Navádzanie autoreaktívnych T buniek a infiltrácia zápalových buniek

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Experimentálna autoimunitná uveitída (EAU) je zvierací model ľudskej autoimunitnej uveitídy, ktorý je charakterizovaný infiltráciou autoimunitných T buniek so súčasným zvýšením prozápalových cytokínov a reaktívnych foriem kyslíka. Cieľom tejto štúdie bolo posúdiť, či betaín reguluje progresiu EAU u potkanov Lewis. EAU bola indukovaná imunizáciou interfotoreceptorovým proteínom viažucim retinoid (IRBP) a perorálnym podávaním buď vehikula alebo betaínu (100 mg/kg) počas 9 po sebe nasledujúcich dní. Sleziny, krv a sietnice sa odobrali z experimentálnych potkanov v čase usmrtenia a použili sa na test proliferácie T buniek, sérologickú analýzu, polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase a imunohistochémiu. Test proliferácie T buniek odhalil, že betaín mal malý účinok na proliferáciu T buniek sleziny proti antigénu IRBP v in vitro teste v deň 9 po imunizácii. Sérologická analýza ukázala, že hladina sérovej superoxiddismutázy sa zvýšila v skupine liečenej betaínom v porovnaní so skupinou liečenou vehikulom.extrakt z cistanche tubulosaProtizápalový účinok betaínu bol potvrdený znížením regulácie prozápalových molekúl, vrátane adhéznej molekuly I cievnych buniek a interleukínu-1 v sietniciach potkanov s EAU. Histopatologické nálezy súhlasili s nálezmi ionizovanej vápnikovej adaptačnej molekuly 1 imunohistochémie, čo ďalej overovalo, že zápal v sietnici a ciliárnych telieskach bol významne potlačený v skupine liečenej betaínom v porovnaní so skupinou liečenou vehikulom. Výsledky tejto štúdie naznačujú, že betaín sa podieľa na zmierňovaní EAU prostredníctvom antioxidačných a protizápalových aktivít.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Kľúčové slová:protizápalové, antioxidačné, betaín, experimentálna autoimunitná uveitída, sietnica

Úvod

Navádzanie autoreaktívnych T buniek a infiltrácia zápalových buniek, ako sú monocyty, spúšťajú uveitídu a retinitídu pri EAU [6]. Sietnica je poškodená zápalom s aktiváciou gliových buniek, ktoré podliehajú oxidačnému stresu[7].

Betaín, tiež nazývaný trimetylglycín (CH:NO:), je alkaloid a netoxická prírodná látka z Fructus Lycia a reprezentatívna antioxidačná látka [8]. Betaín zlepšuje zápal súvisiaci s vekom u potkanov prostredníctvom zapojenia jadrového faktora-kB prostredníctvom kinázy/I kappa B kinázy indukujúcej jadrový faktor a mitogénom aktivovaných proteínkináz [9], ľudských kardiovaskulárnych ochorení potlačením zápalových cytokínov vrátane interleukínu (IL){{ 6}} a tumor nekrotizujúci faktor-a (TNF-a)[10] a tumorigenéza hrubého čreva indukovaná dextránsulfátom sodným [11].recenzie cistanche tubulosa,Okrem toho betaín zabránil patologickej angiogenéze/neovaskularizácii u potkanov s diabetickou retinitídou [12] a chránil gangliové bunky sietnice na zvýšenie zrakovej ostrosti na zvieracom modeli glaukómu [13]. Je však málo známe o presných mechanizmoch, ktoré sú základom účinkov betaínu pri uveitíde.

V tejto štúdii sa hodnotila účinnosť betaínu pri zmierňovaní EAU. Skúmali sme protizápalový účinok betaínu v EAU na základe histopatologického vyšetrenia a meraní cytokínov. Okrem toho sa u potkanov s EAU hodnotil špecifický mechanizmus betaínu ako antioxidantu.

MATERIÁLY A METÓDY

Zvieratá

Obe pohlavia potkanov Lewis (vo veku 7-9 týždňov; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Kórea) boli umiestnené v našom zariadení v laboratórnych podmienkach (cyklus 12-h svetlo/tma, teplota 23±2 stupne). Všetky experimentálne postupy sa uskutočňovali podľa Smerníc pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Národnej univerzity Jeju (číslo povolenia:2020-0012). Všetky protokoly pre zvieratá boli v súlade s medzinárodnými zákonmi a zásadami NIH, vrátane starostlivosti o laboratórne zvieratá a ich používania (publikácia NIH č.85-23, 1985, revidovaná v roku 1996).

