Cesta k pokroku Predklinické štúdie neurodegeneratívnych chorôb súvisiacich s vekom: pohľad na hlodavce a modely odvodené od HiPSC, časť 4.

In vitro modely PD odvodené od hiPSC boli tiež vysoko informatívne pri objasňovaní patofyziologickej progresie spojenej s familiárnymi mutáciami PD v neurónových modeloch hiPSC DA odvodených od pacienta.

PD je neurodegeneratívne ochorenie, ktoré má zvyčajne určitý vplyv na pamäť a kognitívne schopnosti pacienta. S neustálym pokrokom modernej medicíny však môžeme použiť rôzne metódy, ktoré pomôžu pacientom udržať si dobrú pamäť.

Po prvé, pravidelné cvičenie môže zlepšiť kognitívne schopnosti a pamäť pacientov s PD. Cvičenie môže podporiť krvný obeh a mozgovú výživu nervových buniek v mozgu, čo pomáha udržiavať spojenie a koordináciu medzi rôznymi časťami mozgu, čím zlepšuje celkovú kognitívnu úroveň.

Po druhé, strava je tiež kľúčom k zlepšeniu pamäti pacientov s PD. Strava s vysokým obsahom vlákniny, nízkym obsahom tuku a cholesterolu je kľúčom k udržaniu zdravia mozgu. Táto strava môže podporiť krvný obeh v mozgu a poskytnúť zdravé živiny, ktoré môžu chrániť neuróny a spomaliť progresiu PD.

Napokon, pozitívny prístup a správny odpočinok sú tiež kľúčom k zlepšeniu pamäti pacientov s PD. Hoci PD prinesie istú ranu pre telo a myseľ, ak si dokážete zachovať optimistický postoj a dopriať si trochu oddychu, môžete zmierniť psychický a psychický stres a lepšie si udržať pamäť.

Stručne povedané, hoci PD bude mať vplyv na pamäť, neznamená to, že nemôžeme robiť zmeny. Správnym cvičením, diétou a psychologickým manažmentom si pacienti s PD môžu zachovať určitú úroveň kognitívnych schopností a pamäte. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými unikátnymi účinkami, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinok Cistanche pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Napríklad neuróny odvodené od hiPSC od pacienta s mutáciou LRRK2 GS2019S vykazovali bunkové fenotypy súvisiace s ochorením, vrátane zvýšenej zraniteľnosti voči oxidačnému stresu170 a zníženej dĺžky a počtu neuritov.171

Ďalšie príklady zahŕňajú DA neuróny odvodené od hiPSC získané od pacientov s mutáciou PARK2, ktorí vykazovali mitochondriálnu dysfunkciu a morfológiu oxidačného stresu172, a neuróny odvodené od hiPSC s mutáciou A53T a SNCA triplikáciou, ktoré vykazujú charakteristické zvýšenie a akumuláciu agregátov a-syn.173

Okrem toho niekoľko štúdií zlepšilo tieto fenotypy chorôb intervenciami zameranými na korekciu mutovaného génu, vrátane LRRK2,174PINK1,175 SNCA,140,176 a GBA1.177 Takéto modely demonštrujú užitočnosť technológie hiPSC pri identifikácii a validácii nových cieľových liekov a poskytujú dôkaz koncepcie pre prístupy génovej terapie.

Modely odvodené od hiPSC pre rôzne NDD sa odvtedy rozšírili na množstvo rôznych kokultúrnych 2D a 3D konfigurácií, čím sa rozšírila modularita a potenciálny základný výskum a predklinické aplikácie.

Aktuálne konfigurácie modelov NDD odvodených od hiPSC 2D modely buniek s jednou a spoločnou kultúrou

V poslednom desaťročí bolo publikované značné množstvo prác využívajúcich 2D kultúry obsahujúce singulárne bunkové typy odvodené od hiPSC. Tieto modely jednotlivých buniek boli informatívne pri odhaľovaní úlohy jednotlivých bunkových populácií v NDD, ako je spinálna svalová atrofia,178,179 AD, PD a amyolaterálna skleróza (ALS)180 (obrázok 1), a navyše umožnili väčšiu pochopenie toho, ako gény spojené s ochorením pôsobia na biologickej úrovni, aby ovplyvnili bunkové poruchy.

