Glyoxalázový systém pri chorobách súvisiacich s vekom: Nutričná intervencia ako stratégia proti starnutiu, časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Glyoxalázový systém je kritický pre detoxikáciu konečných produktov pokročilej glykácie (AGE). AGE sú toxické zlúčeniny, ktoré vznikajú neenzymatickou modifikáciou biomolekúl cukrami alebo ich metabolitmi prostredníctvom procesu nazývaného glykácia. AGE majú nepriaznivé účinky na mnohé tkanivá, pričom zohrávajú patogénnu úlohu v progresii molekulárneho a bunkového starnutia. V dôsledku vekom podmieneného poklesu rôznych anti-AGE mechanizmov, vrátane detoxikačných mechanizmov a proteolytických kapacít, sa počas normálneho starnutia v našom tele akumulujú glykované biomolekuly v závislosti od tkaniva. Z tohto pohľadu sú anti-AGE detoxikačné systémy navrhované ako terapeutické ciele na boj proti patologickej dysfunkcii spojenej s akumuláciou AGE a cytotoxicitou. Tu zhrnieme súčasný stav poznatkov týkajúcich sa ochranných mechanizmov proti glykačnému stresu s osobitným dôrazom na systém glyoxalázy ako primárneho mechanizmu detoxikácie reaktívnych medziproduktov glykácie. Tento prehľad sa zameriava na glyoxalázu 1 (GLO1), prvý enzým systému glyoxalázy a enzým obmedzujúci rýchlosť tohto katalytického procesu. Hoci je GLO1 všadeprítomne exprimovaný, hladiny proteínov a aktivity sú regulované spôsobom závislým od tkaniva. Poskytujeme porovnávaciu analýzu proteínu GLO1 v rôznych tkanivách. Naše zistenia naznačujú úlohu glyoxalázového systému v homeostáze v očnej sietnici, vysoko okysličovanom tkanive s rýchlym obratom bielkovín. Opisujeme tiež moduláciu glyoxalázového systému ako terapeutický cieľ na oddialenie vývoja chorôb súvisiacich s vekom a sumarizujeme literatúru, ktorá opisuje súčasné poznatky o nutričných zlúčeninách s vlastnosťami modulovať glyoxalázový systém.

Kľúčové slová:glykačný stres; glyoxalázový systém; starnutie; proteotoxicita

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod: Glykatívny stres a nezdravé starnutie

Rastúce množstvo literatúry naznačuje, že hromadenie poškodených proteínov je špecifickým znakom starnutia a mnohých chorôb súvisiacich s vekom, vrátane cukrovky 2. typu, rakoviny, neurodegeneratívnych, kardiovaskulárnych a očných porúch [1-7]. Aberantné proteíny narušujú bunkovú homeostázu vytváraním nefunkčných a toxických agregátov, čo vedie k inaktivácii nielen aberantného proteínu, ale môže tiež zhoršiť funkciu iných esenciálnych proteínov v dôsledku stresu alebo nedostatočnosti mechanizmu kontroly kvality proteínov. v cele. Jedným prominentným mechanizmom, ktorý vedie k aberantným molekulám, je modifikácia prostredníctvom pokročilých konečných produktov glykácie (AGE).

Vznikajú dikarbonylové zlúčeniny

z rôznych metabolických dráh (obrázok 1), ktoré zahŕňajú metabolizmus cukrov a sacharidov v strave za vzniku AGE. Tieto dikarbonylové zlúčeniny interagujú s biomolekulami, ako sú proteíny, lipidy a nukleové kyseliny v neenzymatickej post-translačnej modifikácii nazývanej glykácia. Hlavnými glykačnými dikarbonylovými činidlami sú metylglyoxal (MG), glyoxal alebo 3-deoxyglukozón [8]. Tieto dikarbonyly sú udržiavané na nízkych hladinách v homeostatických podmienkach, ale proces starnutia zvyšuje tieto glykačné činidlá na patologické úrovne, čím sa zvyšuje tvorba toxických AGE a v konečnom dôsledku ohrozuje kondícia tkaniva. Vzhľadom na to, že tvorba AGE je závislá od koncentrácie glukózy, vedie konzumácia vysokoglykemických diét alebo diabetických stavov k dramatickej systémovej akumulácii AGE. To priamo koreluje so zmeneným metabolizmom, zvýšeným zápalom a progresiou závažných zdravotných stavov. Naopak, príjem nízkoglykemických diét obmedzuje akumuláciu AGE a je spojený s pomalšou progresiou niektorých z týchto chorôb [9-13]. V tomto kontexte hyperglykémia kladie ďalší stres na produkciu glykovaných proteínov spojenú s vekom a zhoršuje škodlivé dôsledky depozitov AGE na funkciu orgánov.

