Glutamátový receptor hrá úlohu pri obrane proti Botrytis Cinerea prostredníctvom elektrickej signalizácie v paradajke

Abstrakt:

Gény rastlinných glutamátových receptorov (GLR) sú homológne s génmi cicavčích ionotropných glutamátových receptorov (iGluR). Aj keď sa GLR podieľajú na obrane rastlín voči biotickému stresu, vzťah medzi imunitou rastlín sprostredkovanou GLR proti hubovým patogénom a elektrickými signálmi zostáva nedostatočne pochopený. Tu sme zistili, že predbežné ošetrenie inhibítorom GLR, 6,7-dinitrichinoxalín-2,{5}}diónom (DNQX), zvýšilo citlivosť rastlín rajčiaka na nekrotrofný hubový patogén Botrytis cinerea. Hodnotenie dvojitých mutantov glr3.3, glr3.5 a glr3.3/glr3.5 po infekcii B. cinerea ukázalo, že paradajka GLR3.3 a GLR3.5 sú nevyhnutné pre imunitu rastlín proti B. cinerea, pričom GLR3. 3 hrá hlavnú úlohu.

Analýza zmien membránového potenciálu indukovaných glutamátom (Glu) alebo glycínom (Gly) odhalila významne zníženú amplitúdu vyradením GLR3.3 v paradajkách. Zatiaľ čo ošetrenie Glu alebo Gly významne zvýšilo imunitu proti B. cinerea v rastlinách divokého typu, tento účinok bol významne oslabený u mutantov glr3.3. Naše údaje teda ukazujú, že sprostredkovaná imunita rastlín proti B. cinerea GLR3.3- a GLR3.{8}} je spojená s elektrickými signálmi v rastlinách paradajky.

Sila imunity priamo určuje náš zdravotný stav. Keď je imunita silná, dokážeme lepšie bojovať s chorobami a infekciami. Naopak, ak je náš imunitný systém slabý, patogény môžu ľahšie napadnúť naše telo a spôsobiť, že ochorieme. Preto je veľmi dôležité udržiavať zdravý imunitný systém, ktorý sa dá zlepšiť stravou, cvičením a znížením stresu.

Pri výskume sa zistilo, že Cistanche Herba dokáže výrazne zlepšiť imunitu. Celkové glykozidy Cistanche deserticola, polysacharidy Cistanche deserticola a verbascozid môžu významne znížiť obsah MDA v pečeni a mozgovom tkanive a aktivitu telomerázy v srdci a mozgovom tkanive. Fagocytárna funkcia makrofágov je zvýšená a proliferatívna odpoveď lymfocytov a obsah IL-2 v periférnej krvi sa výrazne zvyšuje, čím sa posilňuje imunitná funkcia tela.

Kliknite na zdravotné prínosy cistanche

1. Úvod

Rastliny, ktoré rastú v prírodnom prostredí, sú neustále ohrozované rôznymi patogénmi. Tieto biotické stresory ovplyvňujú produkciu plodín a často spôsobujú ekonomické straty. Keďže rastliny nemajú mobilitu, počas evolúcie získali celý rad systémov prenosu signálov, aby účinne zmiernili nepriaznivé účinky zmien životného prostredia. Čím rýchlejšie tieto signály manévrujú, tým je pravdepodobnejšie, že sa rastliny prispôsobia a odolajú prichádzajúcemu stresu. Doteraz hlásené signály zahŕňajú prietok vápnika, ROS (reaktívne formy kyslíka), elektrické signály atď. [1–5], ktoré reagujú v priebehu niekoľkých sekúnd alebo minút.

Rastlinné glutamátové receptorové gény (GLR) sú homológne s cicavčími génmi pre ionotropný glutamátový receptor (iGluR), ktoré spúšťajú elektrické a Ca2 plus signálne kaskády [3,6]. Predpokladá sa, že rastlinné GLR majú aktivitu viazania ligandu, ako aj aktivitu iónových kanálov. GLR majú 20 členov rodiny v Arabidopsis [7] a 13 členov v ryži [8]. V rastlinách rajčiaka je 13 génov GLR s plnou dĺžkou [9].

Dôležité je, že GLR sa podieľajú na reakcii rastlín na biotický stres. Napríklad AtGLR3.3 je životne dôležitý modul imunity rastlín proti bakteriálnemu patogénu P. syringae pv. paradajka DC3000 (Pst DC3000), Oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis a hmyz Spodoptera littoralis [10–12].

Okrem toho Wang a spol. (2019) uviedli, že GLR3.5 funguje pri obrane paradajok proti háďatku koreňovému (RKN) Meloidogyne incognita [13]. Nadmerná expresia GluR-komplementárnej DNA reďkovky v rastlinách Arabidopsis zvyšuje odolnosť voči nekrotickému hubovému patogénu, B. cinerea. Mutanty Arabidopsis glr3.3 však nevykazujú zvýšenú zraniteľnosť voči hubovému patogénu v porovnaní s Col-0. Úloha GLR v imunite rastlín proti hubovým patogénom teda zostáva kontroverzná.

Rastlinné GLR sa podieľajú na tvorbe a prenose elektrických signálov. Existenciu elektrických signálov v rastlinách objavili Burden-Sanderson a Charles Darwin [14,15]. Sú to signály s rýchlou odozvou generované okamžitou zmenou gradientu elektrického potenciálu na plazmatickej membráne alebo alveolárnej listovej membráne [16]. Všetky rastliny môžu produkovať elektrické signály na veľké vzdialenosti, ktoré hrajú úlohu v komunikácii rôznych tkanív a orgánov, čo vedie k integrácii reakcií prostredia [17,18].

