Epigenetický regulátor BRD4 sa podieľa na kadmiom spúšťanej zápalovej reakcii v obličkách potkanov

pre viac informácií:{0}}

Zhongguo Gong a kol

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknutím sem získateprodukty a Cistanche DHT

ABSTRAKT

Kadmium (Cd) bolo opísané ako potenciálny induktor zápalu, zatiaľ čo stále viac dôkazov ukazuje, že nevhodný zápal je faktorom, ktorý prispieva kpoškodenie obličiek. Výskum zápalovej reakcie vyvolanej Cd má teda veľký význam pre objasnenie mechanizmu nefrotoxicity vyvolanej Cd. Obsahujúce bromodoménu 4(BRD4) je dôležitým epigenetickým regulátorom podieľajúcim sa na rozvoji mnohých zápalových ochorení, ale jeho regulačné úlohy pri spúšťaní Cdzápalovéodpoveď je ešte potrebné objasniť. Tu sme zistili, že liečba Cd u potkanov Sprague-Dawley (2 mg/kg telesnej hmotnosti, ip, 5 po sebe nasledujúcich dní) a u potkanovobličková bunkalínia (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) indukovala transkripciu zápalových cytokínov, ktorá mohla byť znížená pomocou JQ1 (inhibítor BRD4, 25 mg/kg telesnej hmotnosti, ip , 3 po sebe idúce dni in vivo; 0, 5 uM, 12 hodín in vitro) alebo BRD4 malá interferujúca RNA (siRNA, in vitro), čo naznačuje, že BRD4 sa zúčastňuje zápalovej reakcie spúšťanej Cd. Ďalej naša štúdia objasnila úlohy BRD4 v zápalovej odpovedi vyvolanej Cd. Inhibícia BRD4 znížila Cd-podporovanú nukleárnu translokáciu a aktiváciu NF-KB in vivo a in vitro. Cd zvýšil hladinu acetylácie RelA K310 a zvýšil väzbu BRD4 na acetylovaný NF-KB RelA in vivo a in vitro, ktoré boli zrušené inhibíciou BRD4. Stručne povedané, naša štúdia naznačuje, že BRD4 sa podieľa na transkripcii zápalových cytokínov spúšťaných Cd sprostredkovaním aktivácie signálnej dráhy NF-KB a zvýšením vlastnej väzby na acetylovaný NF-KB RelA u potkanovoblička,preto by BRD4 mohol byť potenciálnym terapeutickým cieľom pre Cd-indukované renálne ochorenia.

