Kynurenínová cesta – nové prepojenie medzi vrodenou a adaptívnou imunitou pri autoimunitných endokrinopatiách, časť 1

Abstrakt:

Kynurenínová dráha (KP) je vysoko regulovaná v imunitnom systéme, kde podporuje imunosupresiu ako odpoveď na infekciu alebo zápal. Indolamín 2,3-dioxygenáza 1 (IDO1), hlavný enzým KP, má široké spektrum aktivity na reguláciu imunitných buniek, pričom kontroluje rovnováhu medzi stimuláciou a potlačením imunitného systému v miestach lokálneho zápalu, čo je relevantné pre široké spektrum autoimunitných a zápalových ochorení. Doposiaľ boli identifikované rôzne autoimunitné ochorenia, medzi nimi endokrinopatie, ale napriek významnému pokroku v ich diagnostike a liečbe sú stále spojené s významnými komplikáciami, morbiditou a mortalitou. Presné bunkové a molekulárne mechanizmy vedúce k nástupu a rozvoju autoimunitného ochorenia sú zatiaľ nedostatočne objasnené. Pri prelomení tolerancie poskytujú bunky vrodenej imunity rozhodujúce mikroprostredie, ktoré reguluje diferenciáciu imunitných buniek, čo vedie k aktivácii adaptívnej imunity. Súčasný prehľad poskytol komplexnú prezentáciu známej úlohy aktivácie IDO1 a KP pri regulácii vrodených a adaptívnych ramien imunitného systému. Významná pozornosť bola venovaná imunoregulačnej úlohe IDO1 pri najrozšírenejších, orgánovo špecifických autoimunitných endokrinopatiách – diabetes mellitus 1. typu (T1DM) a autoimunitnej tyroiditíde.

Kynurenínová dráha je dôležitou biochemickou dráhou úzko súvisiacou s imunitou psov. Nedávne štúdie ukázali, že kynurenínová dráha môže zvýšiť imunitu psov a zlepšiť odolnosť psov voči chorobám prostredníctvom rôznych mechanizmov.

Po prvé, kynurenínová dráha môže podporovať proliferáciu a aktiváciu T buniek u psov, čím zvyšuje bunkovú imunitnú odpoveď u psov. Táto odpoveď je dosiahnutá tým, že T bunky priamo napádajú a ničia patogénne mikroorganizmy, takže jej úloha je veľmi dôležitá. Okrem toho môže kynurenínová dráha tiež podporovať prirodzenú imunitnú funkciu psov, to znamená odolávať patogénnym mikroorganizmom prostredníctvom mechanizmov, ktoré nevyžadujú účasť T-buniek. Tento prirodzený imunitný mechanizmus dokáže rýchlo zareagovať, keď je pes vystavený patogénnym mikroorganizmom, čím sa zabráni vzniku ochorenia.

Okrem toho môže kynurenínová dráha tiež podporovať hojenie rán a opravu tkaniva u psov, čím obnovuje normálnu funkciu poškodených tkanív. Tento efekt úzko súvisí aj s imunitou psov, pretože len vtedy, keď je ich organizmus v dobrej kondícii, dokáže účinne bojovať proti patogénnym mikroorganizmom.

Na záver, kynurenínová dráha môže zvýšiť imunitu psov prostredníctvom rôznych mechanizmov, čím sa zlepší odolnosť psov voči chorobám. Preto by sme mali aktívne podporovať normálnu činnosť kynurenínovej dráhy, aby sme udržali normálny stav imunitného systému psa. Zároveň by sme mali dbať aj na zdravie, výživu a bezpečnosť psov, aby sa lepšie zlepšila ich imunita a predišlo sa vzniku rôznych chorôb. To ukazuje, že musíme zlepšiť imunitu. Cistanche dokáže výrazne zlepšiť našu imunitu. Pretože polysacharidy v mäse môžu regulovať imunitnú odpoveď ľudského imunitného systému, zlepšiť stresovú schopnosť imunitných buniek a zvýšiť baktericídny účinok imunitných buniek.

Kliknite na doplnok cistanche deserticola

Kľúčové slová:

indolamín 2,3-dioxygenáza 1 (IDO1); kynurenínová dráha (KP); vrodená imunita; adaptívna imunita; autoimunitné ochorenie; autoimunitné endokrinopatie; diabetes mellitus 1. typu (T1DM); autoimunitná tyroiditída.

1. Úvod

Epidemiologické štúdie ukazujú, že 3–5 percent bežnej populácie trpí autoimunitnými ochoreniami, pričom každý rok narastá. Patofyziológia autoimunitných ochorení zvyčajne vyplýva zo straty sebatolerancie, čo vedie k produkcii autoprotilátok a samovoľne reagujúcich lymfocytov, ktoré spôsobujú deštrukciu tkaniva. Doteraz bolo popísaných asi 80 rôznych autoimunitných ochorení – viaceré z nich sú charakterizované orgánovo špecifickou imunitnou dysfunkciou (ako je Hashimotova choroba (HD), diabetes mellitus 1. typu (T1DM)), zatiaľ čo ostatné sú systémové imunitné dysfunkcie zahŕňajúce mnohopočetné orgánov, ako je systémový lupus erythematosus, skleróza multiplex a iné [1,2].

Takmer polovicu diagnostikovaných autoimunitných ochorení tvoria autoimunitné endokrinopatie, z ktorých najčastejšie ochorenia štítnej žľazy, T1DM, celiakia a vitiligo. Dôsledkom autoimunitného procesu je typicky nedostatočnosť endokrinných žliaz; jedinou známou výnimkou je však Gravesova choroba (GD), pri ktorej štítna žľaza nie je zničená, ale stáva sa nadmerne aktívnou v dôsledku prítomnosti špecifických protilátok. Autoimunitné endokrinopatie môžu koexistovať u tých istých jedincov. Okrem toho sa často pozoruje jeho rodinný výskyt. Patofyziológia je výsledkom komplexnej súhry medzi genetickou predispozíciou a environmentálnymi/endogénnymi faktormi. Meranie orgánovo špecifických autoprotilátok a vhodné stanovenie hormónov zohráva kľúčovú úlohu v diagnostickom procese a stratégii liečby [3].

