AbstraktnéHoci starnutie je najväčším rizikovým faktorom pre ľudské chronické (rakovinové, diabetické, kardiovaskulárne a neurodegeneratívne) ochorenia, okrem kalorického obmedzenia a malého počtu liekov (s podstatnými vedľajšími účinkami), ktoré priamo riešia starnutie, je známych len málo intervencií. Existuje teda naliehavá potreba nových možností, ktoré môžu vo všeobecnosti oddialiť procesy starnutia a predchádzať chorobám súvisiacim s vekom. Bunkové starnutie je základom procesov starnutia. Chronologická životnosť (CLS) kvasiniek Saccharomyces cerevisiae je dobre zavedený modelový systém na skúmanie zásahov ľudského postmitotického bunkového starnutia. CLS je definovaný ako počet dní, počas ktorých bunky zostávajú životaschopné v stacionárnej fáze. Vyvinuli sme novú, lacnú a rýchlu kvantitatívnu metódu na meranie CLS v bunkových kultúrach inkubovaných spolu s rôznymi chemickými činidlami a kontrolami na 96-jamkových platniach. Náš protokol PICLS s (1) použitím propídiumjodidu na fluorescenčné čítanie prežitia buniek v čítačke mikrodoštičiek a (2) meraním celkového počtu buniek prostredníctvom absorpcie OD600nm z tej istej platne poskytuje skutočnú vysokovýkonnú kapacitu. V závislosti od logistiky je možné paralelne spracovávať veľké množstvo dosiek, takže triedenie tisícok zlúčenín je možné v krátkom čase. Metóda bola overená meraním účinku rapamycínu a obmedzenia kalórií na kvasinkový CLS. Tento prístup sme použili na skríning chemických činidiel. Objavili sme anti-aging/neuroprotektívny potenciál 2,5-anhydro-D-manitolu (2,5-AM) a navrhli sme jeho použitie samostatne alebo v kombinácii s inými zásahmi proti starnutiu.

Glykozid cistanche môže tiež zvýšiť aktivitu SOD v tkanivách srdca a pečene a výrazne znížiť obsah lipofuscínu a MDA v každom tkanive, účinne zachytáva rôzne reaktívne kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atď.) a chráni pred poškodením DNA. OH-radikálmi. Cystanche fenyletanoidové glykozidy majú silnú schopnosť zachytávať voľné radikály, vyššiu redukčnú schopnosť ako vitamín C, zlepšujú aktivitu SOD v suspenzii spermií, znižujú obsah MDA a majú určitý ochranný účinok na funkciu membrány spermií. Polysacharidy Cistanche môžu zvýšiť aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytoch a pľúcnych tkanivách experimentálne starnúcich myší spôsobenú D-galaktózou, ako aj znížiť obsah MDA a kolagénu v pľúcach a plazme a zvýšiť obsah elastínu. dobrý čistiaci účinok na DPPH, predĺženie doby hypoxie u starnúcich myší, zlepšenie aktivity SOD v sére a oddialenie fyziologickej degenerácie pľúc u experimentálne starnúcich myší Experimenty ukázali, že pri bunkovej morfologickej degenerácii má Cistanche dobrú antioxidačnú schopnosť a má potenciál byť liekom na prevenciu a liečbu chorôb starnutia kože. Zároveň má echinakozid v Cistanche významnú schopnosť vychytávať voľné radikály DPPH a má schopnosť vychytávať reaktívne formy kyslíka a zabraňovať degradácii kolagénu vyvolanej voľnými radikálmi a tiež má dobrý reparačný účinok pri poškodení aniónom voľných radikálov tymínu.

Kliknutím zobrazíte produkty proti starnutiu

【Ďalšie informácie: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Kľúčové slováSaccharomyces cerevisiae · Chronologická životnosť · Chemický skríning · Zlúčenina proti starnutiu · 2,5-anhydro-D-manitol

Úvod

The growing fraction of the elderly (>65 rokov) medzi celkovou populáciou (od ~ 10 percent na celom svete (vyše 20 percent v krajinách prvého sveta) v roku 2020 na extrapolovaných 16 percent v roku 2050), ako aj ich zvyšujúca sa dĺžka života (o ~ 10 rokov od roku 1960 v krajinách prvého sveta ), konfrontuje svet s čoraz ťažšími problémami [1, 2]. Okrem všeobecného zníženia životnej aktivity zostáva starnutie najväčším rizikovým faktorom pre rozvoj chronických ochorení, ktoré následne ohrozujú nezávislý ľudský život a vedú nakoniec k smrti [3–7]. Súčasné lekárske prístupy k prevencii patológií súvisiacich s vekom sú odporúčaniami pre zdravý životný štýl vrátane cvičenia a stravovania. Samotné tieto zásahy však nepostačujú na zabránenie vzniku chorôb súvisiacich s vekom.

