Priaznivé účinky verbascozidu z byliny Cistanche

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Verbascoside chráni myši pred klostridiovou plynovou gangrénou inhibíciou aktivity alfa toxínu a perfringolyzínu O

Plynová gangréna, spôsobená najmä anaeróbnou baktériou Clostridium perfringens (C. perfringens), spôsobuje smrť do 48 hodín od začiatku. Dostupné sú obmedzené terapeutické stratégie a je spojená s extrémne vysokou mortalitou. Alfa-toxín (CPA) C. perfringens aj perfringolyzín O (PFO) sú dôležitými faktormi virulencie pri rozvoji plynatej gangrény, čo naznačuje, že ide o terapeutické ciele. Tu sme to našliverbaskozid, a fenylpropanoidový glykozidširoko distribuovaný v Čínske bylinné lieky Cistanche, by mohol účinne inhibovať biologickú aktivitu CPA aj PFO v hemolytických testoch.

Oligomerizácia PFO bola pozoruhodne inhibovaná verbaskozidom. Hoci nebola pozorovaná žiadna antibakteriálna aktivita,verbaskozidliečba chránila bunky Caco{0}} pred poškodením spôsobeným CPA a PFO. Okrem toho infikované myši liečené sverbaskozidsa výrazne prejavilozmiernené škody, znížená bakteriálna záťaž, aznížená úmrtnosť. v súhrneverbaskozid má účinný terapeutický účinok proti virulencii C. perfringens in vitro aj in vivosúčasným zacielením CZA a PFO. Naše výsledky poskytujú sľubnú stratégiu a potenciálnu vedúcu zlúčeninu pre infekcie C. perfringens, najmä plynovú gangrénu.

Kľúčové slová: alfa-toxín, anti-infekcia, Clostridium perfringens, plynová gangréna, perfringolyzín O, verbaskozid

Clostridium perfringens (C. perfringens) je gram-pozitívna anaeróbna baktéria, ktorá je široko rozšírená v prírode a v ľudskom čreve (Fraser a Collee, 1975). C. perfringens môže vylučovať štyri hlavné toxíny ( , , ε a Ì) a podľa toho sa delí na päť sérotypov A–E (Titball, 2005). U ľudí môže C. perfringens spôsobiť rôzne ochorenia, ako je otrava jedlom a plynová gangréna, z ktorých posledná sa môže vyskytnúť aj u zvierat, ako sú mačky, dobytok, psy, ovce, kone a kozy (Verherstraeten et al. , 2015). Inkubačná doba plynovej gangrény je krátka a infekcia sa môže prejaviť v priebehu 6–8 hodín (Uzal et al., 2015). Ešte vážnejšie je, že u viac ako 50 percent infikovaných sa bude naďalej rozvíjať systémová toxémia, ktorá nakoniec vedie k smrti; plynová gangréna teda môže bez včasného a účinného podania liečby viesť k vážnym ekonomickým stratám (Low et al., 2018). Zvyčajná liečba, ako je liečba antibiotikami a chirurgická liečba plynatej gangrény, však všetky majú určité nevýhody vrátane, ale nie výlučne, rezistencie na antibiotiká a amputačného poranenia pacientov (Park a kol., 2010; Osman a Elhariri, 2013). Preto je potrebné nájsť nové metódy alebo nápady na liečbu plynatej gangrény.

Klostridiová plynová gangréna je fulminantné infekčné ochorenie spôsobené najmä interakciou toxínu C. perfringens (CPA) a perfringolyzínu O (PFO) (Hifumi et al., 2018). CPA, patriaci do rodiny bakteriálnych enzýmov zinok-metallo fosfolipázy, je produkovaný všetkými C. perfringens, je kódovaný chromozómami, je hlavným toxínom v C. perfringens a vykazuje aktivity fosfolipázy C aj sfingomyelinázy (van Bunderen et al. , 2010; Masataka a kol., 2015). V 90. rokoch 20. storočia Awad a spol. (1995) použili mutanty CPA na testovanie myšacieho modelu plynovej gangrény a zistili, že kmene, ktorým chýba gén CPA, vykazujú zníženú patogenitu a menšie poškodenie tkaniva po infekcii. Táto práca potvrdila, že CPA je hlavným toxínom v plynovej gangréne. V roku 2000 Alberto vykonal hĺbkové štúdie skonštruovaním molekulárneho modelu a-toxínu a mutantov s tromi slučkami v C-terminálnej doméne a hemolytická aktivita a cytotoxicita mutantov bola znížená v porovnaní s mutantmi divokého typu. Ukázalo sa, že sfingomyelinázová aktivita a C-terminálna doména sú nevyhnutné pre myotoxicitu in vivo (Alape-Giron et al., 2000). PFO, cholesterol-dependentný cytolyzín (CDC), interaguje s bunkovou membránou ako monomér a pripravený komplex sa potom vloží do membránovej dvojvrstvy oligomerizáciou, čím sa nakoniec lyzujú hostiteľské bunky (Johnson a Heuck, 2014). Hoci PFO nie je nevyhnutný pre letalitu, môže spôsobiť cytotoxicitu makrofágov v počiatočných štádiách myonekrózy a je dôležitý pre tvorbu trombu v neskorých štádiách infekcie, čo prispieva k patogenéze plynovej gangrény (Verherstraeten et al., 2015). CPA sa môže kombinovať s PFO na poškodenie neutrofilov nahromadených v infikovanom mieste a vyvolať dysfunkciu endotelových buniek, edém a ischémiu, čo nakoniec vedie k tkanivovej hypoxii a poskytuje priaznivé anaeróbne prostredie pre rast a reprodukciu C. perfringens (Bryant a Stevens, 1996 ). Táto štúdia sa teda zameriava na CPA a PFO a jej cieľom je odhaliť nový spôsob liečby plynovej gangrény.