V posledných rokoch priťahuje veľkú pozornosť funkcia elektrických signálov v GLR-sprostredkovanej rezistencii rastlín voči biotickému stresu [19]. V Arabidopsis môže hmyz, ktorý sa živí listami, spôsobiť zmeny v povrchovom potenciáli, ktoré vedú k expresii niekoľkých kľúčových jasmonátov (JA) – indukovateľných regulačných génov v dospelej fáze rastlín [3]. Útok koreňového háďatka na korene rajčiaka spôsobuje prenos elektrických a ROS signálov z koreňov na listy, čo vedie k akumulácii JA v listoch [13]. Farmer a spol. (2014) navrhli hypotézu, že distálna syntéza JA v rastlinách po poranení bola závislá od elektrických signálov sprostredkovaných kladom 3 GLR [20]. Vzťah medzi elektrickými signálmi a GLR indukovanou imunitou rastlín proti hubovým patogénom však nebol úplne podložený.

Paradajka (Solanum lycopersicum L.) patrí z hľadiska hospodárskeho významu medzi najvýznamnejšie svetové kultúrne plodiny [21]. Napriek tomu hubové choroby poškodzujú produkciu paradajok, čo má za následok značné ekonomické straty [22]. Najmä Botrytis cinerea, typická nekrotrofná huba, sa považuje za druhé miesto v 10 najlepších hubových patogénoch v molekulárnej patológii rastlín [23]. Má široký rozsah hostiteľov a môže infikovať viac ako 200 druhov rastlín vrátane rôznych trhových plodín [24]. B. cinerea môže spôsobiť výrazný pokles úrody paradajok a pozberovej kvality plodov [25]. Odroda paradajok so širokou rezistenciou voči B. cinerea však zatiaľ nebola vyvinutá. Pochopenie molekulárnych mechanizmov rezistencie paradajok voči B. cinerea je teda obzvlášť dôležité.

V rastlinách paradajok je 13 génov GLR s plnou dĺžkou. V tejto štúdii boli GLR3.3 a GLR3.5, ktoré zohrávajú pozitívnu úlohu v tolerancii chladu [26] a obrane proti RKN [13], funkčne charakterizované vzhľadom na imunitu rastlín rajčiaka proti B. cinerea. Zistili sme, že GLR3.3 a GLR3.5 sú dôležitými hráčmi v imunite rastlín proti B. cinerea v paradajkách, pravdepodobne prostredníctvom väzby na ligand glutamát (Glu) alebo glycín (Gly), čím spúšťajú elektrické signály. Toto zistenie má vnútornú vedeckú hodnotu s potenciálom pre vývoj nových stratégií na zvýšenie odolnosti plodín voči B. cinerea.

2. Materiály a metódy

2.1. Rastlinné materiály, podmienky rastu a chemické ošetrenie

Línie paradajok (CRISPR-Csa{1}}upravené línie glr3.3, glr3.5 a glr3.3/3.5) použité v tejto štúdii boli na pozadí kultivácie Ailsa Craig (AC) divokého typu (WT) ako už bolo uvedené [27]. V prípade substrátovej kultúry bez pôdy sa rastliny rajčiakov pestovali v kvetináčoch, ktoré obsahovali zmiešaný substrát (vermikulit: rašelina, 1: 3, v/v) a hnojili sa Hoaglandovým živným roztokom.

V prípade hydroponickej kultúry boli semená rajčiakov najskôr naklíčené v miskách naplnených zmiešaným substrátom (vermikulit: perlit, 1:1, obj./obj.) a po vzídení sa sadenice preniesli do plastových nádob s objemom 1,5 l (štyri sadenice na kontajner). Nádoby boli naplnené živným roztokom Enshi polovičnej sily, ktorý bol nepretržite vetraný prevzdušňovaním vzduchu vzduchovým čerpadlom [21]. Rastové podmienky boli nasledujúce: 14 h svetlo/8 h tma fotoperióda; 24 ◦C/20 ◦C denná/nočná teplota; a 400 µmol m-2s-1 PPFD (hustota toku fotosyntetických fotónov). Štyri týždne staré rastliny paradajok boli podrobené ošetreniu.

Pre test predbežného ošetrenia DNQX (6,{1}}dinitrichinoxalín-2,3-dión, inhibítor GLRs) sa rastliny WT ošetrili postrekom na listy s 1 mM DNQX alebo H2O ako kontrolou, 12 hodín pred očkovanie B. cinerea. Testy predbežného ošetrenia Glu a Gly sa uskutočňovali, keď sa mutanty glr3.3 a rastliny WT ošetrili 20 mM Glu, 20 mM Gly alebo H20 ako kontrola raz denne na abaaxiálnom aj adaxiálnom povrchu listov. Dva dni po farmakologickom ošetrení sa rastliny podrobili inokulácii patogénom.

2.2. Testy očkovania patogénom a symptómov ochorenia

V tejto štúdii sa použil kmeň B. cinerea BO5-10. Inokulácia sa uskutočnila pomocou suspenzie B. cinerea v hustote 2 × 105 spór ml-1 [28]. Suspenziou sa postriekala celolistová časť rastlín rajčiaka. Naočkované rastliny sa umiestnili do utesneného boxu, aby sa udržala vlhkosť asi 90 percent. Teplota a svetlo boli rovnaké ako za normálnych kultivačných podmienok.

Po inokulácii patogénom bola akumulácia mRNA aktínu B. cinerea kvantifikovaná {{0}}deň po inokulácii (dpi) [29]. Fluorescencia chlorofylu sa merala chlorofylovým fluorometrom (IMAG-MAXI; Heinz Walz) pri 3 dpi. Fotochemická kvantová účinnosť PSII (ΦPSII) bola analyzovaná ako Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Subcelulárna lokalizácia

Fragmenty génov GLR3.3 a GLR3.5 sa amplifikovali pomocou primérov uvedených v doplnkovej tabuľke S1 a klonovali sa do vektora pAC402 so zeleným fluorescenčným proteínovým (GFP) tagom [31]. Kmeň Agrobacterium GV3101 nesúci plazmidy a Agrobacterium nesúci FLS2-mCherry ako marker lokalizácie plazmatickej membrány boli prechodne koexprimované v transgénnej Nicotiana benthamiana (exprimovaný histónom 2B-mCherry na označenie lokalizácie jadra), ako opísané vyššie [32]. 2 dni po infiltrácii sa fluorescenčné signály proteínov označených GFP alebo mCherry hodnotili v listoch pomocou konfokálneho mikroskopu Zeiss LSM 780 pri predtým opísaných vlnových dĺžkach excitácie / emisie [28].