Starnutie je charakterizované progresívnou stratou fyziologickej integrity, účinnosti bunkových funkcií a metabolickej signalizácie [8]. Stále väčšie úsilie je zamerané na pochopenie procesov starnutia buniek ovplyvňujúcich vysoko prepojenú a funkčne redundantnú sieť interakcií génov a proteínov [8, 9]. Napriek zložitosti starnutia nedávny výskum v rôznych modelových systémoch, vrátane cicavcov, ukázal, že oneskorené starnutie a predĺženie zdravotného stavu sú uskutočniteľné zásahmi proti starnutiu, ako je aplikácia liekov na rapamycín a obmedzenie kalórií (glukózy) [10–15]. Preto je rozširovanie repertoáru zlúčenín proti starnutiu, ktoré možno využiť ako geroprotektívne terapeutiká a znižovanie ich nežiaducich vedľajších účinkov, jednou zo sľubných stratégií, ktoré môžu oddialiť starnutie a predĺžiť obdobie zdravia.

Nedávny výskum ukázal, že molekulárne mechanizmy pozorované pri starnutí človeka sú zachované v rôznych organizmoch, vrátane jednobunkových kvasiniek [8, 10, 16, 17]. Pučiace kvasinky Saccharomyces cerevisiae sú jedným z najviac študovaných modelových organizmov na odhaľovanie biologických procesov podieľajúcich sa na starnutí buniek. Výhody štúdia starnutia v kvasinkách zahŕňajú krátky generačný čas, prispôsobiteľnú životnosť a jeho dostupnosť pre vysokovýkonné testy. Preto sa tento organizmus stal silným nástrojom na identifikáciu zásahov proti starnutiu. Kvasinky sa bežne používajú na štúdium starnutia dvoma odlišnými spôsobmi: replikatívna životnosť (RLS) a chronologická životnosť (CLS) [18]. RLS meria počet delení jednotlivých buniek, model starnutia pre mitotické bunky, ako sú kmeňové bunky. CLS meria dĺžku času, počas ktorého sa nedeliaca bunka udrží životaschopnou v stacionárnej fáze, čo je model starnutia pre postmitotické bunky, ako sú neuróny. Životaschopnosť starnúcich kvasinkových buniek v podmienkach stacionárnej fázy s nedostatkom živín klesá a nakoniec odumrú.

CLS sa tradične meria odhadom počtu jednotiek tvoriacich kolónie (CFU) na agarovej platni [18]. Bunky kvasiniek v banke s celkovým médiom (väčším alebo rovným 20 ml) sa vystavia jedinej chemickej zlúčenine. V rôznych časových bodoch (napr. po 2, 5 a 8 dňoch) sa malé alikvóty kultúry chronologického starnutia z fasku sériovo zriedia, nanesú na platne s výživným agarom a inkubujú 2 až 3 dni, aby sa vytvorili kolónie a spočítali sa. Frakcia prežitia sa určuje z CFU pre každý chronologický vekový bod vzhľadom na deň 1 (považuje sa za 100-percentné prežitie buniek). Prístup CFU je kvantitatívny, ale je spojený s mnohými nevýhodami. Vyžaduje si to viacnásobné sériové riedenia, kroky na platni a inkubačné doby, aby sa objavili kolónie. Počítanie kolónií sa vykonáva buď manuálnymi alebo drahými prístrojmi. Okrem toho je táto metóda nevhodná a príliš drahá na vysokovýkonný skríning (HTS) tisícok zlúčenín, pretože vyžaduje značné množstvo testovaných liečiv, veľkoobjemové kultúry vo fľašiach a mnoho agarových platní. Bohužiaľ, metóda CFU a všetky najnovšie varianty na meranie CLS sú kriticky závislé od schopnosti postmitotických buniek znovu vstúpiť do mitotickej fázy. Táto metodika v zásade nedokáže rozlíšiť kvasinky v mitotickej zástave od mŕtvych buniek.