Obrázok 1. Schematický diagram tvorby -dikarbonylov a detoxikačných dráh proti poškodeniu spôsobenému AGE pri starnutí. Tvorba vysoko reaktívnych -dikarbonylov, ako je metylglyoxal (MG), je prostredníctvom neenzymatickej degradácie glykolytických medziproduktov, vrátane dihydroxyacetón fosfátu a glyceraldehyd 3- fosfátu a iných zdrojov, vrátane metabolizmu aminokyselín a lipidov. Aby sa predišlo poškodeniu AGE, systém glyoxalázy je primárnym mechanizmom, ktorý obmedzuje syntézu AGE, pričom premieňa vysoko reaktívne biomolekuly, ako je MG, na menej reaktívne biomolekuly (D-laktát). Tento proces zahŕňa sekvenčnú aktivitu dvoch enzýmov GLO1 a GLO2 a redukovanej formy glutatiónu (GSH). Ďalšie detoxikačné mechanizmy zahŕňajú aktivitu DJ-1, aldehyddehydrogenáz (ALDH), aldo-ketoreduktáz (AKR) a enzýmov degradujúcich acetoacetát. Po vytvorení môžu byť AGE odstránené dvoma proteolytickými cestami: systémom ubikvitín-proteazóm (UPS) a autofágiou. Tieto ochranné mechanizmy (zvýraznené zelenou farbou) sa starnutím znižujú a prispievajú k nástupu chorôb súvisiacich s vekom, ako je neurodegenerácia, choroby súvisiace s očami (AMD, katarakta, DR), nefropatie, metabolický syndróm a rakovina. GLO1:glyoxaláza 1; GLO2:glyoxaláza 2; GSH: glutatión.

Cistanche môže proti starnutiu

Nadmerný glykačný stres podporuje nerozpustnosť proteínov, dereguláciu signalizácie a dráhy kontroly kvality proteínov. Zmeny odvodené od AGE v proteómových poruchových signálnych dráhach vo fyziológii tkanív (dráhy MAP/ERK, JAK-STAT a PI3K-AKT), ktoré vedú k jadrovej translokácii transkripčných faktorov zapojených do viacerých bunkových funkcií, vrátane zápalu, apoptózy, ER stresu , autofágia, oxidačný stres, mitochondriálna funkcia atď. (prehľad v [2,14]). Glykované proteíny môžu tiež nadmerne zaťažovať alebo obmedzovať funkčnosť proteolytických kapacít. Tieto zmeny v konečnom dôsledku prispievajú k nástupu viacerých porúch súvisiacich s vekom.

Viaceré štúdie ukázali, že tvorba MG a AGE odvodených od MG je dôležitým faktorom v patogenéze diabetu a jeho komplikácií, ako je retinopatia, nefropatia a neuropatia [15-19]. Dikarbonylový stres je tiež prispievajúcim mediátorom obezity a kardiovaskulárnych ochorení [20,21]. MG môže prispievať k ateroskleróze niekoľkými mechanizmami, vrátane akumulácie AGE odvodených od MG v aterosklerotických plakoch [22] a glykácie lipoproteínov s nízkou hustotou indukovanej MG [23]. Súvislosť medzi MG a hypertenziou bola tiež pozorovaná v niekoľkých štúdiách, ktoré poukazujú na zvýšené hladiny MG v tkanivách aorty a obličiek [24,25]. Niekoľko štúdií tiež potvrdilo, že akumulácia AGE koreluje s mnohými neurodegeneratívnymi poruchami, a teda ovplyvňuje funkciu mozgu, ako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a schizofrénia [26-28]. Jeden z najlepších príkladov vzťahu medzi akumuláciou AGE a následkami súvisiacimi so starnutím sa vyskytuje v očných tkanivách, čo vedie k poruchám očného tkaniva vyvolaným glykáciou, ako je katarakta, vekom podmienená degenerácia makuly (AMD) a diabetická retinopatia (DR)[{ {15}}]. Pokiaľ ide o kataraktu, hlavnú príčinu slepoty na celom svete, kryštály šošoviek sa vekom postupne sfarbujú do žltohneda v dôsledku akumulácie vedľajších produktov AGE [31]. Rovnako ako šošovka, AGE sietnice sa zvyšuje s vekom a cukrovkou, najmä vo vonkajšej sietnici. AMD je hlavnou príčinou slepoty u starších jedincov v rozvinutých krajinách. Vyššie hladiny AGE sa nachádzajú u pacientov s AMD v porovnaní s kontrolnými subjektmi, ako aj u modelov myší s AMD [32-36]. DR je charakterizovaná akumuláciou AGE v sietnici, čo spôsobuje mikrovaskulárne poškodenie [37].mikronizovaná purifikovaná flavonoidná frakcia 1000 mg používaTieto patologické zmeny vedú k ireverzibilnému poškodeniu hemato-retinálnej bariéry a makulárnemu edému, čo v konečnom dôsledku vedie k strate zraku. Stručne povedané, AGE sa hromadia v tele pri starnutí, najmä u diabetických pacientov. To ohrozuje homeostázu organizmu a prispieva k vzniku a progresii množstva chorôb súvisiacich s vekom.