V tejto štúdii boli dva toxínové inhibítory testované zo 17 prírodných zlúčenín hemolýzou, aby sa našiel potenciálny inhibítor plynovej gangrény. Hemolytické údaje pre rôzne zlúčeniny sú uvedené v tabuľke 1. Spomedzi 17 druhov prírodných zlúčenín má verbaskozid najlepší inhibičný účinok na oba toxíny, a preto sme verbaskozid vybrali ako cieľovú zlúčeninu pre túto štúdiu. Verbascoside je široko distribuovaný v rôznych čínskych bylinných liečivých bylinách, ako je cistanche a bol izolovaný a extrahovanýVerbascosidetalianskym vedcom v roku 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Štúdie to ukázaliverbascozid má mnoho biologických a farmakologických účinkov, ako naprprotizápalové, antioxidačné, antibakteriálne, protinádorové, protiplesňové a chelatačné vlastnosti, amožno použiť v pleťovej kozmetikeatopické prípravky.Ďalšie správy ukázali, že verbaskozid sa môže úplne absorbovať do 1 hodiny a dosiahnuť vysokú koncentráciu v krvi a že jeho biologická dostupnosť pri podávaní rôznymi injekčnými metódami nepresahuje 25 percent (Dai a kol., 2017; Feng a kol., 2018). Na základe vyššie uvedených farmakologických aktivít táto štúdia našla a študovala inhibítorúčinky verbascoziduna plynovú gangrénu prostredníctvom série in vitro a in vivo experimentov.

Verbaskozid inhiboval hemolytickú aktivitu PFO a CPA

Uvádza sa, že niektoré flavonoidy sú účinnými inhibítormi toxínov tvoriacich póry (Li a kol., 2013; Wang a kol., 2017; Zhou a kol., 2017). Tu sa zistilo, že verbaskozid, fenylpropanoid, inhibuje hemolytickú aktivitu toxínov PFO aj CPA vylučovaných C. perfringens. Keď sa koncentrácie verbascozidu pohybovali od 2 do 32 |ig/ml, liečba verbascozidom významne inhibovala hemolytickú aktivitu týchto toxínov spôsobom závislým od dávky, čo naznačuje, že verbascozid je účinným inhibítorom PFO aj CPA.

Verbascoside neovplyvňuje rast C. perfringens

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/ml. Podobne výsledky krivky rastu baktérií (obrázok 2B) naznačujú, že verbaskozid neovplyvňuje normálny rast baktérií. Naše výsledky spolu naznačujú, že liečba verbascozidom nemá žiadny vplyv na životaschopnosť C. perfringens v koncentráciách potrebných na inhibíciu aktivity PFO a CPA.

Verbascoside chráni bunky pred poškodením spôsobeným PFO alebo CPA

Alfa-toxín Clostridium perfringens a PFO v C. perfringens sú hlavné toxíny, ktoré spôsobujú plynovú gangrénu; skúmalo sa teda aj to, či verbaskozid môže chrániť bunky pred týmito dvoma toxínmi. Najprv sme vykonali test cytotoxicity s liekom verbaskozidom, ktorý nepoškodil bunky (obrázok 3A). Potom sa táto zlúčenina pridala do spoločného kultivačného systému buniek a PFO alebo CPA. Verbaskozid inhiboval cytotoxicitu týchto dvoch toxínovv bunkách Caco{{0}}. V porovnaní so vzorkami, ktoré neboli ošetrené verbaskozidom, bolo poškodenie indukované toxínmi na Caco-2 bunkách ošetrených verbascozidom v množstve 0,5 Jig/ml významne znížené v závislosti od dávky. Najmä v prípade proteínu PFO boli bunky účinne chránené pri koncentrácii liečiva 0,25 ug/ml (P < 0,05).="" na="" preukázanie="" tohto="" ochranného="" účinku="" sa="" ďalej="" použil="" následný="" test="" životaschopnosti/smrť="" buniek="" (obrázky="" 3d-k).="" ako="" sa="" očakávalo,="" liečba="" verbascozidom="" viditeľne="" chránila="" pred="" poškodením="" buniek="" vyvolaným="" pfo="" alebo="" cpa.="" celkovo="" naše="" výsledky="" preukázali,="" že="" verbaskozid="" významne="" inhibuje="" poškodenie="" buniek="" vyvolané="" pfo="" alebo="" cpa="" spôsobom="" závislým="" od="">