Súčasné technické pokroky v metódach odvodených od CFU merajú prežitie a rast buniek na základe rastu kvasiniek v stacionárnej fáze vystavených liečivu v kultúre bohatej na živiny buď v tekutom médiu alebo pomocou bodového testu na agarovej platni [17, 19–21]. . Po 24 hodinách sa rast zostarnutých buniek v kvapalnom médiu meria pomocou absorbancie pri OD600 nm, zatiaľ čo v teste bodkovania sa rast starnutej kultúry na agarovom médiu vizuálne identifikuje po 48 hodinách. Logistické zlepšenie zahŕňa používanie 96-jamkových platní, ktoré umožňujú obmedzený skríning kmeňov s chemickými alebo genómovými deléciami. Pre spojené značené kvasinkové delečné kmene je potrebná prietoková cytometria na kvantifikáciu životaschopnosti jednotlivých kmeňov [22].

Propidium jodid (PI) je fluorescenčné farbivo, ktoré vstupuje len do mŕtvych buniek, a preto je silným markerom na priamu kvantifikáciu bunkovej životaschopnosti [23–25]. Predtým štúdie využívali prístup založený na PI na meranie CLS a kvantifikáciu životaschopnosti buniek analýzou obrázkov získaných fluorescenčným bunkovým počítačom, UV transiluminátorom alebo prietokovou cytometriou [26, 27]. Požiadavky na spracovanie viacerých vzoriek, zobrazovanie a softvér na analýzu údajov sú však drahé a časovo náročné, čo brzdí tieto metódy v skutočných aplikáciách s vysokou priepustnosťou. Zavedenie alternatívnych farbív, ako je zelená SYTOX, má obmedzenú hodnotu v prostredí s vysokou priepustnosťou kvôli neúmerným nákladom [26].

Preto sú potrebné nové metódy na kvantifikáciu životaschopnosti starnúcej bunky, aby sa predišlo obmedzeniam spojeným s existujúcimi metodikami. V tejto práci popisujeme PICLS, metódu merania CLS založenú na PI, ktorá je nezávislá od rastu. Náš nový prístup sa spolieha na inkubáciu kvasinkových buniek s rôznymi testovanými zlúčeninami alebo rôznymi podmienkami testovacieho média v 96-jamkových platniach. Používame PI na kvantifikáciu prežitia buniek. Rýchle a efektívne odčítanie (do ~15 minút) poskytuje čítačka mikrodoštičiek, lacné zariadenie, ktoré je ľahko dostupné vo väčšine laboratórií. Táto lacná metodológia sa dobre hodí na plošný skríning chemických činidiel na identifikáciu zlúčenín proti starnutiu, pretože mnoho rôznych zlúčenín, kontrol alebo riedení možno pohodlne umiestniť na jednu platňu a paralelne spracovať veľké množstvo platní. Okrem toho sme overili našu metódu stanovením rozšírenia CLS kvasiniek pomocou známych zásahov proti starnutiu, ako je podávanie rapamycínu a obmedzenie kalórií. Rýchly prehľad dostupných chemikálií v našom laboratóriu nečakane odhalil 2,5-anhydro-D-manitol (2,5-AM), ktorý predlžuje životnosť kvasiniek. Potvrdili sme tiež antiagingovú aktivitu 2,{15}}AM pomocou tradičných metód rastu. Iné testované analógy cukru nepriniesli žiadny podobný účinok.

Výsledky

Vývoj metódy na kvantifikáciu životaschopnosti buniek pomocou merania fluorescencie propidium jodidu v čítačke mikrodoštičiek

Náš nový protokol začína vystavením buniek kvasiniek divokého typu alebo ich mutantov umiestnených do média bohatého na živiny v 96-jamkových platniach spolu so špecifickou koncentráciou požadovaných chemických zlúčenín. PI používame ako marker bunkovej smrti, pretože toto fluorescenčné farbivo vstupuje iba do neprežívajúcich buniek [23–25]. Životaschopnosť buniek v kultúre v stacionárnej fáze sa kvantifikuje po určitom počte dní odčítaním PI fluorescencie v čítačke mikrodoštičiek, ktorá zase poskytuje elektronicky čitateľný tabuľkový procesor na analýzu údajov.