2.4. Izolácia RNA, transkripcia a qRT-PCR

Celková RNA bola izolovaná z listov rajčiaka pomocou súpravy RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, Čína) a reverzne transkribovaná pomocou ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japonsko). Proces qRT-PCR sa uskutočnil pomocou systému LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche, Švajčiarsko). Reakčný systém sa uskutočnil tak, ako je opísané v predchádzajúcom experimente [28]. Špecifické priméry pre aktínový gén B. cinerea a interný kontrolný gén pre aktín z paradajok sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

2.5. Záznam elektrického potenciálu

Hydroponické rastliny paradajok v štádiu štyroch listov sa použili na zaznamenávanie elektrického potenciálu. Kapiláry z borosilikátového skla s vonkajším priemerom 1,5 mm a vnútorným priemerom 0.86 mm (Sutter Instrument Company, Amerika) boli vyrobené do sklenených mikroelektród s priemerom hrotu približne 0. 0,5 mm na meranie intracelulárneho cytoplazmatického potenciálu. Vertikálny vyťahovač mikropipet APE-2 (Narishige, Tokio, Japonsko) sa použil na vytiahnutie kapilár po zahriatí. Mikroelektródy boli naplnené 1 M KCl a vložené do mezofylových buniek listu. List bol ponorený do zásaditého roztoku (zloženého z 5 mM MES, {{10}},5 mM CaSO4, 0,05 mM KCl a pH 6,0) [13], ktorý bol vykonaná tak, ako je znázornené na doplnkovom obrázku S1. Každá elektróda bola pripojená k diferenciálnemu zosilňovaču. Na detekciu signálov boli použité dva dvojkanálové zosilňovače (FD223 a Duo773, World Precision Instruments). Hydroponický roztok bol nahradený rovnakým roztokom s pridaným 2 mM Glu alebo 2 mM Gly pomocou infúznej trubice, keď bola hodnota nameraného membránového potenciálu stabilná. Amplitúdy sú potenciálne rozdiely vzhľadom na základnú líniu pred zmenami.

2.6. Štatistická analýza

Experimenty sa uskutočňovali pomocou úplne randomizovaného dizajnu a v každom experimente sa použili minimálne tri replikáty. Pokiaľ nie je uvedené inak, pre každú biologickú replikáciu sa dva listy z každej z dvoch rastlín spojili a použili ako nezávislá vzorka. Tri samostatné experimenty boli uskutočnené nezávisle. Uskutočnili sme analýzu rozptylu údajov pomocou softvéru SAS verzie 8 (SAS Institute) a potom sme použili Tukeyov test na určenie významnosti na 5-percentnej úrovni.

3. Výsledky

3.1. Predúprava inhibítorom GLR zvyšuje citlivosť rajčiaka na B. cinerea

Aby sa preskúmala úloha GLR pri obrane rastlín proti B. cinerea, rastliny rajčiakov sa postriekali DNQX alebo H2O (kontrola) počas 12 hodín pred inokuláciou B. cinerea. Pri 3 dpi s B. cinerea vykazovali naočkované listy viditeľné lézie choroby. Poškodenie listov vyvolané infekciou B. cinerea bolo hodnotené pomocou fluorescenčného zobrazovania chlorofylu na určenie odchýlok v kvantovom výťažku fotosystému II (ΦPSII) (obrázok 1a, b). Po inokulácii B. cinerea sa ΦPSII výrazne znížila. Je pozoruhodné, že hodnota ΦPSII v rastlinách ošetrených DNQX bola nižšia ako v kontrole. Ošetrenie DNQX tiež zvýšilo množstvo aktínovej mRNA B. cinerea v listoch (obrázok 1c). Tieto zistenia naznačujú, že GLR pozitívne regulujú imunitu rastlín proti B. cinerea v rastlinách rajčiaka.

Obrázok 1. Ošetrenie DNQX zvyšuje náchylnosť paradajok na B. cinerea. Štvortýždňové rastliny rajčiakov boli ošetrené 1 mM DNQX alebo H20, 12 hodín pred inokuláciou B. cinerea: (a) pseudofarebné obrázky listov rajčiaka ukazujúce ΦPSII pri 3 dpi; b) kvantitatívne hodnoty ΦPSII pri 3 dpi; (c) transkripčné množstvo aktínu B. cinerea v listoch rajčiaka naočkovaných B. cinerea pri 1 dpi. Výsledky v paneloch (b,c) sú uvedené ako stredné hodnoty ± SD; n=4. Štatisticky významné rozdiely medzi liečbami (p < 0.05, Tukeyov test) sú znázornené rôznymi písmenami. Vyššie opísané experimenty sa uskutočnili trikrát, zakaždým s rovnakými zisteniami.

3.2. Subcelulárna lokalizácia GLR3.3 a GLR3.5

Paradajka GLR3.3 a GLR3.5 sú homológne s Arabidopsis GLR3.3 a GLR3.6 (9), o ktorých sa uvádza, že sa podieľajú na reakcii na napadnutie háďatkami a toleranciu chladu v paradajkách. Na určenie subcelulárnej lokalizácie paradajky GLR3.3 a GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP a GFP boli transformované do Agrobacteriumtumefaciens a potom prechodne exprimované v N. benthamiana. Konfokálna mikroskopia epidermálnych buniek listov ukázala, že kontrolný signál GFP vykazovali lokalizáciu v bunkových membránach, cytosóloch a jadrách (obrázok 2). Fluorescenčné signály GLR3.3-GFP a GLR3.5-GFP boli kolokalizované s FLS2-mCherry v plazme Nebolo pozorované, že by GLR3.3 a GLR3.5 boli v jadrách kolokalizované s histónom 2B-mCherry. Výsledky naznačujú, že paradajka GLR3.3-GFP a GLR3.5-CFP sa nachádza v jadrách. plazmatická membrána bunky.