Bunkové modely hiPSC boli prijaté do výskumu AD, aby lepšie porozumeli úlohe genetických polymorfizmov a mutácií v jednotlivých populáciách buniek a ako môžu prispieť alebo ovplyvniť ochorenie. V ADmodeli založenom na hiPSC, Kondo et al.181

pozorovali zvýšenú akumuláciu Ab oligoméru spojenú so zvýšenou dysfunkciou endoplazmatického retikula a oxidačným stresom v neurónoch a astrocytoch odvodených od hiPSC získaných od pacientov sAD a fAD obsahujúcich mutáciu APP E693D. 2D individuálne modely odvodené od hiPSC tiež ukázali veľkú hodnotu pri štúdiu genetických príspevkov APOEε4, najväčšieho a najviac replikovateľného genetického rizikového faktora AD, v rôznych modeloch nervových buniek.182

Lin a kolegovia183 použili 2D kultúry na odhalenie, že izogénne astrocyty APOEε4 odvodené od hiPSC vykazujú rozsiahle zmeny v génovej expresii týkajúcej sa akumulácie cholesterolu a internalizácie Ab42, čo sú kritické homeostatické funkcie astrocytov v porovnaní s izogénnymi bunkami APOEε3. Okrem toho izogénne e4 astrocyty vykazovali zníženú schopnosť exprimovať a vylučovať APOE, čo malo za následok zníženú lipidáciu.

Zvýšený rast neuritov v dĺžke aj počte v neurónoch, okrem zvýšenej sekrécie Ab, sa zistilo, že inizogénne neuróny APOEε4 sú tiež patogénnym príspevkom v týchto modeloch.183

Pri vytváraní kultúr astrocytov získaných od neurotypických jedincov izogénnych pre alely APOEε3 a APOEε4 Zhao et al.161 zistili, že astrocyty APOEε4 vykazovali nižší stav lipidácie APOE v porovnaní so zdravými kontrolami APOEε3, čo ďalej zdôraznilo poznatky získané z takýchto modelov.

Použitie 2D kokultúr tiež umožnilo štúdium APOEe4 v kontexte jednotlivých bunkových populácií a interakcií bunka-bunka a toho, ako môžu prispieť k patogenéze AD.

Pri rozšírení vyššie uvedeného experimentu pri spoločnej kultivácii astrocytov APOEε4 odvodených z hiPSC s neurónmi bola narušená morfologická a funkčná integrita neurónov a preukázala sa inhibícia dozrievania v porovnaní s ich izogénnymi kontrolami ε3.161

Súhra medzi rôznymi neurónovými a gliovými bunkami hrá rozhodujúcu úlohu vo vývoji a progresii AD a PD, čím sa využíva technológia hiPSC na vytvorenie modelov in vitro, ktoré napodobňujú interakcie bunka-bunka, a bunkové mikroprostredie sa ukázalo ako vysoko informatívne.

Prínos 2D modelov singulárnej a spoločnej kultúry sa podobne realizoval pri štúdiu príspevku niekoľkých mutácií spôsobujúcich PD k bunkovým fenotypom súvisiacim s ochorením, ako je znížená životaschopnosť buniek a mitochondriálna dysfunkcia.

Prvýkrát to preukázala štúdia Nguyena et al.,170 ktorá ukázala, že modely hiPSCneuronal odvodené od pacientov s PD s mutáciou LRRK2 G2019S vykazovali zvýšené hladiny a-syn, upreguláciu génov zapojených do reakcie na oxidačný stres, ako aj zvýšenú citlivosť na H2O{{ 6}} indukoval oxidačný stres a bunkovú smrť.

Podobne Sánchez-Danés et al.171 vyhodnotili zmeny v autofágii v DA neurónoch odvodených od PD pacienta hiPSC potláčajúceho mutáciu LRRK2 G2019S a pozorovali zvýšenú a-synandovú autofagickú dysfunkciu.

Lepšie pochopenie toho, ako bunkové interakcie podporujú patofyziológiu, sa dosiahlo pomocou modelov kokultúry odvodených od hiPSC. Napríklad sa ukázalo, že astrocyty odvodené od hiPSC majú ochranný prínos v kokultivovaných nervových progenitorových bunkách (NPC) získaných od pacientov s PD po vystavení mitochondriálnym toxínom, rotenónu a kyanidu draselnému, čo sa preukázalo záchranou deficitov diferenciácie a mitochondriálnej dysfunkcie.184

Ďalšia štúdia využívala spoločné kultúry neurónov a astrocytov na skúmanie vplyvu mutácie LRRK2G2019S spôsobujúcej PD na presluchy neurónov a astrocytov. Autori uviedli, že spoločná kultivácia kontrolných DA neurónov odvodených od hiPSC s astrocytmi odvodenými od pacienta nesúcich mutáciu G2019S vyvolala neurodegeneráciu a akumuláciu a-syn v DA neurónoch.185

Táto štúdia ilustrovala užitočnosť kokultúr pri skúmaní rôznych kombinácií génového variantu/mutácie podľa bunkových typov na odhalenie interakcie bunka-bunka a bunkového typu/typov, ktoré prejavujú patogénny účinok variantov spojených s ochorením.