Ako prvé overenie ukazujeme, že práca s malými množstvami v jamkách mikrodoštičiek poskytuje výsledky podobné prístupom založeným na kyvetách a že čítačka mikrodoštičiek je dostatočne citlivá na zachytenie údajov o prežití buniek. Analyzovali sme teda PI farbenie kvasinkových buniek. Bunky kvasiniek sa pestovali v sklenenej banke a varili sa 15 minút pri 10}0 stupňoch. Živé a mŕtve bunky boli premyté a inkubované v 1 x PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom) bez a s PI (5 ug/ml) počas 15 minút. Po inkubácii sa bunky premyli a resuspendovali v PBS. Bunky sa vizualizovali mikroskopiou a intenzita fluorescencie sa merala čítačkou mikrodoštičiek (doplnkový obrázok S1). Po potvrdení, že PI je vhodný marker pre bunkovú smrť, sa uskutočnila následná analýza na vývoj metódy. Mŕtve bunky zafarbené PI sa resuspendovali v PBS na konečných 48 OD600 nm meraných v kyvete pomocou spektrofotometra. Ďalej boli bunky sériovo nariedené v PBS (OD600nm 48 až 0,05) a prenesené na čiernu 96-jamkovú platňu (costar 3603). Všimnite si, že čierne mikrodoštičky sú štyrikrát drahšie ako číre doštičky a sú menej dostupné, ale použili sme ich, pretože sú vhodnejšie na odčítanie fluorescencie v dôsledku tlmenia autofluorescencie pochádzajúcej zo vzoriek a povrchov mikrodoštičiek. Pomocou zobrazovacieho systému GelDoc (obr. 1A) sme vizualizovali stupeň začlenenia PI farbenia do mŕtvych buniek kvasiniek pri rôznych riedeniach. Pomocou tej istej platne sme merali intenzitu PI fluorescencie pomocou čítačky mikrodoštičiek pri excitácii 535 nm a emisii 617 nm. Zistili sme vysokú lineárnu koreláciu medzi intenzitou PI fluorescencie a bunkovou absorbanciou pri OD600nm (obr. 1B). Tento výsledok naznačuje, že náš variant metódy založenej na fluorescencii PI je účinný na kvantifikáciu životaschopnosti buniek.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 kyvety (obr. 1D). Ďalej sme určili vzťah medzi intenzitou PI fluorescencie a bunkovou OD600nm 96-jamkovej platne v rámci optimálneho rozsahu OD600nm 0,05–12. Pozorujeme takmer dokonalú lineárnu koreláciu (obr. 1E). Náš protokol teda predstavuje robustnú metódu na kvantifikáciu životaschopnosti buniek.

Vplyv typov mikrodoštičiek na kvantifikáciu životaschopnosti buniek pomocou merania fluorescencie propidium jodidu v čítačke mikrodoštičiek

Účinok rapamycínu na chronologickú životnosť kvasiniek

Rapamycín je jedným z dobre známych zásahov proti starnutiu, u ktorých sa preukázalo, že predlžuje životnosť niekoľkých modelových organizmov vrátane kvasiniek, háďatiek, ovocných mušiek a myší [10, 14, 15, 28–30]. Inhibuje komplex TORC1 snímajúci živiny (cieľ komplexu rapamycínu 1). TORC1 je konzervovaný proteínový komplex s viacerými podjednotkami v eukaryotických bunkách, ktorý spája živiny v prostredí s bunkovým rastom a proliferáciou [19, 29, 31–34].

Skúmali sme účinok rapamycínu na chronologickú životnosť (CLS) kvasinkového kmeňa, aby sme potvrdili náš novo vyvinutý protokol. Tu a nižšie sme v našich experimentoch použili prototrofný kmeň kvasiniek (CEN.PK{0}}D), aby sme sa vyhli silným účinkom auxotrofie aminokyselín na prežitie buniek v kultúre v stacionárnej fáze [35, 36]. Bunky boli starnuté s rôznymi koncentráciami rapamycínu v syntetickom definovanom (SD) médiu. Rast buniek sa meral v rôznych časových bodoch (24 h, 48 h a 72 h). Zistili sme, že bunkový rast dosiahol saturáciu približne 24 hodín po inkubácii s 5 nM alebo menej rapamycínom (obr. 4A). Avšak podanie 10 nM rapamycínu spomalilo rast buniek a saturácia sa dosiahla až po 48 hodinách (obr. 4A). Predtým bol podobný trend pozorovaný pre bunky rastúce s rapamycínom v experimente CLS [37].

