Hipokampus, prefrontálny kortex a perirhinálny kortex sú kritické pre pamäť náhodného poriadku

Pre viac informácií:ali.ma@wecistanche.com{101}

Abstraktné

Značný výskum na hlodavcoch a ľuďoch naznačuje, že hipokampus a prefrontálny kortex sú nevyhnutné na zapamätanie si časových vzťahov medzi stimulmi a hromadenie dôkazov naznačuje, že môže byť zapojený aj peririnálny kortex. Experimentálne parametre sa však v štúdiách podstatne líšia, čo obmedzuje našu schopnosť plne porozumieť základným prínosom týchto štruktúr. Predchádzajúce štúdie sa líšia v type časovejPamäťzdôrazňujú (napr. poradie, postupnosť alebo oddelenie v čase), stimuly a reakcie, ktoré používajú (napr. jedinečné alebo opakované sekvencie a náhodné alebo odmeňované správanie) a mieru, do akej kontrolujú potenciálne mätúce faktory ( napr. primárne a aktuálne účinky alebo poradiepamäťové deficitysekundárne k položkeporuchy pamäti).Aby sme pomohli integrovať tieto zistenia, vyvinuli sme nové testovanie paradigmynáhodná spomienkapre skúšobnú jedinečnú sériu udalostí a súčasne hodnotené poradie a pamäť položiek u zvierat s poškodením hipokampu, prefrontálneho kortexu alebo peririnálneho kortexu. Zistili sme, že tento nový prístup viedol k silnému poriadku apamäť položkya že hipokampálne, prefrontálne a peririnálne poškodenie selektívnenarušený pamäť objednávky. Tieto zistenia naznačujú, že hipokampus, prefrontálny kortex a perirhinálny kortex sú súčasťou širokej siete štruktúr nevyhnutných na náhodné učenie sa poradia udalostí vepizodická pamäť.

Leila M.Allen, RachelA.Lesyshyn, Steven J.O'Dell, Timothy A. Allen, Norbert J. Fortin

1Centrum pre neurobiológiu učenia a pamäte, University of California, Irvine, CA 92697 2Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, CA 92697 3Program kognitívnej neurovedy, Katedra psychológie, Florida International University , Miami, FL 33199

ÚVOD

Schopnosť časovo organizovať osobné zážitky v pamäti je definujúcim aspektom epizodickej pamäte. Bolo vyvinutých niekoľko prístupov na skúmanie pamäte „kedy“ udalosti nastanú u hlodavcov a ľudí (napr. Hannesson a kol., 2004a,b; Dere a kol. al., 2005; Babb a Crystal, 2006; Kart-Teke a kol., 2006; Barker a kol., 2007; Fouquet a kol., 2010; Allen a kol., 2014) a značné dôkazy naznačujú, že hippocampus (HC) zohráva ústrednú úlohu v tejto funkcii (Eichenbaum, 2013; Davachi & DuBrow, 2015). Napríklad u hlodavcov lézie HC zhoršujú pamäť časového poriadku, ale nie pamäť položiek (Chiba a kol. 1994; Fortin a kol. 2002; Kesner a kol. 2002; DeVito & Eichenbaum, 2011;Barker&Warburton, 201l; 2013). HC neuróny posilňujú a prehrávajú priestorové sekvencie v poradí, v akom sa spúšťali počas učenia, čo naznačuje pamäť pre sekvencie priestorových umiestnení (Skaggs & McNaughton, 1996; Farooq et al., 2019). Zistilo sa tiež, že HC neuróny sa spoľahlivo spúšťajú v konkrétnych momentoch. počas medzier medzi stimulmi ("časové bunky"; Pastalková a kol., 2008; MacDonald a kol., 2013) a na rozlíšenie medzi položkami prezentovanými v správnej alebo nesprávnej sekvenčnej polohe ("bunky sekvencie"; Allen a kol..2016) . Podobne štúdie MRI u ľudí ukázali, že HC sa významne aktivuje počas kódovania alebo získavania rôznych foriem časových informácií o vlastných skúsenostiach (Cabeza a kol., 1997; Hayes a kol., 2004; Kumaran & Maguire, 2006; Lehn , a kol., 2009; Ross a kol., 2009; Ekstrom a kol., 2011; Tubridy & Davachi, 2011; Hsieh a kol., 2014; Davachi& Dubrow, 2015; Reeders a kol., 2018).

Kliknite na predstavec Cistanche a pre pamäť Cistanche

Prefrontálny kortex (PFC) je ďalšou štruktúrou, o ktorej sa predpokladá, že hrá kľúčovú úlohu v časovej organizácii spomienok. U hlodavcov lézie a dočasné inaktivácie mediálneho PFC narúšajú rozlišovanie časového poriadku pre objekty a priestorové umiestnenie (Mitchell & Laiacona, 1998; Hannesson, a kol. 2004a, b; Barker, a kol., 2007; DeVito & Eichenbaum, 2011; Jayachandran a kol., 2019). Ďalej, mediálne PFC neuróny vykazujú trvalé vystreľovanie v medzere medzi stimulmi, čo môže pomôcť preklenúť asociácie stimulov v priebehu času (napr. Cowen & McNaughton, 2007; Gilmartin & McEchron, 2005). Existuje tiež dostatok dôkazov zo štúdií na ľuďoch, ktoré implikujú porovnateľné funkcie PFCin (pozri St. Jacques a kol., 2008; Jenkins & Ranganath, 2010; Preston & Eichenbaum; 2013; Hsieh & Ranganath, 2015; Reeders a kol., 2018).

Okrem HC a PFC môže dôležitú úlohu zohrávať aj peririnálna kôra (PER). Hoci sa PER najčastejšie spája s pamäťou položiek (Murray a kol., 2000, Bussey a kol., 2002; Murray a kol., 2007; Barker& Warburton, 2011; Feinberg a kol., 2012), hromadiace sa dôkazy naznačujú, že môže tiež prispieť k poriadku. Pamäť. Predpokladá sa napríklad, že PER uľahčuje zjednotené reprezentácie udalostí, ktoré sa vyskytujú v priebehu času, kombinovaním dočasne nesúvislých funkcií do jedného percepčného objektu v pamäti (Allen a kol., 2007; Kholodar-Smith a kol., 2008a; Kent & Brown, 2012). Neuróny PER vykazujú pretrvávajúce spaľovanie vyvolané synaptickou stimuláciou vo Vitre a môže trvať viac ako minútu po zastavení stimulácie, čo naznačuje, že neuróny PER sú schopné spájať udalosti cez časové medzery (Navaroli et al., 2012). Najnovšie sa ukázalo, že umlčanie synaptickej aktivity v mediálnych projekciách PFC-PER ruší pamäť pre dobre trénované sekvencie pachov (Jayachandran et al, 2019).