Existuje viacero systémov na detoxikáciu AGE. Patrí medzi ne systém glyoxalázy, najlepšie charakterizovaný mechanizmus na inhibíciu tvorby AGE a jeden z ciest schopných detoxikovať medziprodukty glykácie. Avšak kapacity anti-AGEs s vekom klesajú, čo vedie k zrýchlenej akumulácii AGEs v „normálnych starších tkanivách“. Hoci existujú rôzne obranné mechanizmy na obmedzenie akumulácie AGE v tkanivách, ich vývoj na zabránenie akumulácie AGE a súvisiacich patológií sa stále nevyužíva [38]. V ďalšej časti zhrnieme súčasnú literatúru o detoxikačných mechanizmoch so zameraním na glyoxalázový systém na zníženie akumulácie týchto toxických vedľajších produktov v bunkách a tkanivách. Nakoniec diskutujeme o užitočnosti nutričných intervencií na posilnenie glyoxalázového systému ako stratégie proti starnutiu.

2. Detoxikačné mechanizmy proti glykačnému stresu: Hlavná úloha systému glyoxalázy

Boli hlásené viaceré detoxikačné mechanizmy proti akumulácii AGE. Obrázok 1 je schematický prehľad tvorby -dikarbonylu a rôznych detoxikačných ciest proti poškodeniu spôsobenému AGE pri starnutí. Hlavné cesty syntézy AGE zahŕňajú reakciu reaktívnych dikarbonylov odvodených hlavne z metabolizmu glukózy s primárnymi amínmi (N-terminálny alebo lyzínový bočný reťazec) alebo guanidínovou skupinou arginínového bočného reťazca [39]. Tvorba vysoko reaktívnych -dikarbonylov, ako je MG, prebieha prostredníctvom metabolizmu glykolytických medziproduktov, ako je dihydroxyacetónfosfát a glyceraldehyd 3-fosfát, a iných zdrojov, vrátane metabolizmu aminokyselín a lipidov.

AGE sú ireverzibilné a akonáhle sa vytvoria, môžu byť eliminované iba proteolytickými cestami [5,9,40,41]. Predpokladá sa, že k odstráneniu AGE prispievajú dve hlavné proteolytické kapacity: ubikvitín-proteazómový systém (UPS) a autofagický lyzozomálny proteolytický systém (ALPS) [5,9,40,41] (obrázok 1). UPS funguje hlavne na rozpustných nesprávne poskladaných proteínoch. V UPS sú substráty rozpoznané a označené ubikvitínom a nasmerované na proteazóm na degradáciu. ALPS pozostáva zo zamerania nákladu do lyzozomálneho kompartmentu na degradáciu. Autofagický náklad môže byť rôznorodý, vrátane nerozpustných proteínov, proteínových agregátov a dokonca celých organel. Obe proteolytické dráhy sú funkčne kooperatívne a rastúca literatúra podporuje presluchy medzi týmito dvoma dráhami s recipročnými priamymi a nepriamymi interakciami [42-46]. Tento presluch zaručuje záložný mechanizmus a v prípade nedostatku jednej z ciest má druhá proteolytická cesta tendenciu kompenzovať, aby sa zachoval správny a funkčný proteóm [47].

Zmeny v rýchlosti degradácie proteínov súvisiace s vekom boli zdokumentované pre mnohé tkanivá pred viac ako 3 desaťročiami, ešte predtým, ako bola definovaná molekulárna charakterizácia proteolytických dráh [48]. V súčasnosti je molekulárny a bunkový pokles dvoch hlavných proteolytických ciest s vekom lepšie pochopený a existujú rozdiely v stupňoch poklesu medzi UPS a lyzozomálnymi systémami. Mnohé správy ukázali pokles UPS závislý od tkaniva, zatiaľ čo autofagický pokles sa zdá byť univerzálny (prehľad v [49-51). Pokiaľ ide o autofágiu, lyzozomálne aj autofagozomálne kompartmenty prechádzajú výraznými modifikáciami. Zmeny, ktoré prispievajú k poruche autofágie, zahŕňajú zníženie lyzozomálnej stability, hydrolázovej aktivity, akumuláciu nestráviteľného materiálu (lipofuscínu) v lyzozomálnom lúmene, dysfunkčné lyzozomálne pH, zníženú transkripčnú hladinu proteínov súvisiacich s autofágiou, zníženú stabilitu chaperónom sprostredkovaného autofagický receptor LAMP2A v lyzozomálnej membráne a znížená asociácia motorických proteínov v autofagických kompartmentoch ([49,51,52]). Na rozdiel od autofágie sa teraz uznáva, že zmeny v proteolytických schopnostiach proteazómu s vekom sa zdajú byť viac kvalitatívne ako kvantitatívne.oteflavonoidZmeny v zložení katalytických aktivít proteazómového jadra a modulačných podjednotiek, znížená expresia proteazómu, ako aj zmeny v oxidačnom stave proteazómových podjednotiek a proteazómových substrátov prispievajú k inhibícii kapacity UPS súvisiacej s vekom (prehľad v [53 ,54). V niektorých prípadoch môže byť len nedostatočná kapacita proteolytických systémov zvládnuť zaťaženie. Nanešťastie, účinnosť týchto dvoch mechanizmov s vekom klesá, čo vedie k nedostatočnej schopnosti rozpoznať a odstrániť poškodené proteíny, a teda k intracelulárnej akumulácii proteínových agregátov a dysfunkčných organel [55,56]. Čisté hladiny AGE sú určené rovnováhou rýchlosti syntézy alebo tvorby a rýchlosti odstraňovania. Bezprostredným dôsledkom poklesu proteolytickej kapacity je akumulácia dlhovekých proteínov v starnúcich organizmoch, z ktorých mnohé akumulujú poškodenie spôsobené glykáciou vo svojich aminokyselinových sekvenciách. Ku akumulácii AGE dochádza spôsobom súvisiacim s vekom a závislým ([4,9]) a nedávna proteomická analýza vo výskume starnutia odhalila, že biológia AGE obsahuje obohatenú metabolickú dráhu spojenú s proteómami súvisiacimi s vekom [57].

