Súčasný stav neuroprotekcie pri vrodenej srdcovej chorobe, časť 3

3.2. Semikvantitatívne hodnotenie ektopickej mitochondriálnej DNA

Obrazy farbenia Hsp60 (mitochondriálna matrica) a farbenia histónom-H2B (jadrový marker) boli odčítané od obrazov farbenia dsDNA. Potom pomocou funkcie "AdjustThreshold" softvéru lmage] (National Institutes of Health) boli obrázky binarizované.

Mitochondrie sú továrne na energiu v bunkách, ktoré sú zodpovedné za syntézu ATP na zabezpečenie energie potrebnej pre bunky. Mitochondriálna matrica je vnútorná tekutina mitochondrií, ktorá obsahuje rôzne enzýmy a ióny a je kľúčovým miestom pre rôzne biochemické reakcie mitochondrií. Pamäť je jednou z najdôležitejších kognitívnych schopností človeka. Aj keď sa môže zdať, že tieto dve veci spolu nesúvisia, úzko súvisia.

Výskum ukazuje interakciu medzi mitochondriálnou matricou a pamäťou. Enzýmy a ióny v mitochondriálnej matrici môžu priamo ovplyvňovať excitabilitu neurónov reguláciou energetického metabolizmu a stavu iónových kanálov v neurónových bunkách, čím ovplyvňujú pamäť. Okrem toho sa v mitochondriálnej matrici nachádza množstvo signálnych molekúl, ktoré sa môžu prenášať na downstream neuróny cez axóny a synapsie neurónov, čo ovplyvňuje účinnosť prenosu signálu neurónov, čím ovplyvňuje tvorbu a konsolidáciu pamäte.

Pamäťová aktivita zároveň priamo ovplyvňuje stav mitochondriálnej matrice. Pamäťové aktivity zvýšia spotrebu energie neurónov a podporia redoxnú reakciu v mitochondriálnej matrici, čím ovplyvnia metabolickú úroveň mitochondrií a vnútrobunkovú iónovú rovnováhu, čo ďalej ovplyvní excitabilitu a účinnosť prenosu signálu neurónov.

Preto je udržiavanie dobrého mitochondriálneho zdravia kľúčové pre udržanie dobrej funkcie pamäte. Udržiavaním dobrých životných návykov, ako je pravidelná strava, mierne cvičenie, primeraný spánok atď., môžete prispieť k udržaniu zdravia mitochondriálnej matrice. Okrem toho môže byť funkcia pamäte tiež posilnená vhodnou farmaceutickou intervenciou na podporu biochemických reakcií a signalizácie v mitochondriálnej matrici.

V každodennom živote môžeme trénovať pamäť mnohými spôsobmi, ako je čítanie, štúdium, myslenie, hry atď. Zároveň by sme mali dbať aj na udržanie dobrého zdravia, aby sme si lepšie udržali zdravie mitochondriálnej matrice. Verím, že vďaka tomuto úsiliu budeme mať určite lepšiu pamäť a lepšie zvládať rôzne výzvy v živote a práci. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov. Tieto látky sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže Cistanche deserticola tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatok živín a energie, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Vybrali sme bodky dsDNA s veľkosťou od 2 do 20 um' (kruhovosť 0.1-1.0) pomocou funkcie „Analyze-Analyze Particles“. v prípade potreby sa pôvodné snímky preskúmali na konečný počet. Ak bol signál histónu H2B malý. potom odčítané obrázky ukázali štruktúry podobné šiške.

Tieto predstavujú cytosolickú dsDNA jadrového pôvodu a mali by byť eliminované z množstva cytosolickej dsDNA mitochondriálneho pôvodu. Rozsah veľkosti možno upraviť podľa typu bunky alebo pôvodu histologických vzoriek. Obrázok 1E ukazuje príklad počítania ektopickej mitochondriálnej DNA

bodky pomocou 1B D.

Alternatívne boli obrazy farbenia Hsp60 odčítané od obrazov farbenia dsDNA. Potom sa pomocou funkcie „Adjust-Threshold „Analyze-Analyze Particles“ spočítal počet dsDNA puncta. Následne sa priamym pozorovaním spočítali dsDNA puncta bez histónového-H2B signálu. Posledná uvedená metóda je vhodná, keď histón-H2B obrázky vykazujú nízky odstup signálu od šumu.

Celkovo táto metóda môže jasne ukázať únik ektopickej mitochondriálnej DNA do cytoplazmy a umožňuje objektívne a štatistické vyhodnotenie takejto ektopickej mitochondriálnej DNA v bunkách.

4. Diskusia

V našej štúdii sme vyvinuli metódu, ktorá umožňuje počítanie cytoplazmatickej mitochondriálnej DNA. Detekcia cytoplazmatickej mitochondriálnej DNA bola publikovaná pomocou imunofluorescenčných techník, ale tieto metódy neboli vo väčšine prípadov kvantitatívne na hodnotenie cytoplazmatickej mitochondriálnej DNA [15,25]. V inej štúdii sa uskutočnila kvapôčková PCR na kvantifikáciu cirkulujúcej mitochondriálnej DNA [9].

nedávno Sato a kol. [26,27] publikovali vynikajúci protokol na vyhodnotenie cytoplazmatickej DNA pomocou imunofluorescenčnej mikroskopie s použitím protilátok Lamin B1 (LMNB1) ako markera jadrovej štruktúry a podjednotky cytochróm c oxidázy 4 (COX4) ako markera mitochondriálnej štruktúry. Tento protokol sa zdá byť veľmi užitočný na kvantifikáciu cytoplazmatickej dsDNA jadrového pôvodu.