Kľúčové slová: BRD4kadmiumZápalové obličkycytokíny NF-KB JQ1

1. Úvod

Kadmium (Cd) je znečisťujúca látka z ťažkých kovov s vysokou toxicitou a dlhým polčasom rozpadu. S rozvojom priemyselnej výroby vyvolala obavy zvýšená hrozba znečistenia Cd pre environmentálnu bezpečnosť a ľudské zdravie (Wang a kol., 2020; Horiguchi a Oguma, 2016). Cd po jeho vstrebaní telom vyvoláva multiorgánové poškodenie aobličkyje hlavným cieľovým orgánom (Fernando a kol., 2020; Zhao a kol., 2021). Predtým sme systematicky overovali, že inhibícia autofágie, oxidačný stres a apoptóza synergicky prispievajú k nefrotoxicite spôsobenej Cd u potkanov (Liu a kol., 2017; Wang a kol., 2017). Zápal je fyziologická reakcia, ktorá pôsobí ako obranná reakcia proti infekcii alebo poraneniu, ale Cd-indukované nekontrolované a neprimerané zápalové reakcie môžu spôsobiť poškodenie, ako je poškodenie normálneho tkaniva okoloidúcich a podpora autoimunitných ochorení (Hossein-Khannazer a kol., 2020; Zhang a kol. al., 2020). Zápalová reakcia vyvolaná Cd exacerbovala kardiovaskulárne ochorenia a poškodenie pečene, čo naznačuje, že zápal môže hrať dôležitú úlohu pri Cd sprostredkovanomobličkypatologických procesov (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetika označuje dedičné modifikácie v génovej expresii založené na zmenách sekvencií iných ako DNA a reverzibilita týchto modifikácií umožňuje objavenie nových terapeutických cieľov (Vendetti a Rudin, 2013). Rodina bromodomény a extraterminálnej domény (BET) zahŕňa bromodoménu obsahujúcu 2 (BRD2), BRD3, BRD4 a bromodoménu špecifickú pre semenníky (BRDT), ktorá sa vyznačuje dvoma bromodoménami a väzbou na acetylované lyzíny histónov a nehistónových ( Lochrin a kol., 2014; Chatterjee a Bohmann, 2018). Proteíny BET pôsobia ako transkripčný koaktivátor mnohých génov, čím regulujú bunkový cyklus, zápalovú odpoveď, oxidačný stres a ďalšie fyziologické procesy v rôznych patologických modeloch (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 je obzvlášť dobre preštudovaný člen rodiny proteínov BET a hromadiace sa výskumy ho uvádzajú ako nový epigenetický cieľ pri regulácii rôznychochorenia obličiekvrátane chronickej nefritídy, diabetickej nefropatie a experimentálneho poškodenia obličiek (Zeng a Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Potvrdilo sa, že BRD4 sa podieľa na procese transkripcie závislom od jadrového faktora-κB (NF-κB) na reguláciu zápalových reakcií pri mnohých ochoreniach (Xu a Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 môže byť regrutovaný acetylovaným RelA (NF-KB podjednotka, gén kódujúci proteín) na lyzíne 310 (RelA-K310ac) prostredníctvom jeho bromodomény, čím sa aktivuje cyklín-dependentná kináza 9 (CDK9) a fosforyluje sa RNA polymeráza II na podporu transkripcia cieľových génov NF-κB (Hajmirza et al., 2018). Nedávne štúdie naznačujú, že inhibítory BRD4 by mohli byť potenciálnou terapeutickou možnosťou pre zápalové ochorenia. V modeloch poranenia miechy potkanov inhibícia BRD4 zoslabila zápalovú odpoveď a podporila funkčné zotavenie mikroglií (Dey et al., 2019). Inhibícia BRD4 tiež zrušila experimentálny zápal obličiek v myšacích modeloch unilaterálnej ureterálnej obštrukcie, antimembránovej bazálnej GN a infúzie angiotenzínu II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Vzhľadom na potenciálne prozápalové účinky Cd a regulačné účinky BRD4 na zápal sme predpokladali, že BRD4 sa podieľa na zápalovej reakcii vyvolanej Cd. Ako sa očakávalo, BRD4 sprostredkúva proces transkripcie zápalových cytokínov v modeloch potkaních obličiek vystavených Cd. Naša štúdia odhaľuje potenciálny mechanizmus v zápalovej odpovedi vyvolanej Cd a poskytuje nový pohľad na terapiu nefrotoxicity vyvolanej Cd.

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie a protilátky

Chlorid kademnatý (CdCl2, bezvodý, 439800) bol zakúpený od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). (plus)-JQ1 (HY-13030) bol získaný od MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Súprava na extrakciu jadrového proteínu bola zakúpená od Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027). Účinná chemiluminiscenčná súprava (ECL, 32209) a činidlo na stanovenie proteínu kyseliny bicinchonínovej (BCA, 23225) boli získané od Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Boli použité primárne protilátky proti nasledujúcim proteínom: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) boli zakúpené od Proteintech Group (Wuhan, Čína); -aktín (3700 s), Histón H3 (His3, 4499), Sirtuín 1 (Sirt1, 8469), normálny králičí IgG (IgG, 4394) boli zakúpené od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); BRD4 (ab128874), K (lyzín) acetyltransferáza 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-KB RelA (acetyl K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488 – konjugované oslie 707, anti-konjugované oslie 3ab15 z Abcam (Cambridge, Spojené kráľovstvo). Druhé protilátky: Kozie anti-myšie IgG (H plus L) (115-035-003) a kozie anti-králičie IgG (H plus L) (111-035-003) boli zakúpené od Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Zvieratá a pokusy