Hoci UPS a ALPS s vekom klesajú, existujú rôzne ochranné cesty so schopnosťou znižovať syntézu AGE. V tomto prehľade sa zameriavame na tieto ochranné mechanizmy obmedzujúce biogenézu AGE, s osobitným dôrazom na systém glyoxalázy, primárny spôsob detoxikácie reaktívnych dikarbonylov [58]. V tejto časti podrobne popíšeme systém glyoxalázy. Stručne popisujeme aj ďalšie mechanizmy pri detoxikácii AGE: proteín DJ-1 spojený s Parkinsonom, aldehyddehydrogenázy (ALDH), aldo-ketoreduktázy (AKR) a degradácia acetoacetátu.

2.1. Glyoxalázový systém: Hlavná detoxikačná cesta pre reakčné dikarbonyly

Rozsiahla literatúra podporuje glyoxalázový systém ako hlavnú detoxikačnú cestu pre reaktívne dikarbonyly v cytosóle všetkých cicavčích buniek [58]. Glyoxalázový systém je najlepšie charakterizovanou cestou metabolizmu MG. Gény pre glyoxalázy sú evolučne konzervované a široko distribuované v rôznych živých systémoch, ako sú ľudia, rastliny, kvasinky, baktérie, huby a protisty. Prítomnosť v mnohých rôznych taxónoch poukazuje na vysoký význam enzýmov glyoxalázy vo fyziologickej funkcii biologického života. Kombinované aktivity glyoxaláz 1 a 2 (GLO1, GLO2) katalyzujú konverziu reaktívnych, acyklických -oxoaldehydov na zodpovedajúce -hydroxykyseliny [58]. Tieto reakcie tiež vyžadujú katalytický GSH. V počiatočnom kroku GLO1 premieňa svoj substrát, hemitioacetál, vytvorený spontánnou reakciou aldehydu dikarbonylu MG a GSH, na SD-laktoylglutrón. Potom GLO2 hydrolyzuje SD-laktoylglutatión na D-laktát a reformuje GSH (obrázok 1).puritans vitamín CAktivita GLO1 je priamo úmerná koncentrácii GSH. Aktivita GLO1 klesá, keď je GSH odstránený, ako napríklad pri oxidačnom strese, keď sa GSH premieňa na GSSG [59].

MG vzniká počas glykolýzy a glukoneogenézy degradáciou dihydroxyacetónfosfátu a glyceraldehyd 3-fosfátu, ako aj katabolizmom treonínu, oxidáciou ketónových teliesok a degradáciou glykovaných proteínov. Iné substráty, vrátane glyoxalu, fenylglyoxalu a hydroxypyrualdehydu, sú tiež metabolizované touto cestou [60]. GLO1, enzým obmedzujúci rýchlosť v systéme glyoxalázy, katalyzuje primárny detoxikačný krok [61], takže zmena proteínu GLO1 sa podieľa na mnohých patologických procesoch starnutia, ako je cukrovka, neurodegeneratívne ochorenia, rakovina a očné ochorenia. choroby [20.