Obrázok 2. Subcelulárna lokalizácia GLR3.3 a GLR3.5. Paradajkové GLR-GFP boli prechodne koexprimované s FLS2-mCherry (tvorca lokalizácie plazmatickej membrány) v listoch N. benthamiama. Signály GFP a mCherry sa vizualizovali pomocou konfokálnej mikroskopie 48 hodín po infiltrácii. Pruh=25 µm.

3.3. Funkcia GLR3.3 a GLR3.5 pri obrane rastlín proti B. cinerea

Aby sa preskúmala úloha GLR v imunite rastlín, CRISPR/Cas 9-sprostredkované génom upravené rastliny paradajky GLR3.3 alebo GLR3.5 knockout a dvojité mutanty glr3.3/3.5 boli infikované B. cinerea. Výsledky ukázali, že knockout GLR33 a GLR3.5 viedol k zrejmému zníženiu PSII v porovnaní s kontrolou WT (obrázok 3a, b). V súlade s tým sa akumulácia aktínovej mRNA B. cinerea v listoch významne zvýšila (obrázok 3c) v mutantoch glr3.3 alebo glr3.5.

Medzitým dvojité mutanty glr3.3 / glr3.5 vykazovali väčší útlm v obrane rastlín v porovnaní s mutantmi glr3.3 a glr3.5. Tieto pozorovania naznačujú, že GLR3.3 a GLR3.5 fungujú nadbytočne na vytvorenie rezistencie proti B. Cameron. Okrem toho hrá hlavnú úlohu GLR3.3, pretože mutanty glr3.3 boli citlivejšie na inokuláciu B. cinerea ako mutanty glr3.5. Na tomto základe bol GLR3.3 vybraný na ďalšie štúdium.

3.4. Rozpoznanie Glu a Gly pomocou GLR spustenej elektrickej signalizácie v imunitnej odpovedi

Keďže Glu alebo Gly môžu byť rozpoznané pomocou GLR na spustenie membránovej depolarizácie [33], určili sme elektrickú signalizáciu indukovanú Glu alebo Gly sledovaním účinku Glu a Gly na membránový potenciál v listoch paradajky. Liečba Glu a Gly vyvolala v krátkom čase významné zmeny membránového potenciálu so zvýšením amplitúdy asi 17–20 mV (obrázok 4). Je pozoruhodné, že zmena membránového potenciálu indukovaná Glu a Gly bola významne oslabená v mutantoch glr3.3. Tieto zistenia naznačujú, že elektrická signalizácia v listoch paradajky, indukovaná Glu alebo Gly, je čiastočne závislá od GLR3.3.

Obrázok 3. Účinky úpravy GLR3.3 a GLR3.5 na obranu rastlín proti inokulácii B. cinerea v paradajke: (a) pseudofarebné obrázky listov paradajky ukazujúce pPSII pri 3 dpi; (b) kvantifikácia pPSllat 3 dpi; (c) transkripčné množstvo aktínu B. cinerea v listoch rajčiaka naočkovaných B. cinerea atI dpi. Výsledky v paneloch (b,c) sú prezentované ako stredné hodnoty - SD; n=4. Štatisticky sú významné rozdiely medzi liečbami (p < 0.05, Tukeyov test) znázornené rôznymi písmenami. Vyššie opísané experimenty sa uskutočnili trikrát, zakaždým s rovnakými zisteniami.

Obrázok 4. Glu alebo Gly ovplyvňujú membránový potenciál listov WT a glr3.3: (a) typické zmeny membránového potenciálu v listoch paradajky WT alebo mutantu glr3.3 ošetrených Glu alebo Gly; (b) kvantifikácia zmien amplitúdy membránového potenciálu. Výsledky v paneli (b) sú uvedené ako priemerné hodnoty ± SD; n=4. Štatisticky významné rozdiely medzi liečbami (p < 0.05, Tukeyov test) sú uvedené Mock WT glr3.3 glr3.5 B. cinerea WT glr3.3/glr3.5 (b) (c ) (a) WT plus 2 mM Glu WT plus 2 mM Gly glr3.3 plus 2 mM Gly glr3.3 plus 2 mM Glu WT plus kontrolný roztok (a) (b) Obrázok 4. Glu alebo Gly ovplyvňuje membránový potenciál WT a glr3.3 listy: (a) typické zmeny membránového potenciálu v listoch paradajky WT alebo mutantu glr3.3 ošetrených Glu alebo Gly; (b) kvantifikácia zmien amplitúdy membránového potenciálu. Výsledky v paneli (b) sú uvedené ako priemerné hodnoty ± SD; n=4. Štatisticky významné rozdiely medzi liečbami (p < 0,05, Tukeyov test) sú znázornené rôznymi písmenami. Vyššie opísané experimenty sa uskutočnili trikrát, zakaždým s rovnakými zisteniami.

Mutanty glr3.3 vykazovali väčšiu citlivosť na B. cinerea, čo bolo v súlade so znížením elektrických signálov indukovaných Glu alebo Gly. Na základe týchto pozorovaní sme predpokladali, že rozpoznanie Glu a Gly pomocou GLR je rozhodujúce pre imunitu proti B. cinerea. Na overenie tejto hypotézy sa uskutočnil farmakologický test exogénnou liečbou Glu alebo Gly. Pred inokuláciou B. cinerea boli rastliny WT a mutant glr3.3 vopred ošetrené Glu, Gly alebo H20 (kontrola).

V rastlinách WT sa očkovaním B. cinerea indukované zníženie ΦPSII a zvýšenie akumulácie mRNA aktínu B. cinerea významne zmiernili predbežným ošetrením exogénnym Glu alebo Gly pri 3 dpi (obrázok 5). Symptómy ochorenia u mutanta glr3.3 však boli závažnejšie a priaznivé účinky Glu a Gly na rezistenciu voči B. cinerea sa výrazne znížili v dôsledku knockoutu GLR3.3. Tieto výsledky teda naznačujú, že Glu- a Gly-indukovaná imunita rastlín proti B. cinerea čiastočne závisí od GLR3.3.