Dvadsaťštyri potkanov Sprague-Dawley (samce, 6 týždňov staré, 110 až 120 g) bolo zakúpených od Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Čína). Potkanom bol umožnený voľný prístup k potrave a vode v miestnosti s kontrolovaným prostredím (24 ± 5 ​​stupňov, cyklus svetlo/tma 12 hodín). Experimentálne postupy boli aplikovateľné na smernicu Rady Európskych spoločenstiev 2010/63/EÚ pre pokusy na zvieratách a všetky postupy boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na univerzite v Yangzhou. Po jednom týždni aklimatizácie boli potkany náhodne rozdelené do štyroch skupín: (1) Kontrolná skupina: intraperitoneálne injikované zodpovedajúce rozpúšťadlo (fyziologický roztok alebo roztok 2-hydroxypropyl- -cyklodextrínu). (2) Skupina Cd: CdCl2 (2 mg/kg telesnej hmotnosti, rozpustený vo fyziologickom roztoku) injikovaný intraperitoneálne počas 5 po sebe nasledujúcich dní, aby sa vytvoril model intoxikácie Cd. (3) Skupina Cd plus JQ1: CdCl2 (2 mg/kg telesnej hmotnosti) injekčne podávaný intraperitoneálne počas 5 po sebe nasledujúcich dní na vytvorenie modelu intoxikácie Cd a JQ1 (25 mg/kg telesnej hmotnosti, rozpustený v 2-hydroxypropyl{{ 25}} roztok cyklodextrínu) injikovaný intraperitoneálne v deň 6-8. (4) Skupina JQ1: JQ1 (25 mg/kg telesnej hmotnosti) podávaný intraperitoneálne v dňoch 6.–8. Štatistiky obsahu Cd v potkaních sérach a tkanivách obličiek sú uvedené v tabuľke S1, čo odráža úspešné vytvorenie modelov potkanov vystavených Cd.

Po 8 dňoch liečby boli potkany usmrtené cervikálnou dislokáciou v hlbokej anestézii po 12 hodinách hladovania. Obličkové tkanivá sa vyrezali a 1 g tkaniva z každej obličky sa rýchlo skladoval pri -80 °C na následnú analýzu Western blot a kvantitatívnu PCR (qPCR). Zvyšné množstvo tkaniva sa rýchlo fixovalo v 4 percentách paraformaldehydu (PFA) na imunohistochemické (IHC) farbenie.

2.3. Bunková kultúra a liečba

Bunková línia potkaních obličiek (NRK{{0}}}E) bola získaná od Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. Bunky NRK-52E boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM, Gibco, 12800-017) obsahujúcom 5 percent fetálneho hovädzieho séra (FBS, Gibco, 10437-028), penicilín a streptomycín (1 00 U/mL) vo zvlhčenom stave s 5 percentami CO2 a 95 percentami vzduchu pri 37 stupňoch . CdCl2 (ultračistý vo vode rozpustený) a JQ1 (rozpustený v dimetylsulfoxide) boli oddelene skladované pri 4 stupňoch a -20 stupňoch a pred použitím sa zriedili na pracovné roztoky. Experimentálny dizajn bol nasledujúci: (1) Bunky boli ošetrené 0, 2,5, 5, 10 uM Cd počas 12 hodín alebo 5 uM Cd počas 0, 6, 12, 24 hodín, aby sa uskutočnili následné testy. (2) Bunky boli ošetrené 5 uM Cd a / alebo 0, 5 uM JQ1 počas 12 hodín, aby sa vykonali následné testy. (3) Bunky boli transfekované siBRD4 a/alebo ošetrené 5 uM Cd počas ďalších 12 hodín, aby sa vykonali následné testy.

2.4. Malá interferujúca transfekcia RNA

Transfekovali sme 20 nM BRD4 malej interferujúcej RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) do buniek NRK-52E transfekčným činidlom Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, kat. č. 13778150) počas 24 hodín podľa návodu k produktu. Boli použité nasledujúce sense siRNA:

siBRD4, s cieľovou sekvenciou 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA negatívna kontrola), s cieľovou sekvenciou 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Vzorky tkaniva obličiek a bunky NRK{0}}E sa lýzovali v RIPA pufri obsahujúcom inhibítory proteázy, aby sa extrahoval celkový proteín. Jadrový proteín bol pripravený z čerstvých tkanív a buniek vopred a skladovaný pri -80 stupňoch. Vzorky proteínov (20–30 ug na vzorku) sa oddelili elektroforézou SDS-PAGE a potom sa preniesli na polyvinylidénfluoridové membrány (Millipore, ISEQ00010). Membrány boli blokované 5 percentným odstredeným mliekom počas 90 minút a inkubované 12 hodín pri 4 stupňoch s nasledujúcimi primárnymi protilátkami: -aktín (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Potom sa membrány premyli TBST a inkubovali sa so zodpovedajúcimi sekundárnymi protilátkami (1:10 000) počas 90 minút pri teplote miestnosti (RT). Membrány boli inkubované elektrochemiluminiscenciou (ECL, ThermoFisher Scientific) a stanovené na Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Francúzsko) a optická hustota bola analyzovaná pomocou ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Imunofluorescenčné (IF) farbenie