Ako ďalší krok sa meralo CLS buniek pestovaných v rôznych koncentráciách rapamycínu. Stanovili sme prežitie buniek pomocou fluorescencie PI v rôznych časových bodoch chronologického veku. Časový bod rastu 72 hodín bol považovaný za deň 1. Z grafu prežitia môžeme odvodiť, že rôzne koncentrácie pridaného rapamycínu predlžujú CLS kvasiniek (obr. 4B). Prežitie starých buniek doplnených rapamycínom (5 nM a 1 0 nM) na 4. deň bolo ~ 75 percent; avšak bez rapamycínu bolo ~ 50 percent. Na 7. deň bolo prežitie starých buniek doplnených rapamycínom 70 percent; avšak bez rapamycínu bola znížená na menej ako 20 percent. CLS rozšírenie starých buniek možno pozorovať aj pri nižších koncentráciách (0,62–2,5 nM) rapamycínu (obr. 4B).

Náš protokol sme overili priamym porovnaním s dvoma tradičnými prístupmi k rastu, ktoré merajú CLS kvasiniek. Najprv sme vykonali test rastu v kvapalnom médiu, aby sme zmerali účinok rapamycínu na dĺžku života. Prežitie chronologicky starnúcich buniek sa monitorovalo v rôznych vekových bodoch prenesením 3-µl kultúry do 200 µl YPD média v čerstvej 96-jamkovej platni. Výrast zodpovedá počtu životaschopných buniek v inokule (obr. 4C). Rast buniek po starnutí registrovaný prostredníctvom absorbancie OD600nm sa určil pomocou čítačky mikrodoštičiek. Frakcia prežitia sa vypočítala z nárastu absorbancie OD600nm pre každý vekový bod vzhľadom na deň 1 (považuje sa za 100-percentné prežitie buniek). Graf prežitia je znázornený na obr. 4D.

Podobne sme uskutočňovali rast pomocou bodového testu na agarovom médiu. Na agarovej platni YPD sme našli 3- µl starnúcej kultúry a inkubovali sme ju 48 hodín. Rast starých buniek na agarovej platni YPD sa vizualizoval pomocou zobrazovacieho systému GelDoc (obr. 4E). Ako sa očakávalo, môžeme pozorovať trendy predlžovania životnosti rapamycínom pri testoch YPD na kvapaline aj na agare, ktoré sú paralelné s tými, ktoré boli stanovené v našom novom protokole.

Tieto výsledky ukazujú, že náš protokol HTS reprodukuje, že rapamycín predlžuje životnosť buniek. Ďalej hodnotíme Z-faktor na vyhodnotenie kvality tejto metódy [38]. Vo všeobecnosti Z-faktory v rozsahu 0,5–1.0 svedčia o vynikajúcich testoch HTS. Z-faktor bol stanovený pre rôzne koncentrácie rapamycínu s PI fluorescenciou starých buniek (doplnkový obrázok S2). Naše financovanie, Z-faktor {{10}},70 pre 5 nM rapamycín a 0,74 pre 10 nM rapamycín, zaraďuje túto metódu HTS do kategórie vysokej kvality. Náš protokol je teda dostatočne robustný na identifikáciu potenciálnych zlúčenín proti starnutiu.

Aby sme preskúmali, či je metóda účinná v odlišnom genetickom pozadí kvasiniek, testovali sme účinok rapamycínu na CLS kmeňa BY4743. Kmeň Saccharomyces cerevisiae BY4743 je auxotrofný pre histidín, leucín a uracil. Kmeň BY4743 bol pestovaný v rôznych koncentráciách rapamycínu v SD médiu doplnenom auxotrofnými zložkami. Prežitie starých buniek sa kvantifikovalo pomocou fluorescencie PI (doplnkový obrázok S3). Zistili sme, že rapamycín kvantitatívne zvyšuje životaschopnosť buniek BY4743 podobným spôsobom ako CEN.PK113-7D. Tieto výsledky teda ukazujú, že naša metóda je účinná v rôznych kmeňoch kvasiniek.