Indukcia EAU

Potkany boli imunizované 200 ul zmiešanej emulzie zloženej z rovnakého objemu hovädzieho interfotoreceptorového proteínu viažuceho retinoid (IRBP) (1 mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Soul, Kórejská republika) a Freundovho kompletného adjuvans (CFA). )doplnené so mnou mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) na labkách ich zadných končatín.

Experimentálne skupiny

Na vyhodnotenie účinkov betaínu (obr. 1A) na EAU boli štyri experimentálne skupiny označené nasledovne: normálna kontrola (n=8); CFA kontrola (n=8);EAU plus vehikulum (n=8);a EAU plus betaín(n=8). Dávka pri liečbe na testovanie terapeutického účinku betaínu(1 0 mg/kg telesnej hmotnosti/deň, B2629, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bola vybraná na základe predchádzajúcej štúdie [14]. Potkany boli orálne liečené 9 betaínom odo dňa 0 po imunizácii do dňa 9 po imunizácii.

Príprava tkaniva

Potkany sa usmrtili v hlbokej anestézii inhaláciou plynu C02 v deň 9 po imunizácii.cistanche UKTkanivá na histopatologické vyšetrenie sa zaliali do parafínového vosku a rozrezali

s mikrotómom (RM 2135; Leica, Nussloch, Nemecko) do hrúbky 5 um a zafarbené hematoxylínom a eozínom. Krv a sietnice sa uchovávali pri -80 stupni na analýzu séra a analýzu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase.

Test proliferácie T buniek

Mononukleárne bunky sleziny zo zvierat v každej skupine boli disociované a suspendované, ako je opísané v našej predchádzajúcej štúdii [15]. Potom sa do jamiek pridalo 10 ug/ml IRBP (konečná koncentrácia). Po 48 hodinách stimulácie pomocou IRBP boli bunky inkubované v 1 μCi 'H-metyltymidínu (špecifická aktivita 42 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL, USA) počas 18 hodín. Potom sa bunky zozbierali na meranie inkorporácie tymidínu.

Cistanche môže proti starnutiu

Sérologická analýza

Potkany sa usmrtili v deň odberu vzoriek a cez srdce sa odobrala krv. Vzorky plnej krvi sa rozdelili na sérum a krvné bunky pomocou centrifúgy (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, Kórejská republika). Aktivita superoxiddismutázy (SOD) v sére bola hodnotená pomocou súpravy SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, UK).

Imunohistochémia

Imunohistochémia sa uskutočnila pomocou rovnakého protokolu, aký bol opísaný v našej predchádzajúcej štúdii [16]. Primárne protilátky vrátane ionizovanej molekuly adaptéra viažuceho vápnik (Ibal) (1:1,000;019-19741, Wako Pure Chemical Industries,Ltd,Osaka,Japonsko),CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK) a glutamínsyntetáza (GS)(1:5,000;MAB302,Chemicon In -ternational, Temecula, CA, USA) boli použité ako marker pre mikrog-lia, makrofágy a Müllerove bunky.

PCR v reálnom čase

Celková RNA v očných bulvách vo všetkých skupinách (n{0}} na skupinu) bola izolovaná pomocou TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) a cDNA bola pripravená pomocou CellScript M All-in - Jeden 5X prvý štandardný hlavný mix syntézy cDNA (CellSafe, Gyeonggi-do, Kórejská republika). Informácie o priméroch sú uvedené v tabuľke 1. PCR sa uskutočnila s MIC cycler (BMS, Queensland, Austrália) s použitím 2x SYBR Green (PhileKorea, Soul, Kórejská republika) a nasledujúceho programu: 55 cyklov denaturácie (5 s,95 stupeň ), žíhanie (20 s, 60 stupňov) a predĺženie (10 s, 72 stupňov).

Western blot analýza

Analýza Western blot sa uskutočnila podľa rovnakého protokolu, aký bol opísaný v našej predchádzajúcej štúdii [16].cistanche wirkungPrimárne protilátky vrátane Kelchovho ECH-asociovaného proteínu 1 (Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam,MA,USA) a nukleárneho faktora erytroidného-2-prepojeného faktora2(Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa cruz,CA,USA).