Regulácia expresie a aktivity GLO1 je zložitá a stále nie je dobre pochopená (obrázok 2). Sekvencia promótora GLO1 obsahuje element reagujúci na kov (MRE), element odpovedajúci na inzulín (IRE), izoformu faktora skorého génu (E2F) a aktivačný zosilňovač-viažuci proteín 2 (AP{{10 }} ) a prvok antioxidačnej odozvy (ARE). Funkcia IRE a MRE bola potvrdená v reportérových testoch, kde liečba inzulínom a chloridom zinočnatým vyvolala zvýšenú transkripčnú odpoveď 62]. Podobné funkčné aktivity boli pozorované pre E2F a AP-2 [63,64]. ARE lokalizovaný v exóne 1 Glo1 slúži na pripojenie Glo1 k transkripčnému systému reagujúceho na stres reagujúci na stres erytroidným faktorom 2 (NRF2) s jadrovým faktorom 2- [65]. Niekoľko génov súvisiacich s metabolizmom MG a ochranou pred oxidačným stresom je pod kontrolou dráhy NRF2-ARE [66]. NRF2 je v komplexe s KEAP1, substrátovým adaptorovým proteínom pre komplex E2 ubikvitín ligázy závislý od cullín{29}}, ktorý riadi NRF2 na degradáciu proteazómom 26S za fyziologických podmienok. Oxidačný stres vedie k destabilizácii tohto komplexu, čo spôsobuje translokáciu NRF2 do jadra a spúšťa upreguláciu antioxidačných génov [67,68]. Väzba NRF2 na Glo1-ARE zvyšuje bazálnu a indukovateľnú expresiu GLO1.[65] NRF2 a antioxidačné reakcie sú tiež upregulované, keď MG spôsobuje dimerizáciu KEAP uvoľňujúceho Nrf2 [69].

Niekoľko štúdií ukazuje, že NRF2 zvyšuje aktivitu GLO1 a zmierňuje intracelulárny MG stres; modulácia GLO1 agonistami NRF2 teda viedla k zníženiu proteínových aduktov odvodených od MG a MG v bunkách aj tkanivách [70-73]. Okrem toho sa u myší s knockoutom NRF2 znížila mRNA a proteín Glol pečene, mozgu, srdca, obličiek a pľúc [65]. Celkovo tieto správy naznačujú, že GLO1 je následným cieľom, ktorým dráha NRF2 / KEAP1 vykonáva svoje ochranné funkcie znížením MG a dikarbonylového stresu. Zápalová aktivácia NF-kB (jadrový faktor kB) pomocou NRF2 však znižuje expresiu Glol [74]. Expresia žiary je tiež negatívne regulovaná HIFl (hypoxia-inducible factor l ) v hypoxických podmienkach, čo je dôležitý fyziologický faktor dikarbonylového stresu [75].

Spolu s transkripčnou reguláciou existuje aj posttranslačná regulácia proteínu GLO1 (obrázok 2). GLO1 je acetylovaný cytosolickým sirtuínom-2[76,77] a jeho expresia môže byť znížená aktiváciou RAGE (receptor pre koncové produkty pokročilej glykácie); tieto mechanizmy však nie sú jasne pochopené [78].sistancheNedávna štúdia ukázala, že proteín GLO1 môže byť modifikovaný fosforyláciou treonínu 107 (T107) a nitrozyláciou cysteínu 139 [79]. V tejto štúdii bola fosforylácia T107 kalmodulín-dependentnou kinázou II delta v proteíne GLO1 hlásená ako presný mechanizmus regulujúci systém glyoxalázy. Konkrétne fosforylácia GLO1 na T107 ovplyvňuje kinetickú účinnosť detoxikácie MG a rýchlosť proteazomálnej degradácie. Jeho zmenený stav je teda spojený s rozvojom chorôb súvisiacich s vekom [79].

Obrázok 2. Mechanizmy regulácie glyoxalázy 1 (GLO1). Aktivita GLO1 môže byť regulovaná viacerými mechanizmami, vrátane transkripčnej regulácie a posttranslačných modifikácií. Promótor Glo1 obsahuje rôzne regulačné prvky, ako sú prvky antioxidačnej odozvy (ARE), kovovej odozvy (MRE) a inzulínovej odozvy (IRE) a väzbové miesta pre AP-2 a E2F. Za normálnych podmienok nukleárny faktor erytroidný 2-faktor 2 (NRF2) je v komplexe s KEAP1, substrátovým adaptorovým proteínom pre komplex E2 ubikvitín ligázy závislý od cullín{14}}, ktorý riadi NRF2 na degradáciu systémom ubikvitín-proteazóm (UPS). Oxidačný stres vedie k destabilizácii komplexu NRF2-KEAP1, čo spôsobuje oddelenie NRF2, ktorý je translokovaný do jadra, čo spúšťa upreguláciu rôznych antioxidačných génov. Väzba NRF2 na Glo{22}}ARE zvyšuje expresiu GLO1. V podmienkach hypoxie je expresia Glow nepriamo regulovaná hypoxiou indukovateľným faktorom 1 (HIFlx). Rôzne posttranslačné modifikácie v cytosóle môžu ovplyvniť stabilitu GLO1.