Je však dôležité poznamenať, že existujú značné rozdiely v paradigmách použitých vo vyššie uvedených experimentoch, čo sťažuje úplné pochopenie špecifických príspevkov HC, PFC a PER. Po prvé, paradigmy sa líšia v type časovej pamäte, ktorú zdôrazňujú, vrátane pamäte pre relatívne poradie udalostí (napr. B sa vyskytlo pred D) pre špecifickú sekvenciu, v ktorej sa vyskytli (napr. po A nasledovalo B, potom C, potom D) alebo pre časové oddelenie medzi položkami (napr. A sa vyskytlo pred ~ 5 minútami, pred B ~ 1 minútami; pozri Friedman, 1993; Allen & Fortin, 2013). Po druhé, niektoré paradigmy zahŕňajú náhodné

učenie, kľúčový aspekt epizodickej pamäte (Zhou et al., 2012), zatiaľ čo iní (predovšetkým u hlodavcov) odmeňujú prezentácie stimulov alebo úsudky. Po tretie, niektoré paradigmy zahŕňajú jedinečné série udalostí, ktoré sú kľúčovou črtou epizodickej pamäte, zatiaľ čo iné zahŕňajú opakované prezentácie tých istých udalostí. Nakoniec, niektoré paradigmy, tiež typicky u hlodavcov, zahŕňajú užšie zoznamy stimulov (2 alebo 3 položky), takže sondy objednávky musia zahŕňať prvú a/alebo poslednú vzorovú položku. V takýchto prípadoch úsudky o časovej pamäti nemôžu kontrolovať účinky primárnosti alebo aktuálnosti, čo môže viesť k rozdielom v sile pamäte medzi položkami, a skutočnosť, že by sa dali vyriešiť zapamätaním si iba jednej z položiek vzorky (napr. zviera si mohlo pamätať len poslednú položku a potom sa jej v teste sondy vyhnite).

Cieľom tejto štúdie je pomôcť integrovať predchádzajúce zistenia súčasným hodnotením príspevku HC, PFC a PER k pamäti objednávok aj položiek pomocou novej paradigmy u potkanov. Najprv sme na základe predchádzajúcich spontánnych preferenčných prístupov vyvinuli úlohu, ktorá testuje náhodné poradie a pamäť položiek na skúšobné jedinečné série udalostí. Úloha využíva najmä dlhú sériu udalostí (5 pachových prezentácií), čo zmierňuje vplyv efektov prvenstva a aktuálnosti, znižuje možnosť použitia pamäte len pre jednu položku v úsudkoch objednávky a ponúka aj lepšiu paralelu so štúdiami na ľuďoch. Po druhé, vykonali sme selektívne poškodenie HC, PFC alebo PER a priamo porovnali výkon každej skupiny v pamäti objednávok a položiek pre rovnakú sériu udalostí. Zistili sme, že náš nový prístup viedol k robustnej pamäti objednávok a položiek a že poškodenie HC, PFCor PER selektívne narušilo pamäť objednávok. Tieto zistenia naznačujú, že široká sieť štruktúr je rozhodujúca pre náhodné učenie sa poradia udalostí v epizodickej pamäti.

METÓDY

Predmety

Subjektmi boli samce potkanov Long Evans s hmotnosťou 250-300 g pri príchode (n= 52). Potkany boli jednotlivo umiestnené v priehľadných pravouhlých polykarbonátových klietkach a udržiavané v 12-hodinovom cykle svetlo-tma (svetlo vypnuté o 8:00 ráno). Všetky behaviorálne testy sa uskutočnili počas tmavej fázy (aktívnej periódy) pri okolitých podmienkach červeného osvetlenia. Prístup k jedlu a vode bol pred operáciou neobmedzený. Po operácii boli potkany mierne obmedzené na jedlo, aby si udržali 85 percent svojej voľnej telesnej hmotnosti s voľným prístupom k vode počas testovania. Všetky chirurgické a behaviorálne metódy boli v súlade s Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a používanie zvierat Kalifornskej univerzity v Irvine.

Ordinácie

Excitotoxické lézie boli vytvorené pomocou lokálnych infúzií NMDA (Sigma, St. Louis, MO). Celková anestézia bola vyvolaná (5 percent) a udržiavaná izofluránom (1-2,5 percent) zmiešaným s kyslíkom (800 ml/min). Potkany sa potom umiestnili do stereotaxického zariadenia (Stoelting Instruments, Wood Dale, IL) a pokožka hlavy sa anestetizovala Marcainom⑧ (7,5 mg/ml, {{10}},5 ml, sc). Lebka bola exponovaná po reze v strednej čiare a boli vykonané úpravy, aby sa zabezpečilo, že bregma, lambda a miesta ± 0,2 mm laterálne od strednej čiary sú vyrovnané. Počas chirurgického zákroku bol všetkým potkanom podaný glykopyrolát (0,2 mg/ml, 0,5 mg/kg, sc) na prevenciu dýchacích ťažkostí a 5 ml Ringerovho roztoku s 5 percentami dextrózy (sc) na hydratáciu. Po odstránení kosti prekrývajúcej miesta infúzie( pozri nižšie), NMDA bol infúzne podaný do mozgu pomocou 33-striekačky s priemerom 10μ（Hamilton Company, Reno, NV）poháňanej motorizovanou infúznou pumpou (World Precision Instruments, Sarasota. FL) namontovanou na rameno stereotaxického manipulátora. Ihla zostala v mieste vpichu 5 minút po infúzii lieku, aby sa umožnila difúzia. Dorzoventrálne (DV) súradnice boli merané z dura mater. Subjekty boli náhodne zaradené do jednej z piatich skupín: HClézia, PFC lézia PER lézie, sekundárne kontrolné lézie zrakovej kôry (V2) alebo falošne operované kontroly.