Štatistická analýza

Všetky merania sú uvedené ako priemer troch nezávislých experimentov. Všetky hodnoty sú prezentované ako stredná štandardná chyba priemeru (SEM). Výsledky sa analyzovali pomocou jednosmernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Student-Newman-Keuls posthoc test na viacnásobné porovnania. P-hodnota<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

VÝSLEDKY

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 vs. EAU plus vozidlo). Tieto údaje naznačujú, že betaín nebol zapojený do IRBP-špecifických T buniek alebo ich auto-reaktivity.

Betain upreguloval sérové ​​hladiny SOD v EAU

Hodnotili sme oxidačné poškodenie v sére pomocou SOD ako markera oxidačnej modifikácie. Medzi normálnou a CFA skupinou nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel. Aktivita SOD sa významne znížila v skupine EAU plus vehikulum v porovnaní s hladinami v skupine s normálnou kontrolou a CFA. Ošetrenie betaínom významne obnovilo úroveň aktivity SOD na úroveň normálnej kontrolnej skupiny a skupiny CFA (obr. 2). Tento výsledok naznačuje, že liečba betaínom potlačila oxidačný stres u potkanov s EAU.

Betain znížil infiltráciu Ibal-pozitívnych buniek v ciliárnych telieskach a sietniciach potkanov indukovaných EAU

Ciliárne teliesko je hlavným miestom infiltrácie zápalových buniek kvôli množstvu krvných ciev [18]. Len niekoľko buniek okrúhleho typu bolo detegovaných v mihalniciach v normálnych a CFA skupinách (obr. 3A, 3B), zatiaľ čo infiltrácia niektorých buniek okrúhleho typu bola potvrdená v skupinách indukovaných EAU (šípky na obr. 3C ,3D). Normálne (obr. 3E) a CFA (obr. 3F) skupiny konzistentne vykazovali podobné výsledky ako tie, ktoré boli pozorované pre Ibal imunoreaktivitu. Ibal-pozitívna imunoreaktivita sa zvýšila v skupinách EAU plus vehikulum a EAU plus betaín (šípky na obr. 3G, 3H). Avšak počet Ibal-pozitívnych buniek sa významne znížil v skupine EAU plus betaín v porovnaní so skupinou EAU plus vehikulum (obr. 3I). Analyzovali sme aj lokalizáciu EDI ako ďalší prístup na vyhodnotenie presnej lokalizácie infiltrácie zápalových buniek v ciliárnom teliesku. ) skupiny. Na rozdiel od toho bolo v skupinách EAU plus vehikulum a EAU plus betaín detegované množstvo ED{19}}pozitívnych buniek (dvojité šípky na obr. 3L, 3M).citrusové bioflavonoidySemikvantitatívna analýza počtu ED1-pozitívnych buniek potvrdila, že liečba betaínom potlačila infiltráciu zápalových buniek v ciliárnych telieskach potkanov indukovaných EAU.

Ďalej sme skúmali histopatologické zmeny na sietnici (obr. 4). Niekoľko zápalových buniek bolo detegovaných v sietniciach s EAU, ale nie v normálnych a CFA potkaních sietniciach (obr. 4A~4D). Lézie boli hodnotené histopatologicky podľa závažnosti EAU [17], čo odhalilo zmiernenie zápalu sietnice (obr. 4E). Aktivácia mikrogliálnych a Müllerových buniek indikujúca zápal sietnice bola potvrdená na základe globálnej (obr. 4F~4I) a GS imunoreaktivity (obr. 4K~4N). Lokalizácia Ibal v mikrogliách bola veľmi zriedkavá v normálnych a CFA skupinách (šípky na obr. 4F, resp. 4G). Aktivácia mikroglií bola inhibovaná u EAU potkanov (šípky na obr. 4H) pôsobením betaínu (obr. 41, 4J). Výsledok GS-pozitívnej imunoreaktivity bol podobný ako výsledok globálnej v sietnici (obr. 4K~4N). Aktivované Müllerove bunky v skupine EAU plus vehikulum mali nižšie hladiny GS-imunoreaktivity (obr. 40).