2.2. Alternatívne detoxikačné mechanizmy ako predpokladané záložné systémy na kompenzáciu nedostatku aktivity glyoxalázy

Zatiaľ čo primárny mechanizmus na detoxikáciu reaktívnych dikarbonylov v systéme glyoxalázy, existujú alternatívne cesty so schopnosťou detoxikovať dikarbonyly vytvorené počas metabolizmu cukrov. Patria sem ALDH, AKR, DJ proteín spojený s Parkinsonovou chorobou-1 a vychytávanie acetoacetátom za vzniku 3-hydroxyhexánu-2,5-diónu (3-HHD )[80]. Fyziologický význam týchto systémov zostáva nejasný a bola otázka, či sú tieto enzýmy kľúčové pre detoxikáciu AGE v tkanivách kvôli vysokej aktivite glyoxalázového systému. Zdá sa, že sú súčasťou záložných systémov, ktoré fungujú v neprítomnosti glyoxalázovej aktivity, aj keď nemožno vylúčiť úlohu týchto ciest závislú od tkaniva.

DJ-1, tiež známy ako proteín 7 Parkinsonovej choroby (PARK7), zohráva kľúčovú úlohu pri Parkinsonovej chorobe (PD). Ukázalo sa, že nedostatok funkčného DJ-1 proteínu spôsobuje autozomálne recesívnu PD [81,82]. DJ-1 má dve rôzne aktivity: (1) aktivitu glyoxalázy in vitro, ktorá premieňa MG na laktát a zabraňuje poškodeniu tkaniva vyvolanému MG u Caenorhabditis elegans [83], a (2) aktivitu deglykázy in vitro, ktorá znižuje vedľajšie produkty MG v počiatočnom štádiu [84]. Nedávno aj iné štúdie ukázali, že DJ-1 hrá relevantnú úlohu v DNA deglykáze [85-87].čo je cistancheDetoxikačná kapacita DJ-1 v neprítomnosti glutatiónu (GSH) z neho robí alternatívnu cestu ku glyoxalázovému systému, ktorý vyžaduje prítomnosť GSH. Avšak Pfaff et al. pomocou DJ-1 knockdownov v bunkách Drosophila a DJ-1 knockoutu v celom organizme nepozorovali žiadne rozdiely v akumulácii MG proteínových aduktov [88].

AKR sú nadrodinou proteínov schopných redukovať aldehydy a ketóny na primárne a sekundárne alkoholy. AKR metabolizujú MG na hydroxyacetón alebo laktaldehyd. Niektoré štúdie ukázali, že transgénna expresia ľudských a myších Aldo-keto reduktáz vo fibroblastoch hlodavcov chráni pred poškodením vyvolaným MG, čo naznačuje, že AKR sa môžu podieľať na detoxikácii MG a znížení hladín AGE [89-91]. Vysoká aktivita AKR1B3 bola detegovaná v Glo1 knockout myších Schwannových bunkách, ako aj zvýšená expresia počas expozície MG, čo naznačuje, že by mohlo ísť o kompenzačný mechanizmus vyvolaný nedostatkom glyoxalázového systému alebo nadmerným glykačným stresom [92]. Je zaujímavé, že nedostatok AKR1B3 viedol k vyšším hladinám MG a AGE v srdciach diabetických myší [91].

LED diódy sú ďalšou skupinou enzýmov metabolizujúcich -dikarbonyl, ktoré oxidujú MG na pyruvát. Expresia ALDH bola zvýšená v myších Schwannových bunkách divokého typu po liečbe MG [92]. V modeli zebrafish, glo1 knockout ryby ukázali, že indukovaná aktivita ALDH kompenzuje nedostatok GLO1 [93]. Avšak aspoň u myší sú kompenzačné mechanizmy závislé od tkaniva, pretože zvýšená expresia AKR a ALDH bola pozorovaná v pečeňovom tkanive, ale iba AKR boli hlásené v obličkách u myší s knockoutom Glo1 [94]. V štúdiách u ľudí bola aktivita 3-DG metabolitu produkovaného aktivitou aldehyddehydrogenázy 1A1 (ALDH1A1) zvýšená v plazme a erytrocytoch diabetických pacientov [92]. Nedávno sa tiež ukázalo, že acetoacetát ketolátok znižoval koncentráciu MG neenzymatickou reakciou počas diabetickej a diétnej ketózy [95,96]. Zistili, že táto metabolická cesta zahŕňa neenzymatickú aldolovú reakciu medzi MG a ketónovým acetoacetátom, čo vedie k 3-hydroxyhexánu-2,5-diónu, ktorý je prítomný v krvi pacientov s hladom inzulínu. Alternatívne dráhy, ktoré by mohli kompenzovať deficit glyoxalázového systému, by mohli potenciálne vytvárať toxické molekuly, ako sú y-diketóny, ktoré sú spojené s degeneráciou periférnych axónov a poškodením semenníkov [97,98].