NRK{{0}}E bunky nasadené v 24-jamkovej platni sa pestovali do približne 60 percent konfluencie. Bunky boli ošetrené 5 μM Cd a/alebo 0,5 μM JQ1 počas 12 hodín, potom fixované PFA (4 percentá, 10 minút), permeabilizované Tritonom X- 100 (0,1 percenta, 15 minút), blokované BSA (2 percentá, 90 minút) pri teplote miestnosti a inkubované s primárnou protilátkou (NF-KB p65, riedenie 1:50) cez noc pri 4 stupňoch. Po trojnásobnom premytí PBS sa bunky inkubovali so sekundárnou protilátkou (riedenie 1:500) počas 90 minút a s DAPI počas 5 minút pri teplote miestnosti, potom sa bunky pozorovali pod konfokálnym mikroskopom. Jadrová translokácia NF-KB bola analyzovaná v troch nezávislých štúdiách.

2.7. qPCR

Celková RNA z obličkových tkanív a buniek NRK{0}}E sa extrahovala pomocou súpravy RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Japonsko). 1 ug celkovej RNA sa použil na syntézu cDNA 1. reťazca podľa návodu výrobcu (Roche, Basel, Švajčiarsko). Na detekciu relatívnych hladín mRNA sa odobrali 2 μl komplementárnej DNA (cDNA) na jamku pomocou systému LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Vypočítajte relatívne hladiny mRNA podľa rovnice 2-△△CT. Priméry sú uvedené v tabuľke S2. -aktín bol potkaní referenčný gén.

2.8. Koimunoprecipitácia (Co-IP)

Tkanivá obličiek a bunky NRK{0}}E boli lyzované v čerstvo pripravenom pufri na lýzu buniek (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 2 mmol/l EDTA, 1 % Triton X{{8} }) obsahujúce PMSF. Guľôčky Proteín G (100 ul na vzorku, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) sa zmiešali s 2 ug protilátky BRD4, RelA-K310ac alebo IgG na vzorku a otáčali sa 10 minút pri teplote miestnosti. Potom sa celkové proteínové lyzáty inkubovali s komplexom guľôčky a protilátky cez noc pri 4 stupňoch. Po trojnásobnom premytí bunkovým lyzačným pufrom boli imunoprecipitáty resuspendované s 1 x SDS PAGE vzorkovým pufrom na konfiguráciu vzoriek. Cieľové proteíny sa detegovali pomocou Western blottingu s primárnymi protilátkami anti-BRD4 a anti-RelA K310ac.

2.9. Štatistická analýza

Všetky údaje boli získané z najmenej troch nezávislých experimentov a vyjadrené ako priemer ± SEM, pokiaľ nie je uvedené inak. Experimentálne skupiny sa porovnávali nepárovým dvojstranným Studentovým t-testom alebo jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Významnosť bola stanovená na p <>

3. Výsledky

3.1. Cd indukuje expresiu zápalových cytokínov in vivo a in vitro

Ukázalo sa, že Cd ako látka znečisťujúca životné prostredie spôsobuje poškodenie obličiek reguláciou série biologických procesov (Wang et al., 2019c). V tejto štúdii sa skúmali zmeny v hladinách transkripcie zápalových cytokínov po expozícii Cd, aby sa zistilo, či sa zápal podieľa na nefrotoxicite vyvolanej Cd. Údaje ukázali, že expozícia Cd významne zvýšila hladiny interleukínu (IL)-1 a tumor nekrotizujúceho faktora (TNF)-proteínu v bunkách NRK-52E (obr. 1A-B) a tkanivách obličiek potkanov (obr. 1C -D). Medzitým, ako je znázornené na obr. 1E-F, expozícia Cd zvýšila transkripčné hladiny zápalových cytokínov (IL-1, IL-6, TNF- a (monocytový chemoatraktant proteín-1) MCP -1) in vivo a in vitro. Tieto zistenia naznačujú, že Cd indukuje expresiu zápalových cytokínov v obličkách potkanov.