HC lézie （n{0}）.一Úsek kosti prekrývajúci sedem miest HC infúzie bol resekovaný bilaterálne a zostal hydratovaný v sterilnom fyziologickom roztoku počas infúzií. Po infúziách sa časť kosti vrátila. Tri bilaterálne dorzálne miesta HC boli zacielené takto:-2.2 A/P,±1.0M/L,-3.0DV;{{7} }.0A/P,±1,8/L,-2,8 D/V;-4,0A/P,±2,8 M/L, -2,6 D/V. Štyri bilaterálne ventrálne miesta HC boli zacielené takto:{19}}.8 A/P,±4,8 ML, 6,5 D/V;-4,8 A/P,±4,5 M/L,{{29 }}.3D/V;-5.7 A/P,±4.9 M/L,-2.8,D/V;-5.7A/,±5.1 ML, { {41}}.8 D/V. Každé HC miesto bolo infúzne podané 200-225 nLof NMDA (85 mM; 50 mg/ml) pri 200-250 nL/min.

PFC lézie (n {{0}}). – Dorzálne k miestam infúzie boli vyvŕtané malé otvory zamerané na prelimbickú kôru PFC. PFC bol podaný bilaterálnou infúziou 25{{10}} nL NMDA (85 mM; 50 mg/ml) pri 200 l/min (3,2 A/R, ± 0,75 M/L, -3,0 D/V z dura) podobne ako Sharpe and Killcross (2012). PER lézie（n=11）. 一 Dva otvory boli vyvŕtané obojstranne（~-4 a-7mm A/P,~1 mm mediálne od temporálneho hrebeňa) pre kotviace skrutky na uchytenie roztierača tkaniva (Kholodar-Smith et al.2008a) . Temporálne svaly boli potom odtiahnuté, aby sa odhalili temporálne a parietálne kosti, kým nebol viditeľný jarmový oblúk. Rozširovač tkaniva bol zaistený medzi kotviacimi skrutkami a vnútorným povrchom temporálnych svalov. Kosť prekrývajúca temporálny kortex (-2 mm x 5 mm) bola resekovaná a fragment bol umiestnený do sterilného fyziologického roztoku. Kostný fragment sa vrátil po infúziách. Injekčná striekačka (ihla bez jadra; Hamilton Company, Reno, NV) bola umiestnená pod uhlom 45 stupňov od vertikálneho povrchu temporálneho kortexu, s očkom ihly smerujúcim k ventrálnej a zadnej časti, aby nasmerovalo tok NMDA smerom k PER. Infúzie NMDA (85 mM; 50 mg/ml) sa uskutočňovali na 7-8 miestach (80 nL na infúziu; 70 nL/min; rovnomerne rozmiestnené po ~0,5 mm) pokrývajúce rostrokaudálny rozsah PER od-2,8 až-7.6 A/Prelativeto bregma (Burwell, 2001). Keď bola na zamýšľanom mieste infúzie prítomná veľká krvná cieva, bolo podaných sedem injekcií. Špička ihly bola vložená ~ 1,5 mm do kortexu vzhľadom na tvrdú plenu.

Kontroly sekundárnej zrakovej kôry (V2) (n=8).- Dorzálne k miestam infúzie V2 boli vyvŕtané malé otvory. Miesta V2 boli infúzne podané 250 nL NMDA (85 mM) rýchlosťou 200 l/min (-4) 0,5 A/P,±2,5 M/L;-0,8 D/V z dura). Kontroly s falošnou operáciou (n=10). – Títo jedinci podstúpili rovnaké chirurgické zákroky ako ich skupina s príslušnými léziami (počty: HC,4; PFC,4; PER,2), okrem toho, že sa neuskutočnila žiadna infúzia NMDA. Po léziách boli rezy zašité a prekryté lokálnym antibiotikom. Potkany boli vrátené do svojich domácich klietok a monitorované, kým sa nezobudili. Jeden deň po chirurgickom zákroku bolo potkanom podané analgetikum (Flunixin, 50 mg/ml, 2,5 mg/kg sc.) a na miesto rezu bolo aplikované lokálne antibiotikum. Potkany sa nechali zotaviť z chirurgického zákroku približne dva týždne pred testovaním správania.

Pachové podnety

Odoranty boli prezentované na 1" okrúhlych drevených guľôčkach (Woodworks Ltd. Haltom City, TX), z ktorých každá bola navoňaná domácim korením (pozri Feinberg a kol., 2012). Korálky boli voňavé 48 hodín v zmesi piesku na ihrisku a jednej korenie. Pre každého potkana sa pachy vyberali pseudonáhodne, aby sa vyvážili pachy nad sériovými polohami medzi subjektmi a aby sa predišlo opakovaným pachom. Pachy sa vybrali z nasledujúceho zoznamu: nové korenie, aníz, bazalka, bobkový list, kardamón, zeler, škorica, klinček, koriander , rasca, kôprová burina, fenikel, zázvor, citrónová kôra, muškátový oriešok, rozmarín, šalvia, majorán, mäta, pomarančová kôra, paprika, tymián a kurkuma. Piesok bol pridaný na zriedenie zápachu a slúži ako konzistentný zápach pozadia pre všetky perličky Zoznam pachov, ako aj koncentrácie pachov v piesku, boli určené empiricky pomocou nezávislej kohorty naivných potkanov, aby sa zabezpečila rovnaká úroveň vrodenej preferencie pre jednotlivé pachy (údaje nie sú uvedené). Potkany sa pred testovaním oboznámili s drevenými guľôčkami. podľa umiestnenie niekoľkých neparfumovaných guľôčok do ich domácich klietok aspoň na dva dni pred behaviorálnym testovaním (Spinetta et al., 2008; O'Dell a kol., 2011; Feinberg a kol., 2012). Znalosť drevených guľôčok zabezpečila, že počas testovania sa zvieratá zamerali na pach pridávaný do experimentálnych guľôčok.