Hoci neexistuje žiadna systematická analýza starnutia proteínov zapojených do GLO1-nezávislých alternatívnych dráh, u týchto molekulárnych hráčov boli hlásené zmeny súvisiace s vekom. Napríklad existuje korelácia medzi D]-1 úrovňami expresie a oxidačným stresom a rôzne správy ukázali nárast DJ-1 s vekom. Hladiny DJ-1 mRNA a proteínov sa u myší zvýšili vo veku 8 až 20 týždňov [99] a hladiny DJ{8}} sa významne zvýšili ako funkcia veku v ľudskom mozgovomiechovom moku [100]. V očných tkanivách sa ukázalo, že DJ-1 je exprimovaný v pigmentovom epiteli sietnice a fotoreceptoroch a expresia sa zvýšila v starých očiach [101]. Môže odrážať kompenzačný mechanizmus v dôsledku poklesu aktivity glyoxalázového systému.

2.3. Aktivita glyoxalázového systému závislá od tkaniva

Hoci je GLO1 všadeprítomný proteín, hladiny tohto enzýmu sú regulované spôsobom závislým od tkaniva. Aby sme vyhodnotili úlohu glyoxalázového systému v rôznych tkanivách, skúmali sme expresiu a aktivitu GLO1 v neokulárnych (pečeň, mozog, srdce a obličky) a očných tkanivách (sietnica, RPE/cievnatka a šošovka). divokého typu C57BL/6] myší. Pomocou protilátok, ktoré špecificky rozpoznávajú GLO1, sa uskutočnil Western blotting a imunohistochémia na kvantifikáciu hladín proteínov. Aktivita GLO1 v cytosolických extraktoch bola stanovená spektrofotometricky ako počiatočná rýchlosť tvorby SD-laktoylglutatiónu, ako už bolo uvedené [30, 102]. Tieto výsledky sú zhrnuté na obrázku 3.

Obrázok 3. Porovnávacia analýza proteínu GLO1 a aktivity v očných a neočných tkanivách. (A) Aktivita GLO1 sa testovala v tkanivách iných ako očných a sietnicových tkanivách myší WT, ako už bolo opísané [29] a aktivita sa vyjadrila ako percento (percento) v porovnaní s pečeňou. (B) Reprezentatívna Western blot analýza pečene a (C) sietnice transgénnych myší s nadmernou expresiou WT a Glow (Glo1 Tg plus/plus) s použitím monoklonálnej protilátky (nekomerčná) a polyklonálnej protilátky pre Glol (komerčná, GeneTex)[36,103,104]. (D) Reprezentatívna Western blot analýza neokulárnych tkanivových extraktov (50 ug) WT myší s použitím monoklonálnej protilátky na Glo1 (nekomerčnú) a (E) proteínovú kvantifikáciu GLO1 normalizovanú na kontrolnú záťaž (Ponceau farbenie). (F) Aktivita GLO1 bola vykonaná v očných tkanivách (Retina, RPE/Choroida a šošovka) od WT myší, ako už bolo opísané [29] a aktivita bola vyjadrená ako milijednotky na miligram proteínu. Hodnoty sú priemer ± SEM. Veľkosť vzorky je n=4 z testov proteínu GLO1 a aktivity.

Predtým publikované údaje ukázali, že sietnica a pečeň vykazujú najvyššiu aktivitu GLO1 ([30]; obrázok 3A). Všimnite si, že aktivita sietnice bola najvyššou hodnotou, zatiaľ čo pečeň, obličky, mozog a srdce predstavovali iba 46 percent, 27 percent, 22 percent a 11 percent detoxikačnej kapacity sietnice. Hodnotili sme, či aktivita GLO1 koreluje s hladinou enzýmu hodnotením hladín proteínu GLO1 pomocou Western blottingu. Protilátka proti GLO1 bola predtým overená v predchádzajúcich správach a použitá na analýzu GLO1 vo vzorkách sietnice [36,103,104]. Ako pozitívna kontrola sa uskutočnila aj porovnávacia analýza v tkanivách sietnice a pečene z transgénnych myší nadmerne exprimujúcich GLO1 na pozadí C57BL/6J (B6) [105]. Na skúmanie hladín GLO1 sme použili dve rôzne protilátky: polyklonálnu králičiu protilátku (komerčná protilátka od GeneTex) a monoklonálnu myšaciu protilátku (nekomerčná protilátka) uvádzanú v rôznych zvieracích modeloch na štúdium biológie GLO1 [103,106]. Boli sme schopní detegovať proteín GLO1 v tkanivách pečene a sietnice divokého typu pomocou Western blottingu a v oboch tkanivách sme našli najvyššiu expresiu u transgénnych myší (obrázok 3B, C a doplnkový obrázok S1). Pre obe protilátky boli rozpoznané dva pásy. Diferenciálne elektroforetické profily týchto GLO1-pozitívov naznačujú, že posttranskripčné zmeny by mohli byť životne dôležité v úlohe proteínu. V súlade s tým nedávna štúdia naznačila, že fosforylovaný GLO1 je účinnejší a stabilnejší, čo podporuje tieto post-transkripčné zmeny ako presný mechanizmus regulujúci aktivitu GLO1 [79]. Existuje však málo informácií o tom, ako post-transkripčné modifikácie modulujú aktivitu glyoxalázy 1.