3.2. BRD4 sa podieľa na Cd-indukovanom transkripčnom procese zápalových cytokínov

BRD4 je novo opísaný epigenetický regulátor, ktorý sa viaže na acetylované históny alebo nehistóny na reguláciu zápalových procesov pri mnohých ochoreniach. Inhibítor BRD4 JQ1 a BRD4-siRNA sa tu použili na preskúmanie úlohy BRD4 na zápalovú reakciu vyvolanú Cd. Dáta ukázali, že Cd-zvýšený IL -1 a TNF-proteín úrovne boli down-regulované JQ1 liečby in vivo a in vitro (obr. 2A-D) a BRD4 knockdown in vitro (obr. S1A-B). Medzitým liečba JQ1 významne inhibovala hladiny transkripcie IL-1, IL-6, TNF- a MCP-1 v bunkách NRK-52E buniek NRK-52} zosilnené Cd (obr. 2E) a tkanivá obličiek potkanov (obr. 2F). BRD4 knockdown tiež významne znížil Cd-zvýšené transkripčné hladiny zápalových cytokínov v NRK-52E bunkách (obr. S1C). Súhrnne tieto zistenia naznačujú, že BRD4 je kritickým regulátorom zápalovej reakcie spustenej Cd v obličkách potkanov.

3.3. Úrovne expresie BRD4 zostávajú po expozícii Cd nezmenené

Ďalej sa po expozícii Cd detegovali zmeny v hladinách expresie BRD4. Bunky NRK-52E boli ošetrené Cd v koncentračnom gradiente a potkanom bolo intraperitoneálne injikované Cd počas 5 dní, aby sa objasnil účinok Cd na expresiu BRD4 v obličkách in vivo a in vitro. Výsledky ukázali, že hladiny proteínu BRD4 boli nezmenené ako v Cd-exponovaných NRK{6}}E bunkách (obr. 3A-B), tak v tkanivách obličiek potkanov (obr. 3C-D). Hladiny mRNA BRD4 boli tiež po expozícii Cd nezmenené (obr. 3E-F). Tieto výsledky naznačujú, že BRD4 sprostredkuje Cd-spúšťanú zápalovú reakciu nezávisí od zmien v úrovni expresie.

3.4. BRD4 reguluje jadrovú translokáciu NF-KB podporovanú Cd

V našej štúdii sa skúmali úlohy BRD4 v zápalovej odpovedi vyvolanej Cd. Zmena signálnej dráhy NF-KB úzko súvisí s transkripciou zápalových cytokínov (Chi et al., 2021). Naša štúdia zistila, že BRD4 sa podieľa na Cd-regulovanej jadrovej translokácii a aktivácii NF-KB. Najprv sa určila subcelulárna lokalizácia NF-KB farbením IF a farbením IHC. Údaje na obr. 4A a D ukázali, že JQ1 inhibuje Cd-podporovanú NF-KB jadrovú translokáciu v NRK-52E bunkách a tkanivách obličiek potkana. Medzitým výsledky Western blotu ukázali, že JQ1 významne znížil hladiny jadrového proteínu NF-KB so zvýšeným Cd in vivo (obr. 4B-C) a in vitro (obr. 4E-F). Podobne BRD4 knockdown tiež významne inhiboval Cd-podporovanú NF-KB jadrovú translokáciu (obr. S2A) a znížil Cd-zvýšené hladiny jadrového proteínu NF-KB (obr. S2B-C) v NRK-52E bunkách. Celkovo možno povedať, že inhibícia BRD4 môže znížiť jadrovú translokáciu NF-KB podporovanú Cd, čo naznačuje, že BRD4 sprostredkúva aktiváciu signálnej dráhy NF-KB v obličkách po expozícii Cd.

3.5. Cd zvyšuje hladiny acetylácie RelA K310

Štúdie potvrdili, že BRD4 sa viaže na acetylovaný RelA K310 prostredníctvom svojich brómových domén, aby reguloval transkripciu závislú od NF-KB (Morgado-Pascual a kol., 2019; Zhong a kol., 2018). Bola teda detegovaná hladina acetylácie RelA K310 a expresia dvoch enzýmov. Údaje ukázali, že hladiny proteínu RelA-K310ac a acetylázy Ep300 sa kontinuálne znižovali so zvýšenou koncentráciou Cd, zatiaľ čo hladina proteínu deacetylázy Sirt1 sa postupne zvyšovala v bunkách NRK-52E (obr. 5A-B) a tkanivách obličiek potkanov (obr. 5C-D). Hladiny mRNA Ep300 a Sirt1 tiež vykazovali rovnaké trendy (obr. 5E-F). Tieto výsledky naznačujú, že Cd podporuje hladinu acetylácie RelA K310, takže BRD4 sa môže podieľať na transkripcii zápalových cytokínov spúšťaných Cd v obličkách.