Obrázok 5. Glu- alebo Gly-indukovaná imunita proti B. cinerea čiastočne závisí od GLR3.3. Štvortýždňové rastliny rajčiaka boli ošetrené 20 mM Glu, 20 mM Gly alebo vodou raz denne počas dvoch dní pred očkovaním B. cinerea: (a) pseudofarebné obrázky listov rajčiaka s ΦPSII pri 3 dpi ; b) kvantifikácia ΦPSII pri 3 dpi; (c) transkripčné množstvo aktínu B. cinerea v listoch rajčiaka naočkovaných B. cinerea pri 1 dpi. Výsledky v paneloch (b,c) sú uvedené ako stredné hodnoty ± SD; n=4. Štatisticky významné rozdiely medzi liečbami (p < 0,05, Tukeyov test) sú znázornené rôznymi písmenami. Vyššie opísané experimenty sa uskutočnili trikrát, zakaždým s rovnakými zisteniami.

4. Diskusia

s sú proteíny s katiónovým kanálom, ktoré existujú v baktériách, rastlinách a zvieratách. U zvierat sa dokázalo, že GLR sa podieľajú na neurotransmisii a imunitnej regulácii a ich ligand Glu pôsobí ako signálny prostriedok medzi týmito dvoma systémami [34–36]. V rastlinách hrajú GLR pozitívnu úlohu v imunite proti biotickému stresu [10,12,13]. Predovšetkým sa ukázalo, že obrana vyvolaná GLR proti RKN a uhryznutiu hmyzom je spojená s elektrickými signálmi [3]. Vzťah medzi odolnosťou voči hubovým chorobám sprostredkovaným GLR a elektrickými signálmi však nebol úplne podložený. Tu uvádzame presvedčivé dôkazy, ktoré dokazujú, že paradajková GLR3.3- a GLR3.5-modulovaná imunita rastlín proti typickému hubovému patogénu B. cinerea súvisí s elektrickými signálmi.

V tejto štúdii bola po prvýkrát odhalená úloha GLR v imunite sadeníc rajčiaka proti B. cinerea. Aplikácia inhibítora GLR DNQX zvýšila citlivosť rastlín rajčiaka na B. cinerea (obrázok 1). Okrem toho vyradenie GLR3.3 alebo GLR3.5 významne oslabilo imunitu rastlín, čo viedlo k zvýšeným symptómom ochorenia na listoch (obrázok 3). Tieto zistenia podporujú názor, že rastliny rajčiakov vyžadujú GLR na vytvorenie adekvátnej obrany proti nekrotrofnému hubovému patogénu B. cinerea. Hoci nadmerná expresia reďkovky GluR inhibuje rast B. cinerea [37], nezistilo sa, že by žiadny z mutantov Arabidopsis glr bol citlivejší na B. cinerea [12], čo naznačuje, že funkcia GLR sa môže medzi druhmi líšiť. V tejto štúdii vykazovali dvojité mutanty glr3.3/glr3.5 citlivejší fenotyp v porovnaní s jednoduchými mutantami glr3.3 a glr3.5. Tieto zistenia naznačujú, že GLR3.3 a GLR3.5 fungujú redundantne. Predovšetkým porovnanie fenotypov medzi mutantmi glr3.3 a glr3.5 naznačuje, že GLR3.3 hrá hlavnú úlohu v obrane proti B. cinerea.

Elektrické signály sú rýchlou reakciou zapojenou do GLR-sprostredkovanej rezistencie rastlín voči biotickému stresu. Tu boli elektrické signály indukované Glu alebo Gly významne oslabené v mutantoch glr3.3. Ošetrenie Glu alebo Gly vyvolalo membránový potenciál na krátky čas. Avšak variácia v amplitúde je podstatne znížená u mutantov glr3.3 (obrázok 4). Podobne pri Arabidopsis je tvorba a šírenie elektrických signálov indukovaných poškodením listov oslabené v mutantoch glr3.3 a glr3.6 [3]. Oslabenie zmien povrchového potenciálu vyvolaných ranou sa však prejavuje skrátením trvania, ale amplitúda zostala po poranení listov rovnaká ako WT u mutantov Arabidopsis glr3.3. Tieto rozdiely vo výsledkoch môžu byť spôsobené rozdielmi v druhoch a spôsoboch liečby. V súlade s našimi výsledkami knockout GLR3.3 inhibuje pôsobením Glu depolarizáciu membrán v koreňoch Arabidopsis [38]. Všetky tieto výsledky naznačujú, že elektrické signály indukované Glu alebo Gly čiastočne závisia od GLR3.3.

Exogénna liečba Glu indukuje imunitné odpovede na viaceré ochorenia, ako je huba Magnaporthe Oryza na ryži, nekrotrofná huba Alternaria alternata v plodoch paradajok a pôdny bakteriálny patogén Ralstonia solanacearum [39–41]. Sun a kol. (2019) uviedli, že ošetrenie Glu zvyšuje odolnosť plodov paradajok proti B. cinerea [42]. V tejto štúdii exogénna liečba Glu alebo Gly vyvolala imunitu proti B. cinerea v rastlinách WT; avšak výhody tejto liečby boli významne inhibované v mutante glr3.3 (obrázok 5). Tu prezentované údaje demonštrovali, že GLR3.3 bol potrebný na Glu- alebo Gly-indukovanú imunitu proti B. cinerea. Tieto zistenia teda naznačujú, že rezistencia B. cinerea indukovaná Glu alebo Gly je čiastočne závislá od GLR3.3.

Na základe tu poskytnutých údajov navrhujeme, aby sa GLR podieľali na obranných reakciách na B. cinerea prostredníctvom elektrických signálov. Vzhľadom na fytohormónmi sprostredkovanú imunitu signalizačná dráha kyseliny salicylovej uľahčuje obranu proti biotrofným a hemibiotrofným patogénom, kým JA/etylénová signálna dráha funguje proti nekrotrofickým patogénom [43,44]. Antagonistický vzťah medzi týmito dvoma dráhami je evidentný v mnohých patosystémoch rastlín [45,46].