HD je autoimunitná tyroiditída charakterizovaná atrofiou folikulárnych buniek štítnej žľazy, lymfocytárnou infiltráciou v zapálenom orgáne a progresívnou fibrózou [4]. Počiatočné štádium HD môže byť asymptomatické, zatiaľ čo niektorí pacienti budú mať iba protilátky proti tyreoglobulínu (anti-Tg). Výskyt protilátok proti tyreoidálnej peroxidáze (anti-TPO) sa považuje za prediktívny faktor, ktorý indikuje prechod subklinickej hypotyreózy do zjavnej hypotyreózy, pozorovaný približne u 20–30 percent pacientov s autoimunitnou tyroiditídou [5].

GD je najčastejšou príčinou hypertyreózy v oblastiach s dostatkom jódu. Produkcia autoprotilátok proti TSH-receptoru (TRAb) predstavuje dôkaz progresie ochorenia; faktory určujúce indukciu ochorenia však zostávajú zatiaľ neznáme [6]. GD ovplyvňuje fungovanie väčšinových systémov v ľudskom tele a zvyčajne vedie k rozvoju klinických príznakov hypertyreózy, cievnej strumy, Gravesovej orbitopatie (25 percent prípadov), dermatopatie štítnej žľazy (asi 4 percent prípadov); preto sa príznaky a symptómy spojené s GD môžu výrazne líšiť a významne ovplyvňujú celkový zdravotný stav [7,8].

T1DM sa vyznačuje aberantnými imunitnými odpoveďami na špecifické autoantigény buniek, čo vedie k nedostatku inzulínu a hyperglykémii, ktorá sa vyvíja prostredníctvom súhry genetickej náchylnosti a environmentálnych faktorov. Hoci etiológia T1DM nie je úplne objasnená, predpokladá sa, že patogenéza ochorenia zahŕňa autoimunologickú deštrukciu buniek [9]. Najvyššia incidencia diagnostiky T1DM sa pozoruje v detstve a dospievaní [10], napriek tomu sa symptómy môžu vyvinúť počas celého života.

Asi 90 percent prípadov novodiagnostikovaného DM1 má detekovateľné protilátky proti špecifickým bunkovým proteínom, ako je inzulín, inzulinómový antigén 2, glutamát dekarboxyláza, tetraspanín-7 alebo transportér zinku 8 [11]. Väčšina ľudí s jednou autoprotilátkou však neprejde do T1DM. Prítomnosť dvoch alebo viacerých sérových autoprotilátok u detí je spojená s 84-percentným rizikom klinického T1DM do veku 18 rokov [12]. Na základe týchto pozorovaní bola patogenéza T1DM rozdelená do troch štádií: štádium 1 (presymptomatické) je definované ako prítomnosť dvoch alebo viacerých autoprotilátok s normoglykémiou, štádium 2 (presymptomatické) ako prítomnosť autoimunity buniek s abnormálnou glykémiou a štádium 3 ako nástup symptomatického ochorenia [13]. Uvedené patogénne štádiá T1DM umožňujú predvídateľnosť progresie ochorenia u rizikových jedincov a poskytujú rámec pre výskum a vývoj preventívnych terapií.
Niektoré autoimunitné ochorenia vyskytujúce sa paralelne sa môžu sformovať do špecifických syndrómov nazývaných autoimunitný polyendokrinný syndróm (APS), ktorý by sa dal definovať ako funkčná porucha dvoch alebo viacerých žliaz. APS typu 1 je charakterizovaná Addisonovou chorobou koexistujúcou s mukokutánnou kandidózou a autoimunitným hypoparatyreoidizmom; môže sa však prejaviť aj T1DM, GD, hypogonadizmom, vitiligom alebo pernicióznou anémiou. APS typu 2 sa môže prejaviť Addisonovou chorobou, autoimunitnou tyroiditídou, T1DM, hypogonadizmom, vitiligom, myasténiou gravis a alopéciou. APS typu 3A súvisí s T1DM a autoimunitnou tyroiditídou, avšak aj s deficitom rastového hormónu a inými abnormalitami, kým pri APS typu 3C je T1DM spojený s psoriázou a celiakiou [14–16].

Autoimunitná Addisonova choroba (AAD) je známa ako dominantná zložka APS1 a APS2. Okrem toho je AAD hlavnou príčinou primárnej adrenálnej insuficiencie, ktorá je diagnostikovaná nízkymi bazálnym sérovým kortizolom, vysokými plazmatickými koncentráciami adrenokortikotropného hormónu (ACTH) a zhoršenou sekréciou kortizolu po teste stimulácie ACTH. Ďalšou základnou podmienkou diagnózy je prítomnosť autoprotilátok proti 21- hydroxyláze (21-OHAbs); autoprotilátky kôry nadobličiek však možno zistiť aj u 40–80 percent pacientov s ADD. V dôsledku deštruktívneho autoimunitného procesu, ktorý vedie k úplnému deficitu sekrécie kortizolu, pacienti s AAD vyžadujú celoživotnú substitučnú liečbu hydrokortizónom [17].

Všetky autoimunitné ochorenia majú spoločnú patogenézu, ktorá obsahuje imunitne sprostredkovaný útok, ktorý vedie k deštrukcii telesných orgánov. Je potrebné spomenúť, že na tomto procese sa podieľa vrodený a adaptívny imunitný systém, čo možno potvrdiť imunologickými, genetickými a histopatologickými štúdiami [18–24]. Kynurenínová dráha (KP) metabolizmu tryptofánu je endogénny systém s imunosupresívnymi vlastnosťami, ktorý sa podieľa na kontrole zápalu a navodení dlhodobej imunitnej tolerancie v rôznych orgánoch v tele [25–27]. V tomto prehľade sa zameriavame na príspevok indolamínu 2, 3-dioxygenázy-1 (IDO1) a katabolitov tryptofánu – kynurenínov – k regulácii interakcií medzi zložkami vrodeného a adaptívneho imunitného systému. Osobitná pozornosť bola venovaná úlohe, ktorú zohrávajú metabolity IDO1 a KP pri vzniku a progresii autoimunitných endokrinopatií.