3.6. Cd zvyšuje väzbu BRD4 na RelA-K310ac, aby sa zvýšila jeho transkripčná funkcia

Väzba na acetylačné miesta je základom pre reguláciu transkripcie BRD4 (Huang et al., 2009). Aby sa overilo, či Cd reguluje funkciu BRD4 zvýšením väzby BRD4 na RelA-K310ac, interakcia medzi RelA-K310ac a BRD4 sa detegovala prostredníctvom Co-IP. Údaje na obr. 6A ukázali, že Cd významne zvýšilo interakciu medzi RelA-K310ac a BRD4 v bunkách NRK-52E, ktorá bola zmiernená liečbou JQ1 alebo knockdownom BRD4. Rovnaký trend sa pozoroval aj v tkanivách obličiek potkanov (obr. 6B). Tieto výsledky ukazujú, že Cd zvyšuje väzbu BRD4 na RelA-K310ac, čo podporuje transkripciu závislú od NF-KB a následne prispieva k zápalovej odpovedi spúšťanej Cd.

4. Diskusia

Cd bolo hlásené ako potenciálny spúšťač zápalu kvôli jeho vysokej toxicite, zatiaľ čo presný mechanizmus stále nie je úplne objasnený (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Naša štúdia potvrdila, že Cd indukuje expresiu zápalových cytokínov v obličkových bunkách potkanov, a zistila, že BRD4, epigenetický cieľ, ktorý má kritické funkcie v sérii bunkových procesov vrátane zápalu, prispieva k zápalovej reakcii vyvolanej Cd. Ďalšie experimenty ukázali, že BRD4 sa podieľa na aktivácii signálnej dráhy NF-KB podporovanej Cd. Cd tiež zvýšil hladinu acetylácie RelA K310, čím zvýšil väzbu BRD4 na acetylovaný NF-KB RelA na podporu transkripcie zápalových cytokínov závislých od NF-KB.

Zápal je jedným z prirodzených obranných mechanizmov proti exogénnym chemikáliám, zatiaľ čo nekontrolovaná a neprimeraná zápalová reakcia môže poškodiť normálne tkanivá a vyvolať autoimunitné ochorenia (Jian et al., 2018). Biologické markery zápalu so zvýšeným Cd boli často spojené s rôznymi chorobami. Štúdie ukázali, že zápal vyvolaný Cd sa podieľa na aterogenéze (Tinkov et al., 2018). Okrem toho Cd podporoval expresiu zápalových cytokínov, ktoré prispeli k poškodeniu tkaniva pľúc a semenníkov a indukovali hepatotoxicitu (Koopsamy Naidoo a kol., 2019; Arafa a kol., 2014). Tieto škodlivé účinky sú v súlade s našimi výsledkami, že zápalová reakcia sa podieľa na poškodení obličiek indukovanom Cd. Čoraz viac výskumov sa zameriava na mechanizmy výskytu Cd-indukovaného zápalu. Ako dobre preštudovaný člen rodiny proteínov BET hrá BRD4 rozhodujúcu úlohu v mnohých biologických procesoch vrátane zápalu. Tu sa JQ1 (inhibítor BRD4) a siRNA použili na dereguláciu funkčnej aktivity BRD4 a zistilo sa, že inhibícia BRD4 znížila Cd-indukovanú transkripciu zápalových cytokínov v obličkách potkanov, čo naznačuje, že BRD4 sa podieľa na zápalovej odpovedi vyvolanej Cd. . Všeobecne sa verí, že dysregulácia expresie BRD4 je kľúčovou udalosťou pri výskyte zápalovej odpovede. Pri poranení miechy, patologickej srdcovej hypertrofii a iných ochoreniach spojených so zápalom prispela neusporiadaná expresia BRD4 k expresii zápalových cytokínov (Zhu a kol., 2020; Marazzi a kol., 2018; Ren a kol., 2019). Cd však nemalo žiadny vplyv na hladiny expresie BRD4 za súčasných experimentálnych podmienok, čo nás viedlo k zváženiu, či BRD4 sprostredkúva zápalovú reakciu spustenú Cd inými cestami.