Keď sme však skúšali COX4 alebo iné markery mitochondriálnej membrány, vrátane vnútorných aj vonkajších markerov, bolo veľmi ťažké presne odlíšiť cytoplazmu od mitochondrií.

Napríklad, ak sme pozorovali kruhové signály pomocou mitochondriálneho membránového markera a pozorovali signály dsDNA vo vnútri, potom by táto dsDNA mohla predstavovať buď mitochondriálnuDNA vo vnútri kruhových mitochondrií (normálna) alebo cytoplazmatickú mitochondriálnu DNA mimo mitochondrií podobných šiškám (ektopická). Použili sme teda Hsp60 ako marker označujúci mitochondriálnu matricu na vyhodnotenie ektopickej mitochondriálnej DNA v cytoplazme.

Ako je opísané v nedávnom prehľade [23], existuje mnoho rôznych typov cytoplazmatickej DNA jadrového pôvodu a väčšina z nich je pozitívna na histónové markery. Kvôli obmedzeniu kombinácie protilátok používaných na trojité farbenie sme použili histónový marker H2Bas.

Ak sa však toto obmedzenie vyrieši, H2AX môže byť lepším markerom pre cytoplazmatickú dsDNA jadrového pôvodu. Histón-H2B-negatívna cytoplazmatická dsDNA bola zriedkavo pozorovaná v kontrolných HeLa bunkách použitých v tejto štúdii, ale takáto dsDNA jadrového pôvodu môže byť prítomná, ak sa použijú iné bunkové línie alebo podmienky.

In situ hybridizácia mitochondriálnej DNA použitá v našom nedávnom článku je vhodná na kvalitatívne hodnotenie, ale môže byť ťažké použiť in situ hybridizáciu na kvantitatívne hodnotenie [8].

In situ hybridizácia vystavuje vzorku vysokým teplotám, čo môže viesť k deformácii alebo hluku niektorých častí vzorky. Na druhej strane, imunocytochemická metóda uvedená v tomto článku môže získať signály s nízkym šumom pozadia. V našom nedávnom článku sme v ľudských bunkách a zebričkách používaných ako modely Parkinsonovej choroby ukázali, že mitochondriálna DNA unikla do cytoplazmy, čo je toxické pre bunky. Tiež sme pozorovali, že množstvo cytosolickej mitochondriálnej DNA bolo zvýšené v post mortem mozgových tkanivách pacientov s Parkinsonovou chorobou [8].

Tieto línie dôkazov naznačujú, že zvýšené množstvo ektopickej mitochondriálnej DNA uniknutej z mitochondrií môže vyvolať akútny a chronický zápal, ktorý vedie k rôznym chorobám, vrátane Parkinsonovej choroby a srdcového zlyhania; teda upregulácia degradácie cytosolickej DNA alebo inhibícia jej senzorov by mohla byť potenciálnym terapeutickým cieľom pre tieto ochorenia [8,28].

Metóda kvantitatívneho hodnotenia ektopickej mitochondriálnej DNA predstavená v tomto článku slúži ako dôležitý nástroj pre ďalší výskum v tejto oblasti.

Príspevky autora: HM a MTH sformulovali hypotézy, navrhli väčšinu experimentov, vykonali experimenty, analyzovali údaje a napísali rukopis. NM vykonal experimenty súvisiace s kultivovanými bunkami. Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Táto práca bola podporená grantmi AMED (čísla grantov JP21gm6110028 a JP19dm0107154 (HM)), nadácie Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (čísla grantov JP14516799 (HM), JP 16690735 (1792HM) a JP ), JST (číslo grantu Moonshot R&D; JPMJMS2024 (HM)) a Grants-in-Aid od TBRF (číslo grantu TBRF-RF 21-135 (HM)).

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Údaje a nástroje opísané v tomto rukopise sú k dispozícii na požiadanie.

Poďakovanie: Oceňujeme Shinano Kobayashi za účasť na užitočných diskusiách a za poskytovanie nepretržitej podpory. Oceňujeme Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) za poskytnutie postdoktorandského štipendia TBRF pre zahraničných výskumníkov na MH (TBRF-RF 21-135).

Konflikty záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sun, L.; Chen, ZJ Kľúčové úlohy signalizácie cGAS-cGAMP pri antivírusovej obrane a imunoadjuvantných účinkoch. Veda 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Acetylácia jadrového IFI16 vyvolaná rozpoznaním herpesvírusového genómu je nevyhnutná pre jeho cytoplazmatickú translokáciu, zápalové reakcie a reakcie IFN-. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM cGAS-sprostredkovaná stabilizácia IFI16 podporuje vrodenú signalizáciu počas infekcie vírusom herpes simplex. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavaron, AT; Portnoy, DA c-di-AMP vylučovaný intracelulárnou Listeria monocytogenes aktivuje reakciu hostiteľa typu I na interferón. Veda 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simthy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; a kol. Cytoplazmatický chromatín spúšťa zápal v starobe a rakovine. Príroda 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Holič, GN; a kol. Zníženie regulácie cytoplazmatických DNáz sa podieľa na akumulácii cytoplazmatickej DNA a SASP v senescentných bunkách. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; a kol. Makropóry BAK/BAX uľahčujú mitochondriálnu herniáciu a eflux mtDNA počas apoptózy. Veda 2018, 359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Cytosolická dsDNA mitochondriálneho pôvodu indukuje cytotoxicitu a neurodegeneráciu v bunkových modeloch Parkinsonovej choroby a zebričiek. Nat. komun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sun, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; a kol. Parkin a PINK1 zmierňujú zápal vyvolaný STING. Príroda 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, poslanec; Croteau, DL; Bohr, suplementácia VA NAD(+) znižuje neurozápal a starnutie buniek v transgénnom myšacom modeli Alzheimerovej choroby prostredníctvom cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com