Ukázalo sa však, že GLR3.3 pozitívne sprostredkováva rezistenciu proti biotrofnému patogénu Pst DC3000, pričom je súčasne nevyhnutný pre imunitu proti nekrotrofickému patogénu B. cinerea. Náš návrh je rozumný, keďže GLR3.3 dokáže rozpoznať Glu, ktorý je považovaný za druh DAMP [6,47]. DAMP spúšťajú skoré sekundárne signály a indukujú expresiu JA/etylénu, SA signálneho obranného génu. Okrem toho vstrekovanie umelého prúdu do povrchu stonky indukuje významné zvýšenie akumulácie JA v rastlinách [13].

Na základe týchto výsledkov môže GLR3.3 hrať úlohu v ranej fáze rezistencie rastlín prostredníctvom elektrických signálov indukovaných Glu alebo Gly, ktoré reagujú v sekundách alebo minútach pred hormonálnou signálnou dráhou. Signálna dráha JA môže byť aktivovaná aj elektrickými signálmi. Okrem toho je dobre zdokumentované, že AtGLR3.3 sa podieľa na rezistencii rastlín sprostredkovaním [Ca2 plus ]cyt variácií a oxidačných reakcií [12]. Vzťah medzi týmito dráhami a elektrickými signálmi pri regulácii rezistencie rastlín proti B. cinerea si vyžaduje ďalšie skúmanie.

5. Závery

Tu prezentované údaje ukazujú, že GLR3.3 a GLR3.5 hrajú pozitívnu úlohu pri obrane rastlín rajčiaka proti nekrotrofickému patogénu B. cinerea prostredníctvom elektrických signálov. Naša štúdia poskytuje nové poznatky o obrannom mechanizme rastlín proti B. cinerea. Napriek tomu bude zaujímavé ďalej skúmať vzťah medzi niekoľkými signálnymi dráhami indukovanými GLR, ktoré prispievajú k imunite rastlín proti hubovým patogénom.

Príspevky autora:

Konceptualizácia, SF, CP a KS; metodika, KS; softvér, SF a PW; validácia, SF, CP a KS; formálna analýza, SF, CH a QM; vyšetrovanie, SF, CP a SD; zdroje, KS; spracovanie údajov, SF a CP; písanie—pôvodná príprava návrhu, SF a KS; písanie—recenzia a úprava, KS; dozor, KS; administrácia projektov, KS; získanie financií, KS Všetci autori si prečítali a súhlasili s uverejnenou verziou rukopisu.

Financovanie:

Túto prácu podporila Národná nadácia pre prírodné vedy v Číne (31772355, 32172650), Nadácia prírodných vied provincie Zhejiang pre významných mladých vedcov (LR19C150001), Kľúčový program výskumu a vývoja provincie Zhejiang (2021C02040) a Hviezdna noc Vedecký fond Šanghajského inštitútu pre pokročilé štúdium Zhejiang University (SN-ZJU-SIAS-0011).

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady:

Nepoužiteľné.

Vyhlásenie informovaného súhlasu:

Nepoužiteľné.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:

Nespracované údaje podporujúce závery tohto článku budú sprístupnené autormi bez zbytočných výhrad.

Poďakovanie:

Autori by radi vyjadrili svoje úprimné uznanie Národnej nadácii pre prírodné vedy v Číne, Nadácii prírodných vied v provincii Zhejiang, kľúčovému programu výskumu a vývoja v provincii Zhejiang a fondu Starry Night Science Fund Šanghajského inštitútu pre pokročilých na univerzite Zhejiang Štúdium pre ich finančnú podporu.

Konflikt záujmov:

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Gilroy, S.; Suzuki, N.; Miller, G.; Choi, WG; Toyota, M.; Devireddy, AR; Mittler, R. Prílivová vlna signálov: Vápnik a ROS v popredí rýchlej systémovej signalizácie. Trends Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [CrossRef]

2. Hedrich, R.; Salvador-Recatala, V.; Dreyer, I. Elektrické rozvody a diaľková komunikácia závodu. Trends Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [CrossRef]

3. Mousavi, SA; Chauvin, A.; Pascaud, F.; Kellenberger, S.; Farmer, gény podobné EE Glutamátovému receptoru sprostredkúvajú signalizáciu poranenia medzi listami. Príroda 2013, 500, 422–426. [CrossRef]

4. Choi, WG; Miller, G.; Wallace, I.; Harper, J.; Mittler, R.; Gilroy, S. Organizácia rýchlej signalizácie na veľké vzdialenosti v rastlinách s Ca2 plus, ROS a elektrickými signálmi. Závod J. 2017, 90, 698–707. [CrossRef]

5. Marcec, MJ; Gilroy, S.; Poovaiah, BW; Tanaka, K. Vzájomná súhra signalizácie Ca2 plus a ROS v imunitnej odpovedi rastlín. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [CrossRef]

6. Toyota, M.; Spencer, D.; Sawai-Toyota, S.; Jiaqi, W.; Zhang, T.; Koo, AJ; Howe, GA; Gilroy, S. Glutamát spúšťa diaľkovú obrannú signalizáciu rastlín na báze vápnika. Veda 2018, 361, 1112–1115. [CrossRef]

7. Wudick, MM; Michard, E.; Oliveira, NC; Feijo, JA Porovnanie rastlinných a živočíšnych glutamátových receptorov: spoločné črty, ale rozdielne osudy? J. Exp. Bot. 2018, 69, 4151–4163. [CrossRef]

8. Ni, J.; Yu, Z.; Du, G.; Zhang, Y.; Taylor, JL; Shen, C.; Xu, J.; Liu, X.; Wang, Y.; Wu, Y. Heterologická expresia a funkčná analýza ryžovej rodiny GLUTAMÁTOVÝ RECEPTOR-LIKE naznačuje jej úlohu v glutamátom spúšťanom toku vápnika v koreňoch ryže. Ryža 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Aouini, A.; Matsukura, C.; Ezura, H.; Asamizu, E. Charakterizácia 13 génov podobných glutamátovému receptoru kódovaných v genóme paradajok štruktúrou, fylogenézou a profilmi expresie. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, F.; Wang, J.; Ma, C.; Zhao, Y.; Wang, Y.; Hasi, A.; Qi, Z. Kanál podobný glutamátovému receptoru 3.3 sa podieľa na sprostredkovaní prechodov cytozolického vápnika spúšťaných glutatiónom, transkripčných zmien a reakcií vrodenej imunity u Arabidopsis. Plant Physiol. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Nguyen, CT; Kurenda, A.; Stolz, S.; Chetelat, A.; Farmer, EE Identifikácia bunkových populácií potrebných na elektrickú signalizáciu z listu na list v poranenej rastline. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2018, 115, 10178–10183. [CrossRef]