NF-κB je dôležitým regulačným faktorom v zápalových procesoch a je zodpovedný za kontrolu expresie mnohých zápalových mediátorov (Lawrence, 2009). Štúdie boli hlásené, že BRD4 sa podieľa na regulácii signálnej dráhy NF-KB. Huang a kol. (2017) navrhli, že BRD4 reguloval aktiváciu NF-κB sprostredkovanú IKK prostredníctvom dráh p38 a JNK-MAPK. Wang a kol. (2019a) zistili, že knockdown BRD4 alebo liečba JQ1 blokovala signálnu dráhu NF-KB aktivovanú lipopolysacharidom (LPS) v mikrogliách. Meng a kol. (2014) preukázali, že liečba JQ1 blokovala expresiu zápalových cytokínov inhibíciou aktivácie NF-κB v bunkách RAW 264.7 ošetrených LPS. Tieto správy naznačujú, že BRD4 sprostredkováva aktiváciu NF-KB v mnohých modeloch zápalu, zatiaľ čo inhibícia BRD4 je účinným terapeutickým prístupom k protizápalu. V súčasnej štúdii inhibícia BRD4 blokovala jadrovú translokáciu NF-KB v tkanivách potkaních obličiek a NRK-52E bunkách vystavených Cd, čo naznačuje, že BRD4 sprostredkováva Cd-aktivovanú NF-KB signálnu dráhu.

Typicky, po aktivácii NF-KB rôznymi stimulmi a translokácii do jadra, sa BRD4 viaže na acetylovaný NF-KB RelA v mieste K310, čo zvyšuje jeho stabilitu a transkripčnú aktivitu v jadre (Hajmirza et al., 2018). Úroveň acetylácie RelA K310 teda ovplyvňuje regulačnú funkciu BRD4 na zápalovú odpoveď. V hipokampálnych neurónoch sprostredkovala deacetyláza Sirt1 deacetyláciu RelA K310 na reguláciu expresie BACE1, čo prispelo k produkcii neurónového amyloidu (Flores-Leon et al., 2019). V glioblastómových bunkách stres fotodynamickej terapie znížil deacetylázu Sirt1 a aktivoval acetylázu Ep300, čo zvýšilo hladiny RelA-K310ac a viedlo k zvýšenej produkcii oxidu dusnatého, ktorý je prežitý (Fahey et al., 2019). Naša štúdia zistila, že Cd podporuje hladinu acetylácie RelA K310 zvýšením expresie Ep300 a znížením expresie Sirt1, čo naznačuje, že Cd ovplyvňuje regulačnú funkciu BRD4 zvýšením hladín acetylácie RelA K310.

Naše výsledky ukázali, že liečba JQ1 bola účinnejšia ako knockdown BRD4 pri zmierňovaní zápalovej reakcie vyvolanej Cd. JQ1 má vysokú väzbovú afinitu k BRD4 a môže takmer úplne blokovať väzbu BRD4 na chromozóm, zatiaľ čo siBRD4 môže interferovať iba s expresiou proteínu BRD4, aby sa znížila väzba BRD4 na cieľové miesto, čo naznačuje, že BRD4 sprostredkováva zápalovú reakciu spúšťanú Cd môže závisieť od väzba s acetylovaným NF-KB RelA. Nedávne štúdie ukázali podobný regulačný mechanizmus: po jadrovej translokácii a aktivácii NF-KB potom BRD4 interagoval s acetylovaným RelA, aby koaktivovala transkripčnú aktiváciu NF-KB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 bol prijatý do cieľových promótorov NF-κB v rôznych zápalových stimulačných podmienkach, zatiaľ čo liečba JQ1 pôsobila tak, že bránila väzbe BRD4 na acetylovaný NF-κB RelA, čím sa znížila transkripčná aktivita NF-κB (Zou et al., 2014). Naše výsledky ukázali, že inhibícia BRD4 blokuje interakciu zosilnenú Cd medzi BRD4 a RelA-K310ac v obličkách potkanov, čo podporuje naše vyššie uvedené výsledky, že inhibícia BRD4 potláča Cd-indukovanú transkripčnú aktivitu NF-KB, čo naznačuje, že Cd zvyšuje väzbu BRD4 na acetylované NF-KB RelA na zvýšenie transkripcie zápalových cytokínov.