Vplyv glukózy na chronologickú životnosť kvasiniek

Našu metódu sme overili aj skúmaním vplyvu obmedzenia kalórií na chronologickú životnosť kvasníc. Obmedzenie kalórií je jedným zo zavedených zásahov na oddialenie starnutia a predĺženie životnosti v modelovom organizme, vrátane kvasiniek a buniek cicavcov [11, 13, 16]. Aby sme určili vplyv obmedzenia kalórií na CLS kvasiniek, znížime obsah glukózy v kultivačnom médiu. Bunku sme pestovali v troch rôznych podmienkach SD média s obsahom 0,25 percenta, 0,5 percenta a 2 percentá glukózy. Merali sme rast buniek v rôznych časových bodoch (24 hodín, 48 hodín a 72 hodín). Všetky kultúry dosiahli saturáciu rastu po 24 hodinách (obr. 5A). Rast buniek bol nižší pri 0,25 percentách a 0,5 percentách v porovnaní s 2 percentami glukózy (obr. 5A). Merali sme prežívanie chronologického starnutia buniek pestovaných pri rôznych koncentráciách glukózy pomocou PI fluorescenčnej metódy (obr. 5B). Z grafu prežitia usudzujeme, že obmedzenie glukózy predlžuje CLS kvasiniek. Súčasne sme tiež potvrdili rozšírenie CLS pomocou testov rastu (obr. 5C, D a E), čím sme ďalej potvrdili našu novú metódu na stanovenie CLS kvasiniek. Účinok obmedzenia glukózy na predĺženie CLS kmeňa BY4743 bol tiež preukázaný metódou PICLS (doplnkový obrázok S3). Náš prístup na meranie CLS kvasiniek teda predstavuje novú, rýchlu a lacnú metódu na skríning chemických činidiel a kultivačných podmienok na identifikáciu zásahov proti starnutiu.

Skríning chemických látok pomocou novo vyvinutej metódy identifikoval 2,5-bezvodý-D-manitol ako novú zlúčeninu proti starnutiu

Po vyvinutí a overení nového protokolu sme túto metódu použili na skríning stoviek chemických látok na identifikáciu zlúčenín proti starnutiu (doplnkový obrázok S4 a doplnková tabuľka 1). Ako jeden z prekvapivých výsledkov sme zistili, že zlúčenina 2,5-anhydro-D-manitol (2,5-AM) môže predĺžiť CLS kvasiniek. Na obr. 6 uvádzame výsledok podrobných následných experimentov pre túto zlúčeninu. Testovali sme aktivitu proti starnutiu 2,5-AM pri rôznych koncentráciách na 96-jamkovej platni. Najprv sme určili účinok 2,{15}}AM na rast buniek. Kvasinkové bunky boli inkubované s rôznymi koncentráciami 2,5-AM v SD médiu. Rast buniek sa meral v rôznych časových bodoch (24 h, 48 h a 72 h). Zistili sme, že rast buniek dosiahol rovnakú úroveň saturácie po 24 hodinách pre všetky testované koncentrácie 2,5-AM (obr. 6A). Potom sme merali prežitie chronologicky starých buniek doplnených o rôzne koncentrácie 2,5-AM pomocou fluorescenčnej metódy PI. Ako predtým, 72-hodinová rastová kultúra sa považovala za deň 1 pre analýzu CLS. Graf prežitia je vynesený pre rôzne časové body chronologického veku (obr. 6B). Zistili sme, že 2,{31}}AM rozširuje CLS spôsobom závislým od koncentrácie. Prežitie zostarnutých buniek doplnených 2,5-AM (8 mM) na 4. deň bolo ~ 80 percent; bez 2 však5- dopoludnia bolo ~ 50 percent . Na 7. deň bolo prežitie 2,5-AM doplnených starých buniek ~ 75 percent; avšak bez 25-dopoludnia sa znížila na menej ako 20 percent . Aktivita proti starnutiu 2,5-AM bola tiež overená testami rastu (obr. 6C, D a E).