As expected, we found GLO1 protein in all non-ocular tissues analyzed, with the liver showing the highest expression. The relative order of GLO1 expression was liver>kidney>brain>srdce (obrázok 3D, E). To potvrdzuje výsledky predchádzajúcej štúdie[30]. O úlohe GLO1 v očných tkanivách sú obmedzené informácie. Ako sme už uviedli, enzymatický test odhalil, že aktivita GLO1 je ~ 10-krát vyššia v sietnici v porovnaní so šošovkou alebo RPE/cievnatkou (obrázok 3F, [30]). Nadmerná expresia glyoxalázy I zlepšuje prežitie pericytov ľudskej sietnice za hyperglykemických podmienok [107] a blokátor receptora angiotenzínu, ktorý obnovuje GLO1 u diabetických potkanov, znižuje retinálne acelulárne kapiláry [18]. Okrem toho nedostatok GLO1 v zebričkách ovplyvňuje architektúru ciev sietnice dospelých, hoci zvýšená tvorba angiogénnych výhonkov sa pozoruje iba u zobričiek prekŕmených glo{11}}, ale nie pri bežnom kŕmení [93].

Sietnica je vysoko komplexné, veľmi dynamické tkanivo s rôznymi typmi buniek (obrázok 4A). Prietok krvi a následné vystavenie sa xenobiotikám a iným stresorom patria medzi najvyššie v tele. Každé ráno sa uvoľní 10 percent vonkajších hrotov sietnicových fotoreceptorov a musia byť odstránené susednými pigmentovanými epiteliálnymi bunkami sietnice. Vykonali sme imunohistochemickú analýzu, aby sme po prvýkrát charakterizovali priestorové rozdiely GLO1 v sietnici. Proteín GLO1 bol prítomný vo všetkých typoch buniek v sietnici, s vysokými hladinami v telách buniek vnútornej jadrovej vrstvy a lavere gangliových buniek. Telá fotoreceptorových buniek vo vonkajšej jadrovej vrstve mali nižšie hladiny. Vo fotoreceptoroch sa väčšina proteínov GLO1 nachádzala vo vnútorných a vonkajších segmentoch. RPE mala tiež vysoké hladiny proteínu GLO1, zatiaľ čo cievnatka a skléra mali nižšie množstvo proteínu GLO1 (obrázok 4B, C).

Obrázok 4. Imunohistochémia GLO1 v tkanivách myšacej sietnice. (A) Prierez, bunková schéma sietnice znázorňujúca jej tri primárne vrstvy pozostávajúce z vrstvy gangliových buniek (GCL), obsahujúcej gangliové bunky sietnice (RGC), vnútornú jadrovú vrstvu (INL), ktorá hostí interneuróny amakrinnej, bipolárnej a horizontálnej bunky, ako aj Müllerove gliové bunky a vonkajšia jadrová vrstva (ONL), v ktorej sú uložené tyčinkové a kužeľové fotoreceptory. Senzorické tkanivo alebo neuroretina je spojené s retinálnym pigmentovým epitelom (RPE). Červené šípky označujú vrstvu RPE. (B) Reprezentatívny obraz imunofarbenia GLO1 vo vzorkách sietnice od myší WT. (C) Priemerná intenzita fluorescencie GLO1 normalizovaná na hodnotu v RPE. Uvedené údaje sú priemer ± štandardné chyby priemeru (SEM). Naše výsledky na sietnici sú relevantné, pretože sietnica je vysoko diferencované postmitotické tkanivo, kde poškodenie spôsobené glykáciou nemôže byť znížené delením buniek [5,9]. Okrem toho zmeny v GLO1 boli spojené s poškodením sietnice [108]. Podobný scenár sa môže vyskytnúť v iných tkanivách zložených z buniek s nízkou regeneračnou kapacitou, ako je centrálny nervový systém, kde je veľká väčšina neurónov postmitotická. Vyhodnotenie hladín GLO1 spolu s bunkovo ​​špecifickými markermi nám môže umožniť vyhodnotiť variácie medzi bunkami v danom tkanive. Naše výsledky naznačujú, že vysoká hladina retinálneho GLO1 proteínu a aktivity môžu hrať dôležitú ochrannú úlohu proti poškodeniu spôsobenému AGE vekom.

Tento článok je extrahovaný z Cells 2021, 10, 1852. https://doi.org/10.3390/cells10081852 https://www.mdpi.com/journal/cells