Stručne povedané, naša štúdia odhalila regulačné mechanizmy BRD4 v Cd-spúšťanej zápalovej odpovedi v obličkách potkanov: (1) BRD4 sprostredkuje Cd-indukovanú NF-KB jadrovú translokáciu a aktiváciu. (2) Cd zvyšuje hladiny acetylácie RelA K310 a zvyšuje väzbu BRD4 na acetylovaný NF-KB RelA, čo podporuje transkripciu zápalových cytokínov závislých od NF-KB. Okrem toho inhibícia BRD4 významne zmiernila hladiny zápalových cytokínov zvýšené Cd, čo naznačuje, že cielený BRD4 má potenciál vyvinúť sa ako účinný prostriedok na liečbu zápalových ochorení vrátane nefritídy vyvolanej Cd.

vyhlásenie o autorskom príspevku CRediT

Zhongguo Gong: Konceptualizácia, Metodológia, Vizualizácia, Formálna analýza, Validácia, Skúmanie, Formálna analýza, Spracovanie údajov, Písanie – originálny návrh. Gang Liu: Konceptualizácia, Metodológia, Vizualizácia, Spracovanie dát, Písanie – originálny návrh, Administrácia projektu, Získavanie financií. Wenjing Liu: Softvér, zdroje, metodológia, formálna analýza. Hui Zou: Administrácia projektu, supervízia. Ruilong Song: Softvér, formálna analýza, supervízia. Hongyan Zhao: Softvér, formálna analýza, dohľad. Yan Yuan: Dohľad. Jianhong Gu: Dohľad. Jianchun Bian: Akvizícia financovania, supervízia. Jiaqiao Zhu: Písanie – kontrola a úprava, supervízia. Zongping Liu: Písanie – kontrola a úprava, supervízia,

Administrácia projektu, získavanie financií, konceptualizácia.

Vyhlásenie o konkurenčnom záujme

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne známe konkurenčné finančné záujmy alebo osobné vzťahy, ktoré by mohli ovplyvniť prácu uvádzanú v tomto článku.

Poďakovanie

Túto prácu podporila Čínska národná nadácia pre prírodné vedy (č. 31872533, 31902329, 32072933), Národný kľúčový výskumný a vývojový program Číny (č. 2016YFD0501208) a projekt Prioritného akademického programu Rozvoj vysokoškolského vzdelávania Jiangsu Inštitúcia (PADP). Rukopis bol upravený pre správny anglický jazyk, gramatiku, interpunkciu, pravopis a celkový štýl jedným alebo viacerými vysokokvalifikovanými rodenými anglicky hovoriacimi editormi v ELIXIGEN.

Referencie

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Materská kašička zmierňuje kadmiom indukovanú nefrotoxicitu u samcov myší. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Súbežná expozícia netoxickým hladinám kadmia a fluoridu vyvoláva u potkanov hepatotoxicitu prostredníctvom spúšťanie mitochondriálneho oxidačného poškodenia, apoptózy a dráh NF-kB. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 27 (19), 24048-24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Prášok semien senovky gréckej zmierňuje poškodenie semenníkov vyvolané kadmiom a hepatotoxicitu u samcov potkanov. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293-300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting na Nrf2: ako môže signalizácia Nrf2 ovplyvniť terapeutické aktivity inhibítorov proteínov BET. Bioessays 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Úlohy selenoproteínu S pri tvorbe extracelulárnej pasce neutrofilov závislej od reaktívnych druhov kyslíka indukovanej selénom nedostatočná arteritída. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 riadi vývoj hematopoetických kmeňových buniek a moduluje zápalové reakcie makrofágov. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., nar, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Expozícia kadmiu je spojená s rozpustným receptorom aktivátora plazminogénu urokinázy, cirkulujúcim markerom zápalu a budúcich kardiovaskulárnych ochorení. Environ. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Upstream signalizačné udalosti vedú k zvýšenej produkcii oxidu dusnatého na prežitie vo fotodynamicky napadnutých glioblastómových bunkách. Voľný Radic. Biol. Med. 137, 37-45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variácie rôznych metabolitov a ťažkých kovov v Oryza sativa L., súvisiace s chronickým ochorením obličiek neznámej etiológie na Srí Lanke. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Deplécia NAD(plus) vyvolaná kyselinou palmitovou je spojená so zníženou funkciou SIRT1 a zvýšenou expresiou BACE1 v hipokampálnych neurónoch. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Liečba kadmiom vyvoláva echinokokózu, poškodenie DNA, zápal a apoptózu v srdcovom tkanive albínskych potkanov Wistar. Environ. Toxicol. Pharmacol. 59, 43-52. zápal a rakovina. Biomedicína 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akútna expozícia kadmiu vyvoláva predĺženú neutrofíliu spolu s oneskorenou indukciou faktora stimulujúceho kolónie granulocytov v pečeni myší. Arch. Toxicol. 90 (12), 3005-3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Účinky expozície kadmia pri indukcii zápalu. Immunopharmacol. Imunotoxikol. 42 (1), 1–8.