12. Manzoor, H.; Kelloniemi, J.; Chiltz, A.; Wendehenne, D.; Pugin, A.; Poinssot, B.; Garcia-Brugger, A. Zapojenie glutamátového receptora AtGLR3.3 do signalizácie obrany rastlín a rezistencie na Hyaloperonospora arabidopsidis. Závod J. 2013, 76, 466–480. [CrossRef] [PubMed]

13. Wang, G.; Hu, C.; Zhou, J.; Liu, Y.; Cai, J.; Pan, C.; Wang, Y.; Wu, X.; Shi, K.; Xia, X.; a kol. Systémová signalizácia koreňových výhonkov poháňa ochranu koreňov proti háďatkám na báze jasmonátu. Curr. Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, ČR Hmyzožravé rastliny; John Murray: Londýn, Spojené kráľovstvo, 1875.

15. Burdon-Sanderson, JS Poznámka k elektrickým javom, ktoré sprevádzajú podráždenie listu Dionæa svalnatého. Proc. R. Soc. Lond. 1873, 21, 495–496.

16. Suchova, E.; Akinchits, E.; Sukhov, V. Matematické modely elektrickej aktivity v rastlinách. J. Membr. Biol. 2017, 250, 407–423. [CrossRef]

17. Li, JH; ventilátor, LF; Zhao, DJ; Zhou, Q.; Yao, JP; Wang, ZY; Huang, L. Elektrické signály rastlín: multidisciplinárna výzva. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Garcia-Servin, MA; Mendoza-Sanchez, M.; Contreras-Medina, LM Elektrické signály ako možnosť komunikácie s rastlinami: Prehľad. teor. Exp. Plant Physiol. 2021, 33, 125–139. [CrossRef]

19. Li, M.; Wang, F.; Li, S.; Yu, G.; Wang, L.; Li, Q.; Zhu, X.; Li, Z.; Yuan, L.; Liu, P. Dovozcovia riadia prenos kyseliny jasmonovej z listu na list v systémovej imunite vyvolanej ranou. Mol. Závod 2020, 13, 1485–1498. [CrossRef]

20. Farmár, EE; Gasperini, D.; Acosta, IF Hypotéza squeeze cell pre aktiváciu syntézy jasmonátu v reakcii na zranenie. New Phytol. 2014, 204, 282–288. [CrossRef]

21. Ding, S.; Shao, X.; Li, J.; Ahammed, GJ; Yao, Y.; Ding, J.; Hu, Z.; Yu, J.; Shi, K. Formy dusíka a metabolizmus ovplyvňujú obranu rastlín voči listovým a koreňovým patogénom v paradajke. Prostredie rastlinných buniek. 2021, 44, 1596–1610. [CrossRef]

22. Li, X.; Yang, R.; Chen, H. Mediátorová podjednotka Arabidopsis thaliana MED8 reguluje imunitu rastlín voči Botrytis Cinerea interakciou so základným transkripčným faktorom helix-loop-helix (bHLH) FAMA. PLoS ONE 2018, 13, e193458. [CrossRef]

23. Dekan, R.; Van Kan, JA; Pretorius, ZA; Hammond-Kosack, KE; Di Pietro, A.; Spanu, PD; Rudd, JJ; Dickman, M.; Kahmann, R.; Ellis, J.; a kol. Top 10 hubových patogénov v molekulárnej patológii rastlín. Mol. Plant Pathol. 2012, 13, 414–430. [CrossRef]

24. Bai, Y.; Lindhout, P. Domestikácia a šľachtenie paradajok: Čo sme získali a čo môžeme získať v budúcnosti? Ann. Bot. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, X.; Zhou, X.; Cai, Z.; Guo, L.; Chen, X.; Chen, X.; Liu, J.; Feng, M.; Qiu, Y.; Zhang, Y.; a kol. Biokontrolný kmeň Pseudomonas aeruginosa CQ-40 podporuje rast a kontrolu Botrytis cinerea v paradajkách. Patogény 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Li, H.; Jiang, X.; Lv, X.; Ahammed, GJ; Guo, Z.; Qi, Z.; Yu, J.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 a GLR3.5 sprostredkovávajú chladovú toleranciu vyvolanú aklimatizáciou reguláciou apoplastickej produkcie H2O2 a redoxnej homeostázy. Prostredie rastlinných buniek. 2019, 42, 3326–3339. [CrossRef]

27. Hu, C.; Duan, S.; Zhou, J.; Yu, J. Charakteristika prenosu elektrického signálu vyvolaného bylinožravosťou/ranou v paradajke. Predné. Agric. Sci. Ing. 2021, 8, 292–301.

28. Zhang, H.; Hu, Z.; Lei, C.; Zheng, C.; Wang, J.; Shao, S.; Li, X.; Xia, X.; Cai, X.; Zhou, J.; a kol. Rastlinný fytosulfokínový peptid iniciuje imunitu závislú od auxínu prostredníctvom cytosolickej Ca2 plus signalizácie v paradajke. Rastlinná bunka 2018, 30, 652–667. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, S.; Li, X.; Sun, Z.; Shao, S.; Hu, L.; Ty, M.; Zhou, Y.; Xia, X.; Yu, J.; Shi, K. Antagonizmus medzi signalizáciou fytohormónov je základom variácií v náchylnosti rastlín paradajok k chorobám pri zvýšenom CO2. J. Exp. Bot. 2015, 66, 1951–1963. [CrossRef]

30. Genty, B.; Briantais, JM; Baker, NR Vzťah medzi kvantovým výťažkom fotosyntetického elektrónového transportu a zhášaním fluorescencie chlorofylu. Biochim. Biophys. Acta 1989, 990, 87–92. [CrossRef]