2. Kynurenínová cesta

V posledných dvoch desaťročiach sa objavila teória, že metabolizmus TRP prostredníctvom KP sa podieľa na kontrole imunitných odpovedí, aby sa udržala autoimunita pod kontrolou [28–30]. TRP je esenciálna aminokyselina rozhodujúca pre syntézu proteínov a tvorbu niekoľkých bioaktívnych zlúčenín s dôležitými fyziologickými funkciami, vrátane serotonínu, tryptamínu, indolov, kynurenínov a nikotínamidadenín dinukleotidu (NAD plus) [31]. Ľuďom chýbajú biochemické cesty na syntézu TRP, ktoré sa musia získavať zo stravy. Po absorpcii TRP cez enterocyty v čreve je transportovaný hepatálnym portálnym systémom do pečene, kde sa využíva na syntézu proteínov (menej ako 1 percento požitého TRP), zatiaľ čo asi 95 percent TRP dodaného v potrave sa metabolizuje KP v pečeni. Zvyšná TRP sa vylučuje do krvného obehu a je dostupná na použitie bunkami periférnych tkanív, ako sú vaskulárne endotelové bunky, fibroblasty a bunky vrodenej imunity [32]. Okrem toho môže byť TRP tiež transportovaný cez hematoencefalickú bariéru na reguláciu syntézy serotonínu v mozgu [33].

Kynurenínová dráha je hlavnou cestou metabolizmu TRP [34]. Hlavné enzýmy a substráty KP sú schematicky znázornené na obrázku 1. Na začiatok sa TRP musí premeniť na N-formylkynurenín, čo je sprostredkované indolamínom 2,3-dioxygenázou (IDO) a tryptofánom 2, 3-dioxygenázu (TDO) a potom na kynurenín (KYN) pomocou Nformylkynurenínformamidázy (FAM) [35]. Prvý krok degradácie TRP za normálnych podmienok je sprostredkovaný TDO, ktorý je hlavným determinantom extrahepatálnej dostupnosti TRP a je indukovateľný samotnou TRP, estrogénmi a glukokortikoidmi. Avšak pri vysokej koncentrácii kortizolu a zápalovom stave je expresia TDO v pečeni potlačená, zatiaľ čo expresia IDO1 je indukovaná v bunkách imunitného systému ako súčasť negatívnej spätnej väzby, ktorej cieľom je kontrolovať zápalové reakcie [36].

Extrahepatálny KP zostáva pod kontrolou dvoch odlišných enzýmov IDO: IDO1 a IDO2, ktorých aktivity sa môžu navzájom líšiť. Aktivita IDO1 je irelevantná za bazálnych podmienok, ale je silne indukovateľná niekoľkými zápalovými stimulmi, ako sú interferón- (IFN-), lipopolysacharid (LPS), tumor nekrotizujúci faktor (TNF-), prozápalové interleukíny (IL), infekcia a transformácia rastový faktor (TGF ) [37,38]. IDO1 je väčšinou aktívny v bunkách imunitného systému, slizničných tkanivách a niektorých nádoroch; mohla by však byť inhibovaná zvýšenými hladinami TRP. Protizápalové cytokíny, IL-4 a IL{11}}, spôsobujú down-reguláciu expresie IDO1 mRNA a redukciu katabolizmu TRP [39], hoci kontroverzné údaje týkajúce sa úlohy IL{{15 }} boli tiež hlásené [40]. Enzymatická aktivita IDO2 je približne 500–1000-krát nižšia ako aktivita cicavčieho IDO1 a IDO2 sa exprimuje hlavne v pečeni, nadsemenníkoch a obličkách [41]. Súčasné štúdie ukázali rozmanitú a kľúčovú úlohu IDO1 v imunoregulácii počas infekcie, tehotenstva, autoimunitných ochorení a neoplázií rôzneho pôvodu [26,28,42,43].

TDO sa považuje za enzým s „vyššou katalytickou aktivitou“ v porovnaní s IDO1 [32]; avšak IDO1 má širšiu substrátovú špecifickosť ako TDO. Hlavnými zdrojmi TDO v ľudskom tele sú pečeň a centrálny nervový systém [44], bol však identifikovaný aj v slizniciach, nadsemenníkoch a mozgu [45].

KYN a jeho metabolity sú biologicky aktívne. Ich výroba musí byť preto prísne kontrolovaná. KYN je centrálnym medziproduktom KP, kde sa metabolická dráha delí na dve rôzne vetvy. KYN môže byť premenený kynurenín 3-monooxygenázou (KMO) na 3-hydroxykynurenín (3-HKYN), ktorý je známy ako jeden z toxických metabolitov. Ľudský KMO je proteín, ktorý pre svoje katalytické pôsobenie vyžaduje nikotínamid adenín dinukleotid fosfát (NADPH) [46]. Následne môže kynurenináza premeniť 3-HKYN na 3-hydroxyantranilovú kyselinu (3-HAA). Napriek tomu by kynurenináza mohla tiež konvertovať kynurenín priamo na kyselinu antranilovú (AA) [47]. Vo všeobecnosti je posledným krokom KP premena 3-HAA na kyselinu chinolínovú (QUIN) pomocou 3-hydroxyantranilátu 3,4-dioxygenázy (3-HAAO) cez nestabilný produkt tejto reakcie – 2-amino-3-karboxymukonát-6-semialdehyd (ACMS) – ktorý ďalej podlieha neenzymatickej cyklizácii na QUIN. Kyselina pikolínová (PA) je tiež tvorená neenzymatickou cyklizáciou semialdehydu kyseliny aminomukonovej (AMS). Tvorba PA však závisí od miery saturácie substrátu enzýmu 2-aminomuconic acid semialdehyddehydrogenase (ACMSD) [35]. Nakoniec sa QUIN spracuje na konečný produkt NAD plus pomocou fosforibozyltransferázy kyseliny chinolínovej (QPRT) [48].

Známa je však aj iná vetva KP – za normálnych podmienok je minoritná, zatiaľ čo sa zvyšuje počas hojnej koncentrácie TRP alebo KYN a obsahuje transformáciu KYN na kyselinu kynurénovú (KYNA), ktorá je tiež uznávaná ako endogénny antagonista N-metylD. -aspartátové (NMDA) receptory. Vyššie uvedený krok je katalyzovaný kynurenínaminotransferázou 1 (KAT-1) [48,49].