Testovanie pamäte pachu a predmetov

S naivnými potkanmi sa krátko zaobchádzalo počas 3-5 dní po prvom príchode a počas behaviorálnych procedúr. Všetky behaviorálne relácie sa uskutočňovali v domácej klietke každého jednotlivého potkana. Behaviorálne testovanie začalo po chirurgickom zotavení a prebiehalo počas tmavej fázy (aktívnej periódy) pri okolitých podmienkach červeného osvetlenia. Potkany boli počas behaviorálneho testovania udržiavané na 85 percentách svojej voľnej hmotnosti pri kŕmení, pretože sme zistili, že pilotné potkany budú skúmať guľôčky dlhšie a dôslednejšie, keď budú mierne obmedzené na jedlo (pozri tiež Feinberg, et al. 2012). Hodinu pred behaviorálnym testovaním sa odstránili násypky na jedlo a fľaše s vodou, aby sa potkany aklimatizovali na testovacie podmienky. Séria piatich pachov bola prezentovaná ako sekvencia udalostí, pričom každá prezentácia pachu bola oddelená 20-minútovým intervalom (pozri obrázok IA). Každá guľôčka bola prezentovaná v strede najprednejšieho kvadrantu klietky a časy skúmania (definované ako šnupanie a šľahanie v rámci ~ 1 cm guľôčky) boli zaznamenané na prenosnom počítači pomocou softvéru ODLog. Dôležité je, že na zabezpečenie ekvivalentného vzorkovania všetkých pachov v sérii, množstvo času stráveného vzorkovaním prvého pachu (dostupné celkovo 30 s) určovalo, koľko času mal každý potkan na vzorkovanie každého nasledujúceho pachu (napr. strávili 4 s skúmaním zápachu A, zaistili by sme, aby sa každý z pachov B až E odoberal počas 4 s). Testovacie relácie, v ktorých potkan neskúmal žiadny pach vzorky na rovnakej úrovni ako prvý pach (v časovom okne 5 minút), neboli zahrnuté do analýzy. Aby sa zabránilo krížovej kontaminácii, každá guľôčka bola zlikvidovaná po akejkoľvek prezentácii počas odberu vzoriek alebo testovania a experimentátor si vymenil rukavice vždy, keď bola použitá nová guľôčka.

Pamäť na poradie, v ktorom boli vône prezentované, a pamäť na samotné pachy sa potom hodnotili pomocou sondy objednávky a sondy položky (pozri obrázok IA). Sonda objednávky bola podaná 60 minút po zozname vzoriek a zahŕňala prezentáciu dvoch pachov zo zoznamu (B vs. D). Naša pilotná práca naznačila, že potkany mohli vykonávať aj iné sondy nad náhodnými úrovňami (napr. A vs. C, C vs. D), ale tento výkon sa mohol líšiť (podobne ako zistenia vo Fortin et al., 2002). Preto sa tu zvolilo jediné párovanie zápachu, aby sa maximalizovala štatistická sila. V súlade s predchádzajúcou prácou (napr. Dere et al., 2005) sme očakávali, že zvieratá vyjadria pamäť na poradie, v ktorom sa udalosti vyskytli, prednostným skúmaním položky, ktorá sa objavila skôr v sérii. Pamäťová sonda položky bola podaná 20 minút po objednanej sonde (~ 80 minút po zozname vzoriek) a zahŕňala prezentáciu dvoch pachov: stredný pach zo zoznamu a nový pach (C vs. X). Sonda položky je dôležitou kontrolou, ktorá zabezpečuje, že si potkany pamätajú pachy uvedené na zozname, čo je vyjadrené ako preferenčné skúmanie nového/zápachu (v porovnaní s predtým zaznamenaným zápachom). Všimnite si, že pre sondy objednávky aj položky sa guľôčky umiestnili do rovnakého kvadrantu klietky ako guľôčka vzorky a umiestnili sa približne 3 cm od seba (pozri obrázok 1B), s ľavou/pravou polohou vyváženou naprieč potkanmi. Čas prieskumu pre každú guľôčku bol zaznamenaný v ODLog.

Rýchlo prezentovaná podmienka sekvencie

Rovnaké skupiny sme testovali aj v náročnejšej verzii paradigmy, v ktorej je postupnosť položiek prezentovaná rýchlejšie (~45 s medzi položkami). Všetky postupy vrátane retenčných intervalov pred objednávkou a pamäťovou sondou položky (60 a 80 minút, v tomto poradí), boli inak totožné.

Stav kontroly sily pamäte

Uskutočnili sme kontrolný experiment v samostatnej skupine naivných zvierat, aby sme zohľadnili možnosť, že výkon na objednanej sonde jednoducho závisí od rozdielov v sile pamäte vzorkovaných položiek. Tu dostali potkany sériu piatich pachov, pričom každá prezentácia pachu bola oddelená 20-minútovým intervalom zodpovedajúcim parametrom hlavnej úlohy. Následne bol každému potkanovi prezentovaný zápach zo sekvencie spolu s novým zápachom (napr. As.V, VBS.W, Cvs.X, Dvs.Y, E.vs.Z). Interval medzi pachom poslednej vzorky a test sondy trval 60 min. Každý potkan dostal päť relácií (vyváženým spôsobom), v ktorých sa uskutočnili všetky porovnania (jedno porovnanie na reláciu). Testovala sa iba jedna sekvenčná pozícia na reláciu, za deň, s aspoň jedným dňom voľna medzi testovacími reláciami. Každá relácia zahŕňala novú neprekrývajúcu sa sadu pachov.

Analýza dát

Hodnoty DI sa pohybujú od plus 100 do -100 percent . Kladné hodnoty zodpovedajú preferencii k skoršiemu zápachu v objednanej sonde a novému zápachu v sonde položky. Negatívne skóre zodpovedá preferencii voči neskoršiemu zápachu v objednanej sonde alebo skôr zaznamenanému zápachu v sonde položky. Skóre nula znamená, že nie je preferovaný ani jeden pach (šanca). na analýzu údajov sa použilo priemerné skóre každého potkana.

Štatistiky sa uskutočňovali pomocou Prism 8. Skupinové údaje sa analyzovali pomocou analýzy rozptylu (ANOVA) s posthoc testami kontrolujúcimi počet vykonaných porovnaní (pomocou Holm-Sidakových testov alebo Bonferroniho korekcie). Skupinové údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Štatistická významnosť bola stanovená pomocou p<>

Histológia

Potkanom bola podaná nadmerná dávka pentobarbitalu sodného (Euthasol, 390 mg/ml, 150 mg/kg, ip) a boli transkardiálne perfundované 100 ml PBS a následne 200 ml 4 % paraformaldehydu (pH 7,4; Sigma-Aldrich, St. Louis , MO), Mozgy boli dodatočne fixované cez noc v 4% paraformaldehyde a potom umiestnené do 30% roztoku sacharózy na kryoprotekciu. Zmrazené mozgy boli narezané na posuvnom mikrotóme (50 um; koronálna orientácia) na štyri sady bezprostredne susediacich rezov na farbenie krezylovou fialovou špecifickou pre bunkové telo a farbenie NeuN špecifické pre neurón. Presné metódy pre každé zafarbenie sú podrobne opísané inde (pozri doplnkové materiály od Kholodar-Smith et al., 2008a).