2,5-AM je molekula cukru, ktorá môže vstúpiť do dráhy glykolýzy. Hydrolyzuje sa iba pri glykolytických krokoch, ktoré spôsobujú akumuláciu nemetabolizovaného 2,5-AM-1,6-bisfosfátu (2,5-AMBP) v bunkách [39–41 ]. Aby sme otestovali, či 2,5-AM v koncentráciách podobných experimentu CLS bol spracovaný enzýmami glykolýzy, skúmali sme rastúcu citlivosť kmeňa s deléciou génu SNF1. SNF1 je senzor bunkovej energie a vysoko konzervovaná AMP-aktivovaná proteínkináza (AMPK) v eukaryotoch [42, 43]. Kvasinkové bunky, ktorým chýba aktivita AMPK, sú spojené s hypersenzitívnym rastovým fenotypom v prítomnosti nemetabolizovaných glykolytických medziproduktov [44]. Merali sme rast delečného kmeňa snf1Δ s rôznymi koncentráciami 2,5-AM. Zistili sme, že 2,5-AM inhibuje rast kmeňa s deléciou snf1Δ v porovnaní s kmeňom divokého typu (doplnkový obrázok S5). Tento pozorovaný fenotyp rastu naznačuje, že 2,5-AM podlieha glykolýze a hydrolyzuje sa na nemetabolizované glykolytické medziprodukty.

2,5-AM je analógom cukrovej skupiny fruktózy [39]. Aby sme objasnili, či aj iné cukry ovplyvňujú CLS, skúmali sme vplyv fruktózy, manitolu a maltózy na starnutie kvasiniek. Zahrnuli sme aj sorbitol, čo je nemetabolizovaný cukor, o ktorom sa uvádza, že zvyšuje CLS kvasinkových buniek zvýšením osmolarity kultivačného média [20, 45]. Najprv sme testovali účinok fruktózy, manitolu, maltózy a sorbitolu na rast buniek. Kvasinkové bunky sa inkubovali s rôznymi koncentráciami fruktózy, manitolu, maltózy a sorbitolu podobným 2,{7}}AM v SD médiu. Rovnako ako 2,5-AM, bunky inkubované s fruktózou, manitolom, maltózou a sorbitolom dosiahli saturáciu rastu po 24 hodinách (obr. 7A). Ďalej sme merali prežívanie chronologicky starých buniek v deň 1, deň 7, deň 14 a deň 21. Na rozdiel od 2. 5-ráno suplementácia fruktózy, manitolu, maltózy a sorbitolu nepredĺžila životnosť kvasinky (obr. 7B, C, D, E a doplnkový obr. S6). Je pozoruhodné, že 2,{21}}AM predlžuje životnosť aj v neskoršom štádiu chronologického starnutia. Zostarnuté bunky suplementované 2,5-AM (8 mM) prežívajú (~65 percent) na 21. deň. Prežitie zostarnutých buniek bez suplementácie 2,{28}}AM však bolo menej ako 10 percent.

Na naše prekvapenie sme zistili, že sorbitol pri nízkych testovaných koncentráciách nie je schopný zvýšiť CLS (obr. 7B, C, D, E a doplnkový obr. S6). Predpokladali sme, že na zvýšenie CLS môžu byť potrebné vyššie koncentrácie sorbitolu. Testovali sme rozsah vyšších koncentrácií vrátane 1 M sorbitolu, pričom koncentrácia, o ktorej sa predtým uvádzalo, že ovplyvňuje CLS (18 percent ekvivalentné 1 M) [20, 45]. V súlade s predchádzajúcimi správami sme tiež zistili, že veľmi vysoké koncentrácie sorbitolu (medzi 0, 5 a 1 M) zvyšujú CLS kvasiniek (doplnkový obrázok S7), zjavne zvýšením osmolarity média. Je zaujímavé, že zvýšenie CLS o 2,{12}}AM pri veľmi nízkej koncentrácii (2 mM) naznačuje, že mechanizmus aktivity proti starnutiu je odlišný od osmotického. Tieto výsledky naznačujú, že aktivita 2,5-AM proti starnutiu je špecifická pre túto cukrovú zlúčeninu a nie je pozorovaná pre niekoľko ďalších podobne štruktúrovaných chemikálií.

【Ďalšie informácie: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】