3. Úloha metabolitov IDO1 a KP v regulácii imunitného systému

3.1. Vrodená a adaptívna imunita

Imunitný systém neustále udržiava sofistikovanú rovnováhu medzi inváznymi patogénmi a toleranciou voči neškodným antigénom a vlastným antigénom. Imunitný systém ako celok pozostáva z vrodenej a adaptívnej imunity, pričom každá je zodpovedná za inú kapacitu a tvorí rôzne bunkové a nebunkové zložky [50]. Vrodená imunita je prvou obrannou líniou a poskytuje počiatočnú akútnu zápalovú reakciu na poškodenie tkaniva, cudzie antigény alebo patogény [51]. Vrodená imunita je do určitej miery nešpecifická a delí sa na bunkové a nebunkové systémy. Bunkové zložky vrodeného systému zahŕňajú monocyty/makrofágy, dendritické bunky (DC), prirodzené zabíjačské (NK) bunky, eozinofily a neutrofily. Nebunkový systém je extrémne rôznorodý – získava imunitné bunky do miesta poškodenia/infekcie prostredníctvom rôznych cytokínov, podporuje fagocytózu a aktivuje komplementovú kaskádu a adaptívny imunitný systém [51,52].

Aktivácia adaptívneho imunitného systému má za následok antigén-špecifickú odpoveď hostiteľa, ktorá je sprostredkovaná T a B bunkami. B bunky vylučujú antigén-špecifické protilátky na neutralizáciu patogénov, sprostredkúvajú alergické reakcie a autoimunitu a vytvárajú imunitné pamäťové bunky. T bunky sa podieľajú na produkcii cytokínov, priamom cytotoxickom účinku proti infikovanému tkanivu a aktivácii iných imunitných buniek [50]. Bunkové prehovory sú charakteristickým znakom adaptívnej imunity. Proliferácii a diferenciácii naivných B buniek v reakcii na väčšinu antigénov musí predchádzať stimulácia prostredníctvom T buniek, ktoré sú špecifické pre rovnaké antigény. Podobne T bunky na proliferáciu v reakcii na antigény potrebujú ďalšie signály poskytované B bunkami [50]. Vrodená a adaptívna imunita teda spolupracujú pri vytváraní a udržiavaní homeostázy tkanív. Akýkoľvek druh dysregulácie by mohol narušiť pravidelnú imunitnú odpoveď a viesť k pretrvávaniu chronického zápalu alebo dokonca vyvolať autoimunitné reakcie u náchylnejších jedincov.

3.2. Kynureníny v imunoregulácii – „teória vyčerpania TRP“ verzus „teória využitia TRP“

V poslednej dobe úloha KP v regulácii vrodených aj adaptívnych imunitných odpovedí nevyvoláva žiadne pochybnosti, hoci stále nie je úplne vysvetlená. V minulosti pretrvávali dve protichodné teórie, ktoré poukazovali na dôležitosť metabolizmu TRP prostredníctvom KP v imunoregulácii. Prvá, „teória vyčerpania“ predpokladala, že deplécia TRP je primárnou funkciou imunitne podmienenej indukcie IDO1, ktorá bola uznaná ako obranný mechanizmus hostiteľa vrodených imunitných reakcií. Pfefferkorn ukázal, že rast Toxoplasma gondii by mohol byť inhibovaný IFN- -sprostredkovanou indukciou IDO1, ktorá bola spojená so znižovaním koncentrácií TRP [53]. V iných štúdiách in vitro obnovilo doplnenie koncentrácií TRP do kultivačného média rast rakovinových buniek, baktérií a parazitov, čo podporuje teóriu deplécie TRP [54].

Táto teória sa zmenila, keď Munn a spol. [55] zistili, že aktivita IDO1 bola potrebná na zabránenie odmietnutia alogénnych plodov sprostredkovaného T bunkami u gravidných myší. Zistili tiež, že proliferácia T buniek môže byť inhibovaná in vitro stimuláciou spoločne kultivovaných monocytov s IFN-, čo indukuje IDO1-sprostredkovanú depléciu TRP z kultivačného média. Neskoršia štúdia Leeho a kol. [56] preukázali, že T bunky aktivované v neprítomnosti TRP vstúpili do bunkového cyklu; avšak progresia bunkového cyklu je zastavená vo fáze G1 a T bunky sa stali náchylnými na smrť prostredníctvom apoptózy, čiastočne prostredníctvom signalizácie sprostredkovanej Fas. Okrem toho znížená dostupnosť TRP korelovala s aktiváciou všeobecnej kontrolnej dráhy nedepresívnych 2 kináz (GCN2K), inhibíciou cicavčieho cieľa rapamycínu (mTOR) a signalizáciou proteínkinázy C, čo vedie k autofágii a energii T buniek [ 57]. Podľa súčasnej koncepcie deplécia TRP obmedzuje proliferáciu špecifických hostiteľských buniek, ktoré sa stali náchylnejšie na apoptotické stimuly [56].

Hypotéza deplécie TRP vysvetľovala iba aktiváciu IDO1, zatiaľ čo počas imunitnej odpovede sa v mnohých tkanivách vytvárajú KYN, ako aj ďalšie následné metabolity KYN: 3-HKYN, 3-HAA, PA KYNA a QUIN [43 ]. Ukázalo sa, že tieto metabolity sú účinné pri inhibícii proliferácie T buniek prostredníctvom indukcie apoptózy T buniek.

Štúdia využívajúca model transplantácie srdca u potkanov potvrdila tieto výsledky in vivo [58] a vytvorila základ pre takzvanú „teóriu využitia TRP“ [59]. Uvedená teória predpokladala, že imunomodulačné vlastnosti IDO1 sú spôsobené akumuláciou metabolitov KYN v spojení s depléciou TRP [32].

3.3. Imunoregulačná aktivita IDO1

IDO1 je široko exprimovaný v rôznych bunkách, ktoré patria do imunitného systému, ako sú makrofágy, monocyty, DC, eozinofily, neutrofily, niektoré podskupiny T buniek a regulačné B bunky [60–65]. Indukcia expresie a aktivity IDO1 v profesionálnych bunkách prezentujúcich antigén (APC), ako sú DC a makrofágy odvodené od monocytov, ako aj v iných zložkách vrodeného imunitného systému – NK bunky, eozinofily a neutrofily majú viacsmerný vplyv na funkciu týchto buniek v imunitnom systéme (obrázok 2).