Analýza lézií

Pomocou softvéru Image J a Photoshopu (verzia CS6) sa odhadol rozsah neurotoxického poškodenia HC, PER, PFC a V2, ako aj laterálneho entorinálneho kortexu, infralimbického kortexu a prednej cingulárnej kôry na základe sériových rezov zafarbených NeuN .

VÝSLEDKY

Rozsah lézie

HC lézie. Subjekty s HC léziami mali veľké a úplné lézie na celej HC, zatiaľ čo okolité vlákna boli ušetrené (obrázok 3A). V celom rostrálno-kaudálnom rozsahu mozgov bol jasný nedostatok tkaniva HC. Dvojrozmerná analýza oblasti lézie sa uskutočnila pomocou rezov zafarbených NeuN. Celkovo bolo poškodených 85,5 ± 2,52 percent hipokampu. Nezistil sa žiadny rozdiel v poškodení ľavej hemisféry (85,72±2,77 percent) v porovnaní s pravou hemisférou (85,36±2,26 percent ;tio=0.17,p=0.87, párové vzorky t -test).

PFC lézie. Pacienti s PFC léziami mali veľké lézie prelimbickej kôry (PL) a v menšom rozsahu infralimbickej kôry (IL; obrázok 3B). PL, IL a ACC boli zahrnuté do kvantitatívnej dvojrozmernej analýzy plochy lézií. PL bola najviac poškodená (40,34 ± 3,25 percenta), nasledovala IL (18,23 ± 5,85 percenta) a veľmi malé poškodenie bolo na ACC (5,03 ± 1,60 percenta). Rozsah poškodenia PL je podobný tomu, čo sa predtým zistilo pri podobnej technike lézií (DeVito & Eichenbaum, 2011), avšak rozsah poškodenia extra-PL oblastí bol v tejto štúdii výrazne znížený. Preto, napriek menšiemu poškodeniu mimo oblasti, akékoľvek účinky týchto lézií pravdepodobne primárne odrážajú funkciu PL. Pomocou t-testu párových vzoriek sme nezistili žiadny významný rozdiel v poškodení PL ľavej hemisféry (37,96±3,55 percenta) v porovnaní s pravou hemisférou (42,72±3.86 percent ;t{{26} }.40,p=0.09).

PER lézie. - U jedincov s PER léziami bolo poškodenie sústredené v kortikálnom tkanive obklopujúcom stredný zadný rinálny sulcus (obrázok 3C) s 58,32 ± 4,27 percentami plného rozsahu PER lézií (A/P-2). 0 až -7.2). Väčšina poškodení sa vyskytla v zadnom PER(A/P-4.{12}} až-7.2), kde bolo celkové priemerné poškodenie 80,23±4,54 percent . Pomocou t-testu párových vzoriek sme zistili, že neexistuje žiadny rozdiel v poškodení zadnej PER v ľavej hemisfére (76,34 ± 5,30 percenta) v porovnaní s pravou hemisférou (84,13 ± 5,08 percenta ;t10=-1,62 ,p=0.14). Vyskytlo sa tiež menšie poškodenie časti laterálneho entorinálneho kortexu (LEC), ktorá sa nachádza bezprostredne ventrálne k oblasti 35 PER (36,71 ± 4,21 percent). Rozsah poškodenia je podobný tomu, čo bolo predtým zistené pri použití tejto techniky lézie (Kholodar-Smith et al., 2008a; Feinberg et al. 2012).

Potkany s léziami V2. Potkany s léziami V2 slúžili ako negatívna kontrola, aby sa preukázalo, že poškodenie kortexu prekrývajúce HC v oblasti, ktorá predtým nebola spojená so sekvenčnou pamäťou, neovplyvňuje výkon našej úlohy. Poškodenie bolo do značnej miery obmedzené na V2 s celkovým poškodením 40,38 ± 3,27 percenta u potkanov. U štyroch potkanov došlo k malému poškodeniu CAl jednostranne a u dvoch potkanov k malému poškodeniu CAL bilaterálne. Nezdá sa však, že by toto poškodenie ovplyvnilo ich výkon pri skúške objednávok alebo položiek.

Falošné lézie – HC, PFC a PER simulované (n{0}}, 4 a 2, v tomto poradí) potkany nevykazovali žiadne viditeľné známky poškodenia mozgu, ako bolo hodnotené pomocou histologických škvŕn NeuN. Falošné pokusy boli teda interpretované tak, že mali plné a normálne nervové schopnosti počas všetkých behaviorálnych experimentov a boli kombinované pre následné analýzy.

Pamäť objednávky a položky

Ako sa očakávalo, úrovne výkonnosti boli rovnako vysoké u simulovane operovaných zvierat a V2. zvierat s léziami, preto sme ich spojili, aby sme vytvorili kontrolnú skupinu.

Výkon na pamäťových sondách objednávok.

Jednosmerná ANOVA sa použila na preskúmanie rozdielov v diskriminačnom indexe (DI) na objednanej sonde medzi skupinami lézií. Bol zaznamenaný významný hlavný účinok skupiny (Fy,48=5.084, p=0.0039) a posthoc porovnania ukázali, že kontrolná skupina sa výrazne líšila od skupín HC, PFC a PER (Holm -Sidak testuje p<0.05).one-sample-tests showed="" that="" the="" control="" group="" was="" significantly="" different="" from="" chance(di="0;" t17=""><0.0001),but the="" lesioned="" groups="" were="" not(hc:tu0="0.8667,p=0.4064;PFC:to" =1.941,p="0.0783;PER:t10=1.310,p=0.2196)." to="" limit="" the="" number="" of="" posthoc="" tests,="" pairwise="" comparisons="" among="" hc,="" pfc,="" and="" per="" groups="" were="" not="" directly="" tested;="" instead,="" group="" differences="" were="" examined="" using="" a="" group="" x="" probe="" interaction="" (see="" below).="" see="" figure="" 2a="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" these="">

Výkon na pamäťových sondách položiek.

A one-way ANOVA on item memory performance did not show a significant difference across groups(Group effect: F3.48= 1.167,p=0.3320), and no group was significantly different from the control group (Holm-Sidak tests p's>0.05). Použitím jednovzorkového t-testu proti náhode (DI=0) všetky skupiny preukázali významnú preferenciu pre nový zápach (zápach X) v porovnaní so zápachom prezentovaným v sekvencii (zápachy; všetky p<0.001). see="" figure="" 2b="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" these="">

Priame porovnanie objednávok a položiek.