Betaín potlačil adhéznu molekulu a prozápalové mediátory v EAU

Ďalej sme skúmali expresiu adhéznych molekúl pomocou PCR v reálnom čase (obr. 5A). Pozorovalo sa prudké zníženie hladiny adhéznej molekuly 1 (VCAM1) mRNA cievnych buniek v skupine EAU plus betaín (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

Betaín upreguloval antioxidačné enzýmy katalázu (CAT) a SODinEAU

Štúdium úrovní oxidačného poškodenia v sére nás podnietilo preskúmať stav antioxidačnej odozvy antioxidačných enzýmov, vrátane CAT, SOD1, SOD2 a SOD3 (obr. 5C). Pozorovali sme významne zvýšené hladiny expresie CAT, SOD1, SOD2 a SOD3 v očných bulvách skupiny EAU plus betaín v porovnaní so skupinou EAU plus vehikulum.

Betaín aktivoval dráhu Keapl-Nrf2

Na podporu antioxidačného účinku betaínu sa skúmala dráha Keapl-Nrf2 (obr. 6). Hladiny proteínov Keapl (0,75±0,05-násobné zmeny,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

v porovnaní s normálnou kontrolou. Na druhej strane Keapl a Nrf2 vykázali buď 1,46 ±0.00 násobné zmeny alebo 1,13 ±0,34 násobné zmeny v porovnaní so skupinou EAU plus Vehide (str.<0.01 and=""><0.001,>

DISKUSIA

Toto je prvá štúdia uvádzajúca, že betaín zmierňuje progresiu patogenézy EAU prostredníctvom protizápalových a antioxidačných účinkov, ale nie potlačením proliferácie T buniek (Schématická ilustrácia na Obr. 7).

Predpokladá sa, že regulačný účinok betaínu pri autoimunitných ochoreniach, dokázaný pomocou EAU, prototypu autoimunitného ochorenia, je spôsobený znížením oxidačného stresu a prozápalových mediátorov, nie však proliferácie T buniek, betaínom [19]. Podobne táto štúdia odhalila, že betaín mal malý vplyv na proliferáciu T buniek a cytokínový profil v supernatante kultúry v modeli EAU, čo naznačuje, že betaín neovplyvňuje imunitnú odpoveď proliferácie autoimunitných T buniek v EAU. Uvea je cieľovým orgánom v EAU. Uvea a sietnica sú imunologicky izolované orgány bez lymfatických uzlín [20]. Autoimunitné T bunky v EAU sú napadnuté vetvou ciliárnych a oftalmických artérií [21]. Oxidačný stres je kritickou signalizáciou progresie zápalovej odpovede a zvýšené reaktívne formy kyslíka spôsobujú endoteliálnu dysfunkciu a poškodenie tkaniva [22]. Narušené endotelové bunky vedú k podpore prechodu zápalových buniek a zápalových molekúl [22]. Zápalové mediátory a bunky v uvea sa spúšťajú v bunkách pigmentového epitelu sietnice, ktoré narúšajú spojenie medzi bunkami tyčinky a čapíka a pigmentovanými epitelovými bunkami, čo vedie k oddelenej sietnici [23]. Ciliárne teliesko je vstupným miestom pre očný zápal. Typický zápal sietnice sa podieľa na aktivácii rezidentných mikroglií a infiltrácii zápalových buniek v dôsledku narušenia hemato-sietnicovej bariéry [24]. Za neuropatologických stavov, vrátane mozgových nádorov [25], axotómie [26] a vírusovej infekcie [27], boli aktivované makrofágy a mikroglie rozlíšené Ibalom. Okrem toho sa aktivované rezidentné mikroglie podieľajú na patologických zmenách vyskytujúcich sa pri degeneratívnych ochoreniach sietnice a uvoľňujú zápalové mediátory, ktoré zhoršujú proces ochorenia [28]. Tieto výsledky naznačujú, že betaín má protizápalové účinky v uvea a ciliárnom teliesku, ktoré sú hlavnými cieľmi EAU, a môže znižovať oxidačný stres v sére. Presný mechanizmus je však potrebné preskúmať.