3.3.1. IDO1 a DC

Dendritické bunky sú profesionálne APC a kľúčové regulátory imunitného systému. DC vykonávajú mnohé funkcie v imunitnom systéme, vrátane vychytávania, spracovania a prezentácie antigénov naivným T bunkám, aktivácie efektorových T buniek a NK buniek a sekrécie cytokínov a iných imunomodulačných molekúl na formovanie reakcií T a B buniek. . Boli opísané dve hlavné podskupiny ľudských DC periférnej krvi: konvenčné DC (cDC) a plazmocytoidné DC (pDC) [66]. pDC predstavujú jedinečnú bunkovú populáciu, ktorá kombinuje vrodené a adaptívne imunitné reakcie v obrane proti patogénom, autoimunite a rakovine [67]. pDC vylučujú veľké množstvá interferónov typu I a III a môžu vylučovať IL-6, IL-12, IL-23, TNF- a interferónom indukovateľný proteín 10 (IP-10 ). Exprimujú tiež hlavný histokompatibilný komplex triedy II (MHC-II), MHC-I a kostimulačné molekuly (CD40, CD80, CD86) na prezentáciu antigénu [67,68]. Produkcia vyššie uvedených molekúl umožňuje pDC formovať typ imunitnej odpovede.

Napríklad IL-12 môže indukovať Th1 odpoveď a aktiváciu CD8 plus T-buniek a NK-buniek, ktoré sú dôležité pre boj proti infekcii vírusovými a intracelulárnymi patogénmi, zatiaľ čo IL-6 a IL{{6} } môže nasmerovať imunitnú aktivitu smerom k Th17 odpovedi, ktorá hrá dôležitú úlohu pri nábore neutrofilov a makrofágov, imunitných odpovediach proti plesňovým infekciám a pri autoimunitných ochoreniach [69]. pDC môžu tiež vykonávať priame efektorové funkcie. Môžu exprimovať ligand indukujúci apoptózu súvisiaci s TNF (TRAIL), ktorý spôsobuje bunkovú smrť citlivú na TRAIL [70]. Okrem toho môžu pDC zabíjať cieľové bunky uvoľnením serínovej proteázy granzýmu B [71]. Nedávno bola navrhnutá úloha pDC pri autoimunitnom ochorení. pDC môžu pôsobiť priamo na diferenciáciu/udržiavanie autoreaktívnych B buniek a podporovať autoreaktivitu nepriamo prostredníctvom T buniek alebo iných typov buniek [72]. Na druhej strane, zhoršená aktivita pDC sa podieľa na imunodeficientných stavoch alebo neúčinných imunitných odpovediach [73].

Hoci DC hrajú podstatnú úlohu pri iniciácii zápalových reakcií, sú tiež schopné vyvolať imunotoleranciu, okrem iného prostredníctvom upregulácie intracelulárneho enzýmu IDO1. Tieto bunky exprimujú konštitutívne aj IFN- -indukovateľné formy enzýmu [74,75]. Konkrétne sa ukázalo, že pDC má schopnosť produkovať vysoké množstvo IDO1 [60]. Napriek tomu boli pDC opísané ako dosť slabé, pokiaľ ide o ich funkciu prezentácie antigénu v porovnaní s cDC [76]. IFN- samotný môže indukovať up-reguláciu správy IDO1 v DC; avšak ďalší stimul, ako napríklad CD40L alebo LPS, vedie k signifikantne vyššej expresii IDO1 [75]. Aktivácia arylového uhľovodíkového receptora (AhR) v DC je nasledujúcim dôležitým faktorom pre expresiu IDO1 v týchto bunkách. Zistilo sa, že KYN a ďalšie metabolity KP – 3-HKYN a KYNA – sú endogénne ligandy pre AhR a tento mechanizmus môže určiť tolerogénny fenotyp DC, ktorý podporuje expanziu Tregs [77,78].

Zdá sa, že expresia IDO1 v pDC môže skôr modulovať imunitnú odpoveď efektorových buniek, keďže deplécia pDC exprimujúcich IDO1- viedla k zvýšenej proliferácii T buniek a zintenzívneniu zápalu [79]. Vyššie uvedené zistenie bolo potvrdené v mnohých štúdiách, v ktorých DC1-exprimujúce IDO fungujú ako súčasť procesu „spätnej väzby“ na obmedzenie chronickej alebo nadmernej aktivácie imunitného systému. DC produkujúce IDO1 môžu potlačiť proliferáciu efektorových T buniek a môžu indukovať apoptózu T buniek [75,80]. IDO1-exprimujúce pDC sprostredkúvajú down-reguláciu receptorového zeta-reťazca v T bunkách a podporujú expanziu T regulačných buniek P3 plus (Foxp3 plus) T (Tregs) [81]. Expresia IDO1 v DC môže tiež vychýliť CD4 plus T-pomocné bunky z prozápalového fenotypu Th1 alebo Th17 na tolerogénne Tregs [82]. Expresia IDO1 DC je teda spojená s periférnou toleranciou a indukciou imunosupresie.

Ukázalo sa, že niekoľko molekúl, ktoré indukujú imunitnú supresiu/toleranciu, sprostredkúva svoju aktivitu prostredníctvom IDO1. Ligácia molekúl B7 na DC s cytotoxickým T-lymfocytovým antigénom 4 (CTLA-4), koinhibičnou molekulou exprimovanou na Tregs, môže indukovať expresiu IDO1 v DC [83,84]. Interakcie medzi receptormi programovanej smrti 1 (PD-1) na T bunkách s ich ligandmi na DC môžu tiež podporovať up-reguláciu IDO1 [85]. Okrem toho by imunosupresívny TGF- mohol vyvolať a udržať expresiu IDO1 v pDC [86]. Podobne ostatné molekuly, ako LPS alebo INF-, ktoré môžu indukovať expresiu AhR v DC, môžu tiež udržiavať IDO1 na vysokých hladinách pomocou tohto pozitívneho mechanizmu [77,87].

IDO1 má schopnosť kontrolovať zrenie, migráciu a imunoregulačné vlastnosti DC. DC existujú na periférii ako nezrelé bunky zodpovedné za zachytávanie antigénov na aktiváciu naivných T buniek. Po dozretí DC migrujú do drenážnych lymfoidných orgánov, kde môžu iniciovať imunitu. Ukázalo sa, že expresia a aktivita IDO1 sa zvýšila počas dozrievania DC, čo súviselo s fenotypovými a funkčnými zmenami nevyhnutnými na tvorbu komplexov MHC/peptid a aktiváciu T buniek [88].