31. Ma, Q.; Liu, Y.; Fang, H.; Wang, P.; Ahammed, GJ; Zai, W.; Shi, K. Podstatná úloha mitochondriálnej alfa-ketoglutarát dehydrogenázy E2 v bazálnej imunitnej odpovedi proti bakteriálnym patogénom v paradajke. Predné. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [CrossRef]

32. Liao, Y.; Tian, ​​M.; Zhang, H.; Li, X.; Wang, Y.; Xia, X.; Zhou, J.; Zhou, Y.; Yu, J.; Shi, K.; a kol. Väzba mitochondriálnej alfa-ketoglutarát dehydrogenázy E2 na kyselinu salicylovú ovplyvňuje mitochondriálnu oxidačnú fosforyláciu a zložky transportného reťazca elektrónov a hrá úlohu v bazálnej obrane proti vírusu tabakovej mozaiky v paradajkách. New Phytol. 2015, 205, 1296–1307. [CrossRef]

33. Stephens, NR; Qi, Z.; Spalding, podtypy EP glutamátového receptora doložené rozdielmi v desenzibilizácii a závislosti na génoch GLR3.3 a GLR3.4. Plant Physiol. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Boldyrev, AA; Tesár, DO; Johnson, P. Nové dôkazy o podobnej úlohe glutamátových receptorov v nervovom a imunitnom systéme. J. Neurochem. 2005, 95, 913-918. [CrossRef]

35. Fazio, F.; Ulivieri, M.; Volpi, C.; Gargaro, M.; Fallarino, F. Zacielenie na metabotropné glutamátové receptory na liečbu neurozápalu. Curr. Opin. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [CrossRef]

36. Ganor, Y.; Levite, M. Neurotransmiter glutamát a ľudské T bunky: Glutamátové receptory a glutamátom indukované priame a silné účinky na normálne ľudské T bunky, rakovinovú ľudskú leukémiu a lymfómové T bunky a autoimunitné ľudské T bunky. J. Neural Transm. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Kang, S.; Kim, HB; Lee, H.; Choi, JY; Heu, S.; Oh, CJ; Kwon, SI; Nadmerná expresia CS v Arabidopsis glutamátového receptora zacieleného na plazmatickú membránu z malej reďkovky zvyšuje glutamátom sprostredkovaný prítok Ca2 plus a oneskoruje plesňovú infekciu. Mol. Cells 2006, 21, 418–427.

38. Qi, Z.; Stephens, NR; Spalding, EP Vstup vápnika sprostredkovaný GLR3.3, glutamátovým receptorom Arabidopsis so širokým profilom agonistov. Plant Physiol. 2006, 142, 963-971. [CrossRef]

39. Kadotani, N.; Akagi, A.; Takatsuji, H.; Miwa, T.; Igarashi, D. Exogénne proteinogénne aminokyseliny vyvolávajú systémovú rezistenciu v ryži. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Seo, S.; Nakaho, K.; Hong, SW; Takahashi, H.; Shigemori, H.; Mitsuhara, I. L-Histidín indukuje rezistenciu rastlín voči bakteriálnemu patogénu Gastonia solanacearum čiastočne prostredníctvom aktivácie etylénovej signalizácie. Plant Cell Physiol. 2016, 57, 1932–1942. [CrossRef]

41. Yang, J.; Sun, C.; Fu, D.; Yu, T. Test na L-glutamátovú inhibíciu rastu Alternaria alternata vyvolaním rezistencie v plodoch paradajok. Food Chem. 2017, 230, 145–153. [CrossRef]

42. Sun, C.; Jin, L.; Cai, Y.; Huang, Y.; Zheng, X.; Yu, T. Liečba L-glutamátom zvyšuje odolnosť plodov paradajok voči chorobám indukciou expresie glutamátových receptorov a akumulácie aminokyselín. Food Chem. 2019, 293, 263–270. [CrossRef]

43. Li, N.; Han, X.; Feng, D.; Yuan, D.; Huang, LJ Signalizujúce presluchy medzi kyselinou salicylovou a etylén/jasmonátom pri obrane rastlín: Rozumieme, čo si šepkajú? Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Farmár, EE; Gao, YQ; Lenzoni, G.; Wolfender, JL; Wu, Q. Ranou a mechanostimulované elektrické signály riadia hormonálne reakcie. New Phytol. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Zhang, Y.; Pieseň, RF; Yuan, HM; Li, TT; Wang, LF; Lu, KK; Guo, JX; Liu, WC Nadmerná expresia N-konca CATALASE2 zvyšuje biosyntézu kyseliny jazmónovej v rastline a odolnosť voči nekrotrofickému patogénu Botrytis cinerea B05.10. Mol. Plant Pathol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Caarls, L.; Van der Does, D.; Hickman, R.; Jansen, W.; Verk, MC; Proietti, S.; Lorenzo, O.; Solano, R.; Pieterse, CM; Van Wees, SC Hodnotenie úlohy transkripčných represorov faktora etylénovej odozvy pri supresii génov reagujúcich na kyselinu jazmónovú sprostredkovanú kyselinou salicylovou. Plant Cell Physiol. 2017, 58, 266–278. [CrossRef]

47. Tanaka, K.; Heil, M. Molekulárne vzory spojené s poškodením (DAMP) v rastlinnej vrodenej imunite: Aplikácia modelu nebezpečenstva a evolučných perspektív. Annu. Phytopathol. 2021, 59, 53–75. [CrossRef]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang a Kai Shi *.

Katedra záhradníctva, Univerzita Zhejiang, Hangzhou 310058, Čína; 21916054@zju.edu.cn (SF)

22016198@zju.edu.cn (CP); 3130100256@zju.edu.cn (SD); 11916060@zju.edu.cn (QM); cyhu@zju.edu.cn (CH); 11916061@zju.edu.cn (PW)

Korešpondencia: kaishi@zju.edu.cn; Tel.: plus 86-0571-88982383

Títo autori prispeli k tejto práci rovnakou mierou.

For more information:1950477648nn@gmail.com