Tzong Jwo Jang, College of Medicine, Katolícka univerzita Fu Jen. Túto prácu podporilo Ministerstvo vedy a techniky (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Konflikt záujmov

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.