Na rozdiel od toho nedostatok IDO1 viedol k zníženému fenotypovému a funkčnému dozrievaniu DC in vitro a in vivo [89]. Avšak Bracho-Sanchez a spol. [90] ukázali, že DC ošetrené exogénnym ľudským rekombinantným IDO si zachovávajú nezrelý fenotyp bez ovplyvnenia ich životaschopnosti a poskytujú supresiu antigén-špecifickej proliferácie T buniek in vitro. Okrem toho produkcia IL-12p70 v DC bola významne znížená, zatiaľ čo IL-10 bola zachovaná, čo naznačuje, že diferenciácia naivných Th buniek môže byť zameraná na imunosupresívne Th2 alebo Tregs. Tieto výsledky naznačujú, že kondicionovanie DC bolo sprostredkované enzymatickým pôsobením IDO1 a že supresia T buniek sprostredkovaná DC bola závislá od delécie TRP aj od prítomnosti kynurenínov, ktoré boli spolu účinnejšie pri zrušení stimulácie T buniek.

3.3.2. IDO1 a monocyty/makrofágy

Monocyty a makrofágy majú široké zápalové, imunomodulačné a tkanivové reparačné vlastnosti. Patria do prvej línie obranných buniek a môžu aktivovať imunitný systém, aby spustil imunitnú odpoveď. Pred polarizáciou existujú makrofágy ako neviazané (M0), ktoré budú schopné po stimulácii príslušnými cytokínmi a mikrobiálnymi produktmi exprimovať špecializované funkcie. Stimulácia vedie k polarizácii M0 buniek na 2 skupiny: makrofágy typu M1- a M2-, ktoré sú rozpoznané ako klasicky a alternatívne aktivované makrofágy. Makrofágy M1 môžu byť indukované faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF), IFN- a LPS, zatiaľ čo makrofágy typu M2- môžu byť polarizované po expozícii imunitným komplexom, IL-4 , IL-13, IL-10 a glukokortikoidy [91].

Makrofágy M1 sa zvyčajne považujú za prozápalové a vylučujú IL-12 a TNF-, zatiaľ čo makrofágy M2 majú imunomodulačné funkcie, funkcie na hojenie rán a remodeláciu tkaniva a produkujú IL-4 a IL-10 [ 92]. Makrofágy majú vysoký stupeň funkčnej plasticity: môžu ľahko prejsť z typu M1 na typ M2 a naopak, v závislosti od cytokínov prítomných v ich prostredí [93]. Pri určitých autoimunitných ochoreniach sa však súčasne pozorovali makrofágy M1 aj M2, ako aj nimi produkované cytokíny [92]. Okrem toho sa pri určitých ochoreniach zistili intermediárne formy makrofágov, ktoré koexprimujú M1- aj M{15}}špecifické markery [94]. Tieto zistenia ukázali, že polarizácia makrofágov je dynamický a reverzibilný proces, ktorý závisí nielen od lokálneho prostredia, ale aj od štádia ochorenia.

Makrofágy a monocyty môžu exprimovať IDO1, ale iba po stimulácii IFN- [74]. Indukcia IDO1 môže zmeniť fenotyp makrofágov z prozápalového M1 na tolerogénny M2. Wang a kol. [61] ukázali, že expresia IDO1 v makrofágoch M1-typu, diferencovaných od THP{10}} buniek ošetrených IFN- , bola významne vyššia ako u M2-typu, ktorý sa polarizoval z THP -1 buniek kultivovaných s M-CSF. Ukázali tiež, že nadmerná expresia IDO1 podporuje diferenciáciu buniek THP{16}}, ktoré sa široko používajú ako model diferenciácie monocytov/makrofágov, na makrofágy typu M{17}}. Naopak, ticho IDO1 indukuje tvorbu makrofágov typu M1- [61].

IDO1 môže inhibovať nábor makrofágov a proces fagocytózy u myších modelov keratitídy Aspergillus fumigatus. IDO1 však môže tiež podporovať polarizáciu makrofágov do fenotypu M1 aktiváciou mitogénom aktivovanej proteínkinázy/regulovanej extracelulárnym signálom (MAPK/ERK), čo naznačuje, že je to nevyhnutné na udržanie rovnováhy medzi protizápalovými a prozápalovými účinkami. v tomto modeli [95]. Rôznorodá úloha makrofágov v zápalových odpovediach môže byť čiastočne spôsobená prítomnosťou AhR. Uvádza sa, že makrofágy s deficitom AhR vykazovali vyššiu hladinu prozápalových cytokínov po stimulácii LPS a že myši s deficitom AhR boli náchylnejšie na letálny šok vyvolaný LPS ako myši divokého typu [96]. Suchard et coworkers [97] nedávno zhrnuli existujúcu literatúru a ukázali, že zvýšená aktivita IDO1 sa považuje za znak aktivácie makrofágov M2.

Zápalový stav je charakterizovaný vysokou úrovňou bunkového stresu a spotreby energie, čo je často sprevádzané zvýšenou mierou poškodenia DNA. Bolo zaznamenané, že oxidácia TRP cez KP môže rekonštruovať hladiny NAD plus, aby splnili energetické požiadavky a podporili mechanizmy opravy DNA v makrofágoch, čím sa zvýši ich životaschopnosť [98].

3.3.3. IDO1 a NK bunky

NK bunky sú cytotoxické lymfocyty, ktoré hrajú významnú úlohu v imunitných odpovediach na exogénne patogény, ako aj v obrane proti rakovinovým bunkám. Cirkulujúce NK bunky sa objavujú hlavne v pokojovej fáze; stres v dôsledku infekcie alebo malignity však spôsobuje ich aktiváciu a sekréciu cytotoxických granúl alebo ligandov receptorov smrti [99]. Pri aktivácii NK buniek hrajú dôležitú úlohu aktivačné a inhibičné receptory prítomné na ich povrchu. Inhibičné receptory pozostávajú zo zabíjačských imunoglobulínových receptorov (KIR), Ig-podobných receptorov (CD158), lektínových receptorov typu C (CD94-NKG2A) a leukocytových inhibičných receptorov (LIR1, LAIR{{8 }}). Dôležité NK aktivačné receptory zahŕňajú NKG2D, DNAM1 a prirodzené cytotoxické receptory: NKp46, NKp30, NKp44 a CD16 (FcgRIII), ktoré sa podieľajú na cytotoxicite závislej od protilátky. Po naviazaní vhodných ligandov tieto aktivačné a inhibičné receptory spolupracujú a rozhodnú sa, či na cieľové bunky pôsobiť cytotoxicitou NK buniek [100]. Priamy cytotoxický účinok NK buniek je sprostredkovaný hlavne dvoma cestami: indukcia apoptózy cieľovej bunky sekréciou proteínov a proteáz narušujúcich membránu alebo apoptóza závislá od kaspázy zahŕňajúca receptory smrti (napr. Fas/CD95) na cieľových bunkách. [99].