Verbaskozid inhibuje hemolytickú aktivitu PFO znížením jeho oligomerizácie

Hemolytická aktivita PFO musí byť sprevádzaná výskytom oligomerizácie a tvorby pórov (Johnson a Heuck, 2014). Tu bola oligomerizácia PFO indukovaná KCl a králičou krvou a bola detegovaná oligomerizácia PFO (obrázok 4), čo odhalilo zníženú intenzitu oligomerizačného pásu, keď sa zvýšila koncentrácia verbascozidu. Naše výsledky spoločne naznačujú, že liečba verbascozidom inhibuje oligomerizáciu PFO, a tým znižuje hemolytickú aktivitu tohto toxínu.

Verbascoside chráni myši pred infekciou C. perfringens

Bol vytvorený model gangrény na myšej nohe, aby sa určilo, či ochranu pozorovanú in vitro možno pozorovať aj in vivo. Nohy myší infikovaných ATCC{0}} boli Na rozdiel od toho počet zápalových buniek v skupine liečenej liekom bol významne znížený a tkanivo bolo po liečbe verbaskozidom neporušené. Okrem toho sa po liečbe verbaskozidom výrazne znížil počet baktérií kolonizovaných vo svaloch nôh. Ako ukazujú výsledky experimentu, 93,33 percent infikovaných myší zomrelo do 32 hodín po infekcii. Ako sa očakávalo, miera prežitia myší, ktoré dostávali verbascozid, sa zvýšila o 33,33 percenta, pretože iba 60 percent infikovaných myší zomrelo (P=0,015 podľa log-rank testu). Okrem toho liečba verbascozidom oddialila vrchol obdobia smrti takmer o 8 hodín (z 32 hodín pre myši infikované ATCC 13124- na 40 hodín pre myši liečené verbascozidom) a mohla tak predĺžiť drahocenný čas potrebný na klinickú záchranu. Celkovo naše výsledky ukázali, že u myší môže verbaskozid poskytnúť systémovo účinnú ochranu pred plynovou gangrénou spôsobenou C. perfringens.

Ako gram-pozitívna anaeróbna baktéria je C. perfringens v prírode široko rozšírená a môže vylučovať rôzne toxíny, čo môže viesť k rôznym ochoreniam u ľudí a zvierat, vrátane plynovej gangrény (Fraser a Collee, 1975; Verherstraeten et al. ., 2015). Plynová gangréna je spôsobená najmä kombináciou toxínov a a theta vylučovaných C. perfringens, čo môže viesť k smrti infikovaných zvierat, čo vedie k veľkým ekonomickým stratám. K dnešnému dňu však účinné metódy na liečbu plynatej gangrény zahŕňajú hyperbarický kyslík, chirurgický zákrok a antibiotiká. Medzi nimi môže operácia spôsobiť pacientovi značné fyzické poškodenie a má veľmi nepríjemný vplyv na pooperačný život. V izolátoch C. perfringens zo Švédska, Nórska, Dánska a iných miest sa našli početné gény rezistencie na tetracyklín. Na boj proti tejto bakteriálnej infekcii sú teda potrebné nové stratégie alebo činidlá (Park a kol., 2010; Osman a Elhariri, 2013). V tejto štúdii by fenylpropanoid verbaskozid, ktorý sa líši od tradičnej antibakteriálnej liečby (antibiotiká), mohol inhibovať hemolytickú aktivitu CPA aj PFO, dvoch dôležitých toxínov tvoriacich póry, ktoré kriticky prispievajú k patogenite C. perfringens. Na bunkovej úrovni by verbaskozid mohol tiež účinne chrániť bunky Caco-2 pred týmito dvoma toxínmi pri nízkych koncentráciách (0.25-2 ig/ml). Najmä verbaskozid by mohol znížiť aktivity toxínov inhibíciou oligomerizácie PFO. Tieto výsledky by mohli poskytnúť dostatočné základné údaje pre výskum in vivo.