Aktivované mikroglie sú hlavným zdrojom prozápalových cytokínov pri degeneratívnych stavoch sietnice [29]. Prozápalové cytokíny, vrátane IL a TNF, sú silne spojené so zápalom oka [30] a retinitídou [6,29]. Okrem mikroglií sú Müllerove bunky aktivované pri všetkých patologických javoch, ktoré sa vyskytujú v sietnici [31]. Aktivované Müllerove bunky sa podieľajú na neurozápalovom účinku v sietnici syntetizovaním a uvoľňovaním molekúl súvisiacich so zápalom [31]. Predpokladáme, že betaín zmierňuje zápalovú odpoveď u potkanov indukovaných EAU potlačením aktivácie mikroglií a Müllerových buniek. Upregulácia VCAMl sa výrazne podieľa na infiltrácii zápalových buniek [32]. VCAMl sa expeduje do CD4 Tlym-fagocytov prostredníctvom krížovej komunikácie s neskorým antigénom-4[3]. Okrem toho Serpina3n, enzým, ktorý iniciuje zápal [34], bol detegovaný v Müllerových bunkách, astrocytoch a pigmentovom epiteli sietnice svetlom poškodených sietníc [35] a má výrazne variabilné hladiny v sietnici myši Nrl's poškodenými kužeľovými bunkami [36]. Serpina3n je zvýšená v EAU potkanov so závažným zápalom sietnice, ale významne sa znížil v skupine EAU liečenej betaínom. Podobný nález bol hlásený pre schizofréniu s neurozápalom [34], keďže myšacia Serpina3n je ortológom ľudskej Serpiny3 [37]. Okrem toho bolo pozorované zvýšenie IL-1 pri poškodení sietnice vyvolanej vysokou fruktózou [38]. Predpokladáme, že protizápalový účinok betaínu je spojený s down-reguláciou VCAM1, Serpina3n a IL-1 u potkanov indukovaných EAU. Dráha Keep-Nrf2 sa používa na monitorovanie oxidačného stresu [39]. Betaín bol známy ako antioxidačná molekula, ktorá bola spojená s dráhou Keapl-Nrf2 v modeli akútneho poškodenia pečene vyvolaného acetaminofénom [40]. Okrem toho sa profilovanie pečeňovej génovej expresie uskutočnilo po liečbe 3H-1,2-ditiol-3-tiónom, ktorá mala za úlohu posilniť detoxikáciu karcinogénov a chrániť pred neopláziou [4]. Výsledok tohto profilovania odhalil, že Keap1-Nrf2 regulovaný nrf2-závislý 3H-1,2-ditiol-3-tiónom indukovateľný gén, vrátane AF033381, ako betain homocysteín metyl transferáza, bola zvýšená a podieľala sa na detoxikácii a antioxidácii [41]. Zápalová odpoveď v EAU bola indukovaná infiltráciou zápalových buniek, ako sú T bunky a makrofágy [42], a produkciou oxidačného stresu, najmä vo fotoreceptorových mitochondriách skorého štádia [43]. Podľa týchto výsledkov bola liečba betaínom kandidátom na zmiernenie poškodenia tkaniva vyvolaného EAU moduláciou dráhy Keap1-Nrf2, ktorá je kľúčovou cestou k regulácii oxidačného stresu.

Antioxidačný účinok betaínu bol široko hodnotený na modeloch poranenia vyvolaného radikálmi [44]. V mozgu s oxidačným poškodením vyvolaným levodopou bol betaín zvýšený na hladiny CAT a SOD, čo sú reprezentatívne antioxidačné enzýmy[4]. SOD1, SOD2 a SOD3 sú aktivované rôznymi mechanizmami a sú lokalizované v cytoplazme, mitochondriách a extracelulárnej matrici [45]. Betaín sa ako antioxidačná molekula podieľa na znižovaní oxidačného poškodenia [46]. Znížený oxidačný stres sa rozšíril na vyriešenie zápalu, indikovaného Ibal-pozitívnymi makrofágmi/mikrogliami pri mnohých ochoreniach, vrátane Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a roztrúsenej sklerózy [47]. Liečba betaínom bola upregulovaná na hladiny mRNA markera oxidačného stresu v porovnaní s hladinami v skupine EAU plus vehikulum. Tento výsledok naznačuje, že liečba betaínom znížila oxidačný stres v obehovom systéme bez interferencie s proliferáciou T buniek v imunitných orgánoch potkanieho modelu EAU.

Súhrnne táto štúdia naznačuje, že betaín môže zmierniť zápal v sietniciach a ciliárnych telieskach potkanov indukovaných EAU, pravdepodobne prostredníctvom antioxidačných a protizápalových mechanizmov.

Tento článok je prevzatý z https://doi.org/10.5607/en21011