NK bunky, ktoré sú jednou z hlavných zložiek vrodeného imunitného systému, tvoria spojenie medzi vrodenou a adaptívnou imunitou. Okrem svojej priamej cytotoxicity NK bunky uvoľňujú rôzne cytokíny a chemokíny, ako sú GM-CSF, IFN-, TNF- a chemokíny: CCL3, CCL4 a CCL5 [101] alebo presluchy s inými imunitnými bunkami, ako sú T a B bunky a DC [102,103]. Okrem toho vykazujú imunologickú pamäť, ktorá môže pretrvávať pri stretnutí s príbuzným antigénom [104]. Janusova kináza/transdukcia signálu a aktivátor transkripcie (JAK-STAT) hrá dôležitú úlohu pri dozrievaní, cytotoxicite alebo prežívaní NK buniek a je známe, že väčšina cytokínov, ktoré môžu aktivovať alebo blokovať NK bunky, ju reguluje [105]. Zistilo sa, že IL-2, ktorý hrá dôležitú úlohu pri proliferácii NK buniek a expresii receptora, môže aktivovať STAT1, 3 a 5. Okrem toho je STAT5 aktivovaný IL-15 a STAT1 a 3 sú aktivované IL-21, čo vedie k proliferácii, dozrievaniu a aktivácii NK buniek [106]. Hyperaktivácia a dysfunkcia NK buniek sú preto spojené s patogenézou niektorých zápalových a autoimunitných ochorení. NK bunky však môžu mať pri týchto ochoreniach ochrannú aj patogénnu úlohu v závislosti od typu ochorenia a okolitého prostredia [107,108].

Kai a kol. [109] identifikovali expresiu IDO1 mRNA závislú od INF v NK bunkách a farmakologická inhibícia IDO1 znížila cytotoxicitu NK buniek proti rakovinovým bunkám. Toto zistenie bolo potvrdené in vivo na modeli subkutánnych B16 tumorov u myší [64]. Tieto výsledky naznačujú, že IDO1 v efektorových NK bunkách zrejme udržiava normálnu cytotoxicitu proti nádorovým bunkám. Bolo však tiež publikované, že katabolity IDO1 blokujú proliferáciu NK buniek [110]. Nedávna štúdia Parka a kol. [111] ukázali, že aktivácia IDO1 v nádorových bunkách spôsobila downreguláciu aktivujúcich prirodzených cytotoxických receptorov NKp46 a NKG2D v NK bunkách, čím sa potlačila ich cytolytická aktivita a indukovala sa smrť NK buniek. Tento deštruktívny účinok bol sprostredkovaný up-reguláciou IDO1 a produkciou KYN, ktorý vstupuje do NK buniek cez AhR na ich povrchoch a priamo zhoršuje funkciu NK buniek. Liečba KYN viedla k zníženej fosforylácii STAT1 a STAT3 v NK bunkách spôsobom závislým od dávky, čo naznačuje, že KYN reguluje NK bunky prostredníctvom signálnych dráh STAT. Na rozdiel od toho farmakologické blokovanie aktivity IDO1 v nádorových bunkách obnovilo cytolytickú aktivitu NK buniek a expresiu receptora [111]. Tieto údaje naznačujú, že aktivácia IDO1 v NK bunkách umiestnených v prostredí nádoru môže hrať protinádorovú funkciu, zatiaľ čo IDO1 produkovaný samotnými nádorovými bunkami môže pôsobiť ako mechanizmus negatívnej spätnej väzby proti protinádorovým imunitným odpovediam.

3.3.4. IDO1 a eozinofily

Eozinofily sú multifunkčné leukocyty, ktoré sa podieľajú na patogenéze zápalových procesov, vrátane hlístových infekcií a alergických ochorení. Boli považované za bunky, ktoré fungujú hlavne ako prvá línia obrany proti parazitom alebo môžu modulovať imunitné reakcie na rôzne stimuly. IL-5, produkovaný primárne Th2 bunkami, je kľúčovým cytokínom pre diferenciáciu, priming a prežitie eozinofilov (112). Napriek tomu samotné eozinofily slúžia ako zdroj rôznych cytokínov a rastových faktorov úzko spojených s viacerými imunomodulačnými funkciami a podieľajú sa na početných homeostatických procesoch v týmuse, mliečnej žľaze, maternici a gastrointestinálnom trakte [113,114]. Vykazujú chemotaxiu lymfoidných chemokínov a vykazujú vlastnosti podobné APC po stimulácii niektorými cytokínmi.

Antigén prezentujúce vlastnosti týchto buniek sú možné vďaka expresii mechanizmov na prezentáciu antigénu a kostimulačných molekúl, vrátane MHC-II, CD80, CD86, CD28 a CD40 [115]. ako pri ich priamej komunikácii s DC [116]. Schopnosť eozinofilov prezentovať antigén a alergénom indukovaný nábor do pľúcneho tkaniva sa považuje za dôkaz interakcie medzi eozinofilmi a T lymfocytmi [117]. Štúdia Venge et al. [118] u pacientov s astmou naznačuje, že eozinofily sa aktívne podieľajú na fibróze a remodelácii pľúcneho tkaniva, čo ich spája s potenciálnou etiológiou tohto ochorenia a so zhoršením kvality života pacientov. Na druhej strane sa ukázalo, že eozinofily sa môžu podieľať na oprave tkaniva, pretože sú vybavené systémom snímania poškodenia tkaniva a môžu uvoľňovať viacero molekúl na opravu tkaniva, ako sú rôzne rastové faktory [112].