Na porovnanie výkonnosti skupiny medzi typmi sond sa použila dvojcestná ANOVA s opakovanými meraniami. Zistili sme významné hlavné účinky skupín (F,48=5.80,p=0.002) a Probe (F1.48=32.55,p<0.001).however, the="" group="" x="" probe="" interaction="" did="" not="" reach="" significance="" (f3,48="1.96," p="0.133)indicating" that="" the="" pattern="" of="" results="" did="" not="" significantly="" differ="" across="" lesion="" groups,="" post-hoc="" comparisons="" revealed="" that="" di="" scores="" were="" significantly="" lower="" on="" the="" order="" probes="" relative="" to="" the="" item="" probes="" for="" the="" hc,="" pfc="" and="" per="" groups="" (bonferroni-corrected="" one-sample="" t-tests;=""><0.017), whereas="" the="" control="" group="" showed="" no="" significant="" difference.="" these="" findings="" strongly="" suggest="" that="" the="" deficit="" observed="" is="" selective="" to="" order="" memory="" and="" cannot="" be="" attributed="" to="" a="" secondary="" impairment="" in="" item="" memory.="" these="" data="" are="" displayed="" in="" the="" form="" of="" difference="" scores="" (dlorder-ditem)="" in="" figure="">

Kontrolné podmienky a analýzy

Rýchla prezentácia zoznamu vzoriek.

Aby sme oddelili výkon medzi skupinami, testovali sme rovnaké zvieratá na náročnejšej verzii úlohy, v ktorej bol zoznam vzoriek prezentovaný rýchlejšie (~45 s medzi položkami). Zistili sme, že všetky skupiny vykazovali silnú pamäť položiek (nevýznamný skupinový efekt: F3,41=1.48,p=0.24; všetky skupiny vykazujú jednovzorkové t-testy vyššie 0 ,p<0.05).however, none="" of="" the="" groups,="" including="" the="" control="" group,="" showed="" clear="" order="" memory="" under="" this="" condition(non-significant="" group="" effect:="" f,41="1.09,p=0.365;" mean="" di="" for="" all=""><0.2), which="" makes="" it="" difficult="" to="" further="" interpret="" these="">

Sila pamäte.

We ran a control experiment in a separate cohort of naive animals to determine whether the memory strength of the different sample odors was significantly different at the time of the ordered probe. We found no significant differences in item memory across odor positions (F4.20=0.88,p=0.49), suggesting that all positions are remembered equally well (i.e., they have the same memory strength). Furthermore, all odor positions were significantly greater than chance exploration times for the novel odor(DI>0). Je teda vysoko nepravdepodobné, že by sila pamäte mohla zodpovedať za úsudky o pamäti poriadku v našej paradigme.

Odber vzoriek zápachu.

Prvá perlička pachu vo vzorkovej fáze bola potkanovi k dispozícii celkovo 30 s. Celkovo to potkany aktívne skúmali po dobu 4,14 ± 1,49 s (priemer ± 1 std; spriemerované počas 3 relácií pre každý subjekt). Tento čas odberu vzoriek sa porovnával medzi reláciami a skupinami s léziami pomocou ANOVA s opakovanými meraniami. Zistili sme, že potkany skrátili čas odberu vzoriek počas troch relácií (priemery 4,82 s, 4,67 s a 4,13 s; významný hlavný vplyv času odberu vzoriek; F,.{14}}.06, s<0.001), but="" that="" this="" effect="" did="" not="" differ="" across="" groups(non-significant="" session="" lesion="" interaction;f9,138="1.18,p=0.31).There" was="" a="" significant="" main="" effect="" of="" group="" (f146="3.339," p="0.027)," though="" the="" means="" were="" very="" close(3.85s,4.39s,="" 5.00s,="" and="" 3.88s="" for="" controls,="" hc,="" pfc,="" and="" per,="" respectively).="" a="" post-hoc="" holm-sidak="" test="" revealed="" slightly="" longer="" sample="" times="" in="" pfc="" animals="" relative="" to="" controls=""><0.037), but="" no="" other="" group="" differences="" were="" observed(p's="">0.05). Je nepravdepodobné, že by tento rozdiel v malej skupine skreslil naše výsledky; aj keď to mohlo viesť k mierne vyššiemu výkonu pamäte rádu a položiek v skupine PFC. Dôležité je, že tento účinok je v podstate ovplyvnený rozdielovými skóre znázornenými na obrázku 2C. Kľúčovou kontrolou je, že pre každé zviera sme prirovnali čas vyšetrovania v rámci prezentácie sekvencie.

Diskusia

Pomocou novej paradigmy náhodnej pamäte sme hodnotili účinky selektívneho poškodenia HC, PFC alebo PER na pamäť objednávok a položiek. Zistili sme, že každá z troch poškodených skupín bola významne narušená v porovnaní s kontrolami a že deficity boli porovnateľnej veľkosti. Dôležité je, že sme tiež zistili, že všetky skupiny s léziami vykazovali normálnu pamäť položiek, čo naznačuje, že ich schopnosť zapamätať si prezentované položky zostala nedotknutá (tj ich deficit bol špecifický pre neschopnosť zapamätať si ich poradie). Aj keď sa predtým ukázalo, že tieto štruktúry sú dôležité pre rôzne formy časovej pamäte, medzi štúdiami existovali značné rozdiely v požiadavkách na úlohy, a preto bolo potrebné posúdiť ich príspevky v rámci toho istého experimentu. Táto štúdia pomáha integrovať tieto predchádzajúce zistenia tým, že demonštruje, že HC, PFC a PEReach hrajú kľúčovú úlohu pri zapamätaní si jedinečných sekvencií udalostí, ktoré sú základnou črtou epizodickej pamäte.

Integrácia kľúčových vlastností epizodickej pamäte do jedinej paradigmy

Epizodická pamäť zahŕňa zapamätanie si série skúseností nášho každodenného života, ktoré sú náhodne zakódované a získané podľa potreby (Tulving, 1972; Allen & Fortin, 2013). Preto je pri modelovaní epizodickej pamäte u zvierat dôležité zachytiť náhodný charakter epizodického kódovania (napr. Dere a kol., 2005; Zhou a kol., 2012). Aby sme to dosiahli, vyvinuli sme náhodnú verziu paradigmy predtým používané na hodnotenie objednávky a pamäte položiek, v ktorých boli zvieratá explicitne odmenené počas odberu vzoriek položiek a testov sondy (Fortin et al, 2002).