2D kokultúry však tvoria mikroprostredie pre interakcie medzi rôznymi typmi mozgových buniek a sú stále prirodzene obmedzené vo svojej schopnosti modelovať zložitosť mozgu ako trojrozmerného tkaniva a ako také majú inherentné prekážky v súvislosti s transláciou.

3D modely odvodené od hiPSC

Nové technológie umožnili výskumníkom začať vytvárať a hodnotiť 3D modely NDD odvodené od hiPSC vrátane kokultúr a organoidov, ktoré sú biochemicky aj fyziologicky robustné. Modely organoidov. 3D modely organoidov ľudského mozgu sú zamerané na čo najpresnejšie zachytenie komplexnej priestorovej organizácie ľudského mozgu v modeli in vitro.

Tieto mozgové organoidy, získané z hiPSC, sú samoorganizované a majú 3D vlastné vzory. Okrem ich celkových epigenomických a transkripčných podpisov186,187 sa tiež ukázalo, že fyziologické vlastnosti 3D modelov organoidov, ako je citlivosť neurónov na glutamát, inštinktívna Ca2+ signalizácia a vývoj fenotypov dozrievania buniek, úzko odrážajú ľudské mozgové tkanivo 0,188–190

Nedávne štúdie vytvorili a charakterizovali modely AD a PD 3D odvodené od hiPSC, o ktorých sa ukázalo, že vykazujú patologické znaky vysoko reprodukovateľným spôsobom.

Napríklad Gonzalez a kol. 191 vyvinuli model organoidov AD mozgu, ktorý vykazoval progresívnu akumuláciu Ab peptidu so štruktúrami podobnými plaku a amyloidogénnymi vlastnosťami, ako aj výskytom fosforylovaného tau a NFT.

Linet al.183 rozšíril tieto zistenia zavedením izogénneho APOEε3- alebo APOEε4-prenášajúceho bunky podobné mikrogliám do predtým vytvorených mozgových organoidov kultivovaných z hiPSC obsahujúcich duplikačnú mutáciu APP spojenú s AD a pozoroval výrazne dlhý proces tvorby v bunkách podobných mikrogliám APOEε4 v porovnaní s kontrolami APOEε3, čo naznačuje obmedzenú schopnosť senzorických a reagujúcich schopností na extracelulárnu Ab.

Najnovšie Zhao et al.192 vytvorili modely mozgových organoidov pomocou hiPSC odvodených od pacientov s AD a zdravých kontrol nesúcich rôzne genotypy APOE. Model organoidov APOEε4 vykazoval fenotypy súvisiace s ochorením v porovnaní s organoidom APOEε3 odvodeným od iného darcu a izogénnym modelom organoidov APOEε3 vytvoreným úpravou genómu línie APOEε4.

Nepriaznivý účinok genotypu APOEε4 v organoidnom modeli rekapituloval kľúčové patologické znaky AD, vrátane straty synaptickej integrity, apoptotickej bunkovej smrti, akumulácie Ab a fosforylovaného tau, a zvýšil hladiny rozpustného APOE, čím demonštroval vhodnosť systému na modelovanie non-fAD.

Okrem toho tieto výsledky poskytujú ďalšiu podporu pre patogénnu úlohu APOEε4 v AD a jeho potenciál ako liečivého cieľa pre AD.192 Podobne Smitset al.193 vytvoril funkčný DA organoidný model PD stredného mozgu odvodený z tkaniva pacienta s PD obsahujúceho mutáciu LRRK GS2019.

Tento organoidný model produkoval a vylučoval DA a úspešne vykazoval súvisiace charakteristické patológie v organoidoch, ako je znížené množstvo a zložitosť neurónov DA stredného mozgu 193Avšak prístup GT korigujúci mutáciu LRRK nebol v tomto modeli dostatočný na zlepšenie fenotypov chorôb.

Bologninet al.194 tiež vytvoril 3D DA neurónový model odvodený od PD pacienta s mutáciou LRRK2 G2019S, ktorý vykazoval známky mitochondriálnej dysfunkcie a zmenenej morfológie, zníženú DAdiferenciáciu a zložitosť vetvenia a zvýšenú predčasnú smrť buniek u mladých neurónov v porovnaní s izogénnymi kontrolnými líniami; niektoré z týchto porúch boli zachránené podaním inhibítora LRRK2 2 (Inh2).