Ľudské eozinofily exprimujú funkčne aktívny IDO1, konštitutívne aj po indukcii IFN [62,119], a kokultivácia eozinofilov syntetizujúcich KYN s T bunkami produkujúcimi IFN, ale nie podskupinami T buniek produkujúcich IL{6}}, viedla k apoptóze a inhibícii proliferácie podskupiny Th1, zatiaľ čo bunková línia Th2 bola zachovaná [62]. Ten istý tím ukázal, že farmakologická inhibícia IDO1 in vivo viedla k zvráteniu orálnej imunitnej tolerancie v myšom modeli indukovanom ovalbumínom (OVA) a že opakované intranazálne podávanie OVA vyvolalo toleranciu a zabránilo následnej senzibilizácii na OVA [120]. Tieto výsledky ukázali, že eozinofily ošetrené IFN{13}} môžu podporovať polarizáciu Th2 prostredníctvom expresie funkčne aktívneho IDO1 v lymfoidnom tkanive. Okrem toho môžu eozinofily poháňať Th2 odpoveď svojou schopnosťou produkovať kanonické Th2 cytokíny, ako sú IL-4, IL-5 a IL-13 po stimulácii [121]. Avšak Tulic a spol. [122] pozorovali prítomnosť funkčného IDO1, ktorý bol konštitutívne exprimovaný v eozinofiloch týmusu počas života ľudského dieťaťa za nepatologických podmienok. Súčasne bol KYN detegovaný intracelulárne a okolo buniek morfologicky pripomínajúcich eozinofily. Indukcia IDO1 a TRP katabolitu – KYN – podporila dominanciu Th2 buniek nad Th1 bunkami, ktoré za týchto podmienok podliehajú selektívnej apoptóze. Vyššie uvedené údaje naznačujú imunomodulačnú úlohu eozinofilov exprimujúcich IDO{28}}, čo môže mať dôležité dôsledky pre adaptívny imunitný vývoj.

3.3.5. IDO1 a neutrofily

Neutrofily sú polymorfonukleárne leukocyty a ukázali sa ako jeden zo základných hráčov počas akútnych zápalových stavov, ktoré sa môžu dostať z krvného obehu na miesta poranenia v priebehu niekoľkých minút. Eliminujú invázne patogény niekoľkými mechanizmami, ako je sekrécia baktericídnych molekúl, zapojenie sa do fagocytózy, degranulácia a sekrécia proteolytických enzýmov a reaktívnych foriem kyslíka (ROS) alebo uvoľnenie jadrového materiálu vo forme neutrofilných extracelulárnych pascí [123]. Cirkulujúce neutrofily sú typicky "pokojové bunky" a ich obsah škodlivých intracelulárnych granúl sa neuvoľňuje, aby sa predišlo poškodeniu tkaniva hostiteľa. Neutrofily sa však môžu aktivovať počas imunitných stavov, kde môžu vykazovať 10- až 20-násobné zvýšenie svojej odpovede na prozápalovú stimuláciu, čo vedie k zhoršeniu poškodenia okolitého zdravého tkaniva [124]. Nadmerná aktivácia a nábor neutrofilov sa podieľa na rozvoji rôznych chronických zápalových stavov, ako je reumatoidná artritída, zápalové ochorenie čriev, reumatoidná artritída, metabolický syndróm, ateroskleróza a rakoviny [123, 125]. Na druhej strane, neutrofily môžu tiež podporovať hojenie rán a obmedzenie zápalu [126,127].

Okrem hlavnej úlohy neutrofilov vo vrodenej imunite môžu tieto bunky významne modulovať hlavné zložky adaptívnej imunity vplyvom na B bunky a T bunky. Neutrofily produkujú cytokíny – faktor aktivujúci B bunky (BAFF) a ligand indukujúci proliferáciu (APRIL), ktoré sú potrebné na prežitie a aktiváciu B buniek a ich stimuláciu na produkciu protilátok [128]. Neutrofily môžu produkovať arginázu-1 a ROS a týmto spôsobom môžu inhibovať proliferáciu a aktiváciu T buniek [129]. Môžu tiež fungovať ako APC, uľahčujúce diferenciáciu Th1 a Th17 [130] a môžu prezentovať antigény priamo T bunkám alebo ich prenášať do DC [131].

Je známych niekoľko podtypov neutrofilov a medzi nimi sú identifikované neutrofilné myeloidné supresorové bunky (MDSC), ktoré hrajú hlavnú úlohu v regulácii imunitných odpovedí pri rakovine a mnohých patologických stavoch spojených s chronickým zápalom [132]. Presné bunkové mechanizmy, ktorými môžu MDSC potlačiť reakcie T-buniek, neboli úplne vysvetlené, ale Novitskiy et al. [133] zistili, že inkubácia MDSC s IL-17 zvýšila supresívnu aktivitu týchto buniek prostredníctvom up-regulácie expresie arginázy 1, IDO1 a cyklooxygenázy-2 v modeli karcinómu prsníka u myší. Loughman a kol. [134] pozorovali, že uropatogénna infekcia Escherichia coli (UPEC) redukovala fagocytárne zabíjanie a tlmila produkciu antimikrobiálnych ROS neutrofilmi, ako aj downregulovala ich prozápalovú signalizáciu, chemotaxiu, adhéziu a migráciu.

Ten istý tím ukázal, že UPEC zoslabil vrodené reakcie indukciou expresie IDO1 v ľudských uroepiteliálnych bunkách a neutrofiloch in vitro a že liečba neutrofilov špecifickým inhibítorom IDO1 významne zvýšila ich transepiteliálnu migráciu v reakcii na UPEC. Okrem toho funkcia neutrofilov nebola ovplyvnená u myší s knockoutom IDO1- [135]. Podobne počiatočná expozícia Plasmodium vivax vyvolala aktiváciu vrodenej imunity, ale tento účinok bol sprevádzaný silnou imunosupresiou sprostredkovanou DC exprimujúcimi IDO{4}}, ktorá bola spojená s depléciou niektorých populácií neutrofilov. Pretože neutrofily regulujú funkciu DC počas infekcie, zdá sa, že cross-talk medzi týmito populáciami buniek je dôležitou súčasťou vrodenej imunitnej odpovede [136]. Tieto výsledky ukázali, že indukcia expresie IDO1 v neutrofiloch inhibuje prozápalové vrodené reakcie a podporuje kolonizáciu patogénom, čo potvrdzuje úlohu IDO1 ako kritického regulátora skorého vzájomného kontaktu medzi hostiteľom a patogénom. Na druhej strane sa tiež navrhlo, že regulačné Tregs, ktoré sa objavili počas imunosupresie sprostredkovanej IDO, boli schopné podporovať produkciu TGF, ako aj expresiu IDO1 a hemoxygenázy{14}} neutrofilmi. Tregs teda môžu hrať dôležitú úlohu pri priamej kontrole vrodených imunitných reakcií prostredníctvom indukcie neutrofilov s imunosupresívnymi vlastnosťami [137].

For more information:1950477648nn@gamil.com