Táto paradigma presahuje predchádzajúce snahy tým, že do jednotného prístupu integruje kľúčové črty iných modelov epizodickej pamäte (napr. Chiba a kol., 1994; Mitchell & Laiacona, 1998; Fortin a kol., 2002; Kesner a kol. al, 2002; Hannesson a kol., 2004a, b; Babb a Crystal, 2006; DeVito & Eichenbaum, 2011; Barker & Warburton, 2011; Warburton a kol., 2013). Po prvé, aby sme sa zamerali na náhodné kódovanie a vyhľadávanie, prezentácie pachov neboli odmenené počas testovania zoznamu vzoriek alebo sondy. Namiesto toho sme využili tendenciu hlodavcov prednostne skúmať nové podnety na hodnotenie pamäte, čo je prístup, ktorý vyvinuli a potvrdili iní (pozri Ennaceur, 2010). Konkrétnejšie, keď sme dostali dva podnety, zistili sme, že kontrolné zvieratá prednostne skúmali skoršiu z dvoch položiek na objednanej sonde a nový zápach na sonde položky, ktorý sme použili ako indikátor poriadku a pamäte položky. Veríme, že uprednostňovanie skoršieho zápachu je etologicky relevantnou stratégiou súvisiacou s optimálnym správaním sa pri hľadaní potravy (napr. potkan s väčšou pravdepodobnosťou nájde potravu alebo vodu doplnenú skôr ako neskôr, pretože ubehlo viac času; pozri Allen & Fortin ,2013). Toto správanie by mohlo byť podporené priradením konkrétnych položiek k ich sekvenčnej pozícii alebo reprezentácii časového kontextu alebo prostredníctvom sekvenčne spárovaných spolupracovníkov (napr. Allen et al. 2014. Jayachandran et al, 2019; Long & Kahana, 2019). Po druhé, aby sa zameralo kódovanie na čuchový stimul, pachy boli prezentované na drevených guľôčkach, ktoré sú inak identické vo všetkých ostatných senzorických atribútoch, a každá guľôčka bola použitá iba raz, aby sa zabránilo kontaminácii zvieraťom alebo podstielkou (pozri Feinberg, et al., 2012 ; O'Dell, et al., 2012; Spinetta, et al., 2008). Okrem toho boli všetky guľôčky prezentované na rovnakom mieste a konfigurácie vľavo a vpravo na testoch sondy boli vyvážené medzi zvieratami a reláciami, aby sa priestorové umiestnenie irelevantné pre výkon. Po tretie, aby sme kontrolovali možnosť, že pamäť objednávok by mohla byť jednoducho spôsobená rozdielmi v sile pamäte medzi týmito dvoma položkami, zabezpečili sme, že čas vyšetrovania bol ekvivalentný pre všetky pachy (pre každý zoznam a zviera). Nakoniec sme použili dlhší zoznam vzoriek ako iné paradigmy (v tomto prípade 5 prezentácií zápachu). Použitie piatich položiek v zozname vzoriek nám umožnilo zamerať naše objednávky a sondy položiek na prostredné tri položky, o ktorých sa v našom kontrolnom experimente ukázalo, že majú porovnateľnú pamäťovú silu (Dl ~ 0,6), a vyhnúť sa sondám objednávok zahŕňajúcich prvá alebo posledná vzorka položiek (ktoré môžu byť zmätené efektmi nadradenosti alebo aktuálnosti).

Jedným neočakávaným behaviorálnym zistením bolo, že rýchla verzia úlohy (~ 45 s medzi položkami počas odberu vzoriek) nedokázala preukázať spoľahlivú pamäť objednávok v kontrolách. Zatiaľ čo naša pilotná práca ukázala, že táto rýchla verzia by mohla viesť k zistiteľnej pamäti objednávok, kontrolná skupina v tejto štúdii sa významne nelíšila od náhody. Hlbší pohľad na výkonnosť jednotlivých kontrolných zvierat naznačuje, že podskupina sa správala ako naše pilotné zvieratá, zatiaľ čo zvyšok nepreukázal účinok, čo viedlo k zvýšenej variabilite. Budúce využitie tejto úlohy môže mať prospech zo systematického menenia dĺžok intervalov, ktoré pomôžu objasniť vzťah medzi oneskorením položiek a spoľahlivosťou/silou výslednej pamäte objednávok.

Príspevky HC, PFC a PER do pamäte pre poradie udalostí

V objednanej sonde sme zistili, že kontroly, skupina kombinujúca simulácie HC, PFC a PER, ako aj lézie V2 (negatívna kontrola), preukázali významnú preferenciu pre zápach, ktorý sa vyskytol skôr v sekvencii (zápach B), čo naznačuje že majú neporušenú pamäť na poradie udalostí. Avšak všetky potkany, ktorým bola podaná lézia buď HC, PFC alebo PER, vykazovali nedostatok preferencie pre zápach B alebo D, a preto žiadny dôkaz o pamäti objednávky. Na sonde položiek všetky skupiny preukázali významnú preferenciu pre nový zápach (zápach X), čo naznačuje, že mali porovnateľnú pamäť pre položky uvedené na zozname, a teda že deficit pamäte objednávok nebol len dôsledkom zlyhania. zapamätať si prezentované pachy. Toto zistenie ušetrenej pamäte položky po poškodení HC, PFC alebo PER je v súlade s predchádzajúcimi správami. Napríklad sa predtým ukázalo, že HC alebo PFC nie sú potrebné na diskrimináciu novosti (Feinberg a kol., 2012; Barker a kol., 2007; Fortin a kol., 2002; Mitchell & Laicona, 1998). Okrem toho v súvisiacej úlohe lézie PER neviedli k deficitom pamäte na rozpoznávanie pachov pre typ tu použitých odorantov (zápachy z domácností) v žiadnom z testovaných intervalov zadržania (5 minút až 48 hodín), hoci rozpoznávanie sociálnych/pachov bola narušená pri dlhých retenčných intervaloch (Feinberg, et al.2012).