Je však dôležité poznamenať rôzne obmedzenia, ktoré boli zaznamenané pri používaní 3D modelov organoidov, najmä pokiaľ ide o spontánny a nekontrolovaný spôsob rastu a diferenciácie buniek, ktorý prispieva k interexperimentálnej variabilite.

Spoliehanie sa na spontánne samousporiadanie v organoidných modeloch môže viesť k variáciám medzi modelmi, vrátane heterogénnych proporcií buniek, priestorovej orientácie a fenotypu choroby, vďaka čomu je reprodukovateľnosť prominentným záujmom v 3Dco-kultúre a organoidných modeloch.195

Nedávne pokroky však ukazujú zlepšenia v reprodukovateľnosti v 3D modeloch organoidov,196 zostáva variabilita v identitách terminálnych buniek195 a očakáva sa pokračujúci pokrok.

Systémy spoločnej kultúry. Nedávne biotechnologické pokroky umožnili generovanie sofistikovaného trojrozmerného lešenia, ktoré umožňuje bunkám odvodeným od hiPSC rásť v modeloch založených na spoločnej kultúre, ktoré uľahčujú kontrolovanejší prístup v porovnaní s organoidmi diskutovanými vyššie, najmä pokiaľ ide o typ buniek, zrenie, zloženie a homogénna expozícia buniek.197

Existujúce modely založené na kokultúre zahŕňajú modely motorických neurónov a neuromuskulárneho spojenia odvodené od pacientov s ALS; 180 DA neurónov od pacientov s PD so známymi mutáciami (napr. LRRK2194); trojbunkové modely neurónov, astrocytov a mikroglií modelujúce prostredie neurozápalovej AD;198 a tkanivo kostrového svalstva.199

Tieto modely poskytujú výskumníkom vylepšené nástroje na skúmanie úlohy spojenia priestorovej organizácie tkaniva-bunka-bunka a bunka-matrica, ktoré hrajú hlavnú úlohu v patogenéze NDD. Nedávna štúdia Blancharda et al.200 skonštruovala 3D kokultivačný model BBB odvodený od hiPSC, ktorý pozostával z mozgových endotelových buniek, astrocytov a pericytov na modelovanie vaskulárnych patológií súvisiacich s AD s vysokou presnosťou.

Tento 3D model odhalil kľúčovú úlohu pericytov v bunkách odvodených z APOEε4-, ktoré vykazovali zvýšenú BBB akumuláciu Ab peptidov a fibrilového amyloidu v dôsledku zvýšenej pericytickej signalizácie NFAT-kalcineurínu.

200 Park et al.198 tiež vyvinuli hiPSC 3D trikultúrny AD model pozostávajúci z neurónov, astrocytov a mikroglií na mikrofluidnej platforme, ktorý úspešne rekapituluje charakteristické AD charakteristiky, vrátane akumulácie fosforylovaných agregátov tau ofAb, ako aj neurozápalových znakov, ako napr. nábor mikroglií, uvoľňovanie oxidu dusnatého a následný oxidačný stres.

Hoci cieľom 3D kokultivačných systémov je prekonať vyššie uvedené obmedzenia pozorované v organoidných modeloch, sú tiež spojené s neúspechom. Súčasné modely odvodené od hiPSC generujú neurónové siete, ktorým chýbajú kritické vlastnosti mozgového tkaniva, ktoré chcú reprezentovať, vrátane nedostatku vaskularizácie a potrebnej cirkulácie živín a odstraňovania metabolického odpadu201 a variability pri vytváraní biologicky reprezentatívnych proporcií neurónových a gliových buniek. populácie, vlastnosti, ktoré sú diskutabilnými silnými stránkami pri používaní 3D organoidných kultúr.

Okrem toho 3D modely spoločnej kultúry vyžadujú umelé lešenie a postupné naočkovanie buniek, zatiaľ čo modely organoidov sa vyvinuli „prirodzenejšie“. Použitie kokultúr odvodených od hiPSC však umožňuje výskumníkom nielen skúmať aktívnu úlohu každého bunkového typu pri vytváraní charakteristík ochorení AD a PD, ale aj interakciu buniek odvodených z rôznych genotypov, čo zdôrazňuje revolučnú súpravu nástrojov, ktorú hiPSC predstavujú v molekulárne štúdium NDD.

Výhody a obmedzenia in vitro modelov založených na hiPSC sú podrobnejšie preskúmané v nasledujúcej časti.

For more information:1950477648nn@gmail.com