Naše zistenia sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiami lézií u hlodavcov, ktoré implikovali HC v pamäti poriadku pomocou rôznych paradigiem (Kesner & Novak, 1982; Chiba a kol. 1994; Mitchell a Laiacona, 1998; Fortin, a kol., 2002; Kesner , a kol. 2002; DeVito & Eichenbaum, 201l; Barker & Warburton, 2011; 2013) as neuropsychologickými a neurozobrazovacími štúdiami u ľudí (Cabeza a kol., 1997; Hayes a kol., 2004; Kumaran & Lehn., 2006; ,2009;Ross et al.,2009;Ekstrom et al.2011;Tubridy &Davachi,2011;Hsieh et al.,2014;Davachi&Dubrow,2015;Reederset al.,2018; pre prehľad Long & Kahana,2019). Naše zistenia vychádzajú z týchto predchádzajúcich štúdií tým, že ukazujú, že HC hrá kľúčovú úlohu pri incidenčnom kódovaní a získavaní sekvencií nepriestorových epizód po kontrole mätúceho vplyvu efektov primácie a aktuálnosti. Zostáva určiť, ako HC vykonáva túto funkciu. Ukázalo sa, že HC neuróny poskytujú informácie o časovom kontexte, v ktorom sa udalosti vyskytli (napr. Manns a kol., 2007; MacDonald a kol., 2013; Allen a kol. 2016) a predpokladá sa, že HC používa tento typ časopriestorového signálu utvárať epizodické spomienky spájaním informácií o jednotlivých udalostiach s priestorovými a časovými súvislosťami, v ktorých k nim došlo (Allen & Fortin, 2013; Knierim, 2015; Eichenbaum, 2017). Objasnenie tohto procesu bude vyžadovať zaznamenávanie elektrofyziologickej aktivity počas náhodného kódovania a získavania sledu udalostí.

PFC sa podieľa aj na pamäti poriadku v úlohách priestorovej a objektovej diskriminácie u hlodavcov (Barker a kol., 2007; Hannesson a kol., 2004a, b; DeVito & Eichenbaum, 2011; Mitchell & Laicona, 1998; Fuster, 2001) a ľudí (Staresina & Davachi, 2009; Jenkins & Ranganath, 2010; Tubridy & Davachi, 2011; Allen & Fortin, 2013). Naše údaje sú v súlade s týmto a prispievajú k rastúcemu množstvu dôkazov, že PFC je nevyhnutné pre náhodnú pamäť pre sekvencie nepriestorové epizódy. Nedávne zistenia naznačujú, že PFC sa môže podieľať na riadení toho, ako sa sekvencie získavajú z pamäťových zásob HC v závislosti od aktuálnych požiadaviek na správanie (Jayachandran et al, 2019: Schmidt et al. 2019). Budúce štúdie využívajúce prechodné inaktivácie v tejto úlohe môžu byť užitočné pri objasňovaní špecifickej úlohy PFC pri kódovaní a získavaní sekvencií jedinečných udalostí.

Hoci sa ukázalo, že umlčanie medailových PFC terminálov v PER narúša sekvenčnú pamäť (Jayachandran et al., 2019), toto je prvá správa, ktorá ukazuje, že lézie PER spôsobujú deficit špecifický pre pamäť náhodných objednávok. Tento účinok je v súlade s predchádzajúcimi dôkazmi, že PER sa podieľa na premostení časových spomienok pri podmieňovaní strachu a zjednocovaní diskontinuálnych stimulov (Kholodar-Smith, et al., 2008a, b; Navaroli, 2012). Okrem toho Barker a kol. (2007) uviedli, že potkany s léziami PER majú deficity v pamäti poriadku, ale selektivita tohto účinku bola nejasná, pretože zistili aj významné deficity v rozpoznávacej pamäti. Existuje tiež obava, že ich štúdia sa spoliehala na rozpoznávanie objektov, ktoré je citlivé na lézie PER (napr. Murray & Richmond. 2001; Bussey et al., 2005), a že ich sekvencia pozostávala iba z dvoch položiek, ktoré môžu byť zamenené. efektmi prvenstva a aktuálnosti. Účinky PER pozorované tu objasňujú, že úloha PER v pamäti presahuje vnímanie objektov s viacerými funkciami tým, že ukazuje, že účinky lézií môžu byť špecifické pre pamäť pre poradie, o PER je známe, že sa podieľa na modulácii toku informácií medzi HC, PFC a entorinálne oblasti (napr. Paz et al 2007) a táto modulačná úloha môže byť kľúčom ku kódovaniu a získavaniu sekvencií udalostí.

Závery

Vyvinuli sme novú paradigmu náhodnej objednávky a pamäte položiek, ktorá integruje kľúčové funkcie z iných modelov epizodickej pamäte a demonštrovali, že HC, PFC a PER sú kritické pre pamäť objednávok. Aj keď ide o dôležité zistenia, hlavným nedostatkom štúdie je, že vzor výsledkov sa v rámci troch skupín s léziami významne nelíšil, a teda neosvetlil príslušné príspevky týchto štruktúr. Naša neschopnosť nájsť rozdiely medzi skupinami lézií bola primárne spôsobená experimentálnym dizajnom, ktorý zahŕňal veľa skupín. Aj keď nám tento dizajn umožnil testovať úlohu každej štruktúry v rámci toho istého experimentu (kľúčový cieľ štúdie), párové porovnania medzi skupinami s léziami boli nepraktické kvôli potrebe kontrolovať počet vykonaných posthoc testov. Dúfali sme, že rýchlo prezentovaná verzia tejto úlohy by mohla pomôcť rozlíšiť úlohy týchto štruktúr v rôznych časových intervaloch, ale bohužiaľ, táto alternatívna verzia neviedla k robustnej pamäti objednávok v kontrolných subjektoch. Ďalším faktorom, ktorý tiež mohol prispieť k nedostatočnej diferenciácii medzi účinkami HC, PFC a PER, je naše použitie predtréningových lézií, ktoré ovplyvnili všetky štádiá pamäte (tj kódovanie konsolidácie a získavania). Budúce štúdie využívajúce prechodné inaktivácie môžu byť vhodnejšie na odhalenie rozdielnych porúch tým, že poskytujú príležitosť zamerať sa na konkrétne štádium Tieto zistenia spoločne naznačujú, že HC, PFC a PER sú súčasťou širokej siete štruktúr nevyhnutných na náhodné učenie sa poradia. udalostí v epizodickej pamäti. Objasnenie špecifickej povahy ich príslušných príspevkov, ako aj ich základných nervových mechanizmov, si bude vyžadovať ďalšie skúmanie.