Proteáza Calpain2a obmedzuje vrodenú imunitu zacielením na TRAF6 v rybách Teleost
Dec 19, 2023
Faktor 6 spojený s TNF receptorom (TRAF6) hrá kľúčovú úlohu prenosu signálu v antibakteriálnych aj antivírusových signálnych dráhach. Menej sa však uvádzajú regulačné mechanizmy TRAF6 u nižších stavovcov. V tejto štúdii identifikujeme calpain2a ako člena rodiny proteáz závislých od vápnika s jedinečnou aktivitou hydrolytického enzýmu a funguje ako kľúčový regulátor antibakteriálnej a antivírusovej imunity u teleostov rýb. Po stimulácii lipopolysacharidom (LPS), knockdown calpain2a podporuje upreguláciu zápalových cytokínov. Mechanicky calpain2a interaguje s TRAF6 a hydrolýzou znižuje hladinu proteínu TRAF6. Po strate enzymatickej aktivity mutantný calpain2a kompetitívne inhibuje tvorbu diméru a autoubikvitináciu TRAF6. Knockdown calpain2a tiež podporuje bunkovú antivírusovú odpoveď. Mutantný calpain2a, ktorému chýba hydrolázová aktivita, potláča ubikvitináciu regulačného faktora IFN (IRF) 3/7 z TRAF6. Celkovo tieto zistenia klasifikujú calpain2a ako negatívny regulátor vrodených imunitných reakcií zacielením TRAF6 v teleostových rybách.
cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému
Vrodená imunita ako prvá obranná línia proti inváznym patogénom zohráva dôležitú úlohu pri ochrane tela pred bakteriálnou inváziou a vírusovými infekciami. Receptory na rozpoznávanie vzorov (PRR) na membráne okamžite rozpoznávajú molekulárne vzory spojené s patogénmi (PAMP)1–3. Tri najviac študované PRR v vrodenej imunite sú Toll-like receptory (TLR), RIG-I-like receptory (RLR) a NOD-like receptory (NLR), ktoré rozpoznávajú rôzne PAMP a spúšťajú signálne kaskády na aktiváciu prozápalových cytokínov a antivírusový faktor 4–6. TNF receptor-asociovaný faktor (TRAF) 6 je nevyhnutnou súčasťou boja proti bakteriálnej invázii a vírusovým infekciám. Ako dôležitá signálna dráha aktivovaná lipopolysacharidom (LPS) bola podrobne zmapovaná dráha jadrového transkripčného faktora-KB (NF-KB). Väčšina proteínových funkcií v signálnej dráhe NF-KB bola dôkladne študovaná1,7. Myeloidný diferenciačný faktor 88 (MyD88) je najprv aktivovaný TLR v reakcii na LPS a IRAK4 pôsobí ako mediátor aktiváciou IRAK1 a IRAK2, ktoré spájajú MyD88 s TRAF68–11. Ubc13 a Uev1A katalyzujú K63-viazanú ubikvitináciu TRAF6, ktorá prenáša reťazec ubikvitínu K63 na TAB2 a TAB3, čo vedie k aktivácii TAK112–16. TRAF6-regulovaný aktivátor IKK 2 (TRIKA2), ktorý sa skladá z TAK1, TAB1 a TAB2, aktivuje inhibítor IκB kinázy (IKK) / fosforyláciu17–19. Transkripčný faktor NF-κB vstupuje do jadra a podporuje produkciu zápalových cytokínov20. Keď TLR7/9 rozpozná vírus, komplex MyD88- IRAKs-TRAF6 prenáša signály do regulačného faktora IFN (IRF) 7, podporuje ubikvitináciu IRF7 a aktivuje jeho fosforyláciu do jadra21,22. V signálnej dráhe RLR aktivujú RIG I a gén 5 spojený s diferenciáciou melanómu (MDA5) mitochondriálny antivírusový signálny proteín (MAVS)23,24. Agregácia MAVS je dôležitou črtou začiatku prenosu RLR signálu23,25,26. TRAF2/3/6 sú prvé faktory aktivované MAVS27,28. TRAF3 aktivuje signalizáciu TBK1-IRF3 a komplex MAVS-TRAF6 aktivuje signalizáciu NF-κB, ktorá podporuje expresiu IFN-127,29.
cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému
Molekulárny mechanizmus aktivácie TRAF6 už bol demonštrovaný. TRAF6 vo forme diméru podlieha autoubikvitinácii za katalýzy Ubc13 a Uev1A, ktorá súvisí s doménou Ring finger a ZF finger doménou. Model TRAF6/Ubc13~UB potvrdzuje dôležitú úlohu diméru TRAF6 pri agregácii a prenose ubikvitínového reťazca K6330. Okrem toho sa uvádza, že doména prstencových prstov a ZF prstov získava konjugáty E2~ub v kryštálovom modeli zebrafish TRAF6 a zistilo sa, že TRAF6 by mohol po prvýkrát tvoriť heterodimér s TRAF5 z rovnakej rodiny TRAF16. Proteíny deubikvitinačnej rodiny: A20, CYLD, USP2a, USP4 a USP20 sa zameriavajú na TRAF6, aby sa odstránila ubikvitinácia spojená s K63- a znížila sa následná signalizácia31–35. Kvasinkový dvojhybridný systém odhaľuje interakciu medzi UBE2O a TRAF6 a potvrdzuje, že táto interakcia priamo ovplyvňuje aktiváciu TRAF6 pomocou MyD8836. V následnom procese prenosu signálu TRAF6 ECSIT ako medziproduktový proteín interaguje s TRAF6 a TAK1 a táto interakcia posilňuje väzbu TRAF6 a TAK137. Pri signalizácii TLR4 indukovanej LPS PRDX bránia TRAF6 získavať ECSIT na dodanie ubikvitínového reťazca K63 a tiež inhibovať BECN1 aktivovaný TRAF6 v autofágovej dráhe38. MST4 aktivuje fosforyláciu TRAF6 na Thr463 a Thr486 a inhibuje dimerizáciu a ubikvitináciu TRAF639. U cicavcov bol mechanizmus regulácie proteínov TRAF6 široko študovaný v antibakteriálnej a antivírusovej imunite. Menej študovaný je však výskum TRAF6 u nižších stavovcov. Imunitná odpoveď u rýb teleost sa spolieha hlavne na dráhy TLR a RLR na vykonanie imunitnej odpovede po infekcii patogénom. Preto je kľúčové preskúmať regulačný mechanizmus signálnych dráh sprostredkovaných TRAF{47}}. calpain2 (m-calpain) je rodina proteáz závislých od vápnika, ktorá sa skladá z viac ako 16 členov u cicavcov a mnohých ďalších organizmov40. Najstaršia štúdia rodiny proteínov calpain súvisí s pohybom buniek41. calpain podporuje migráciu buniek a zistilo sa, že inhibuje migráciu neutrofilov a aktiváciu p38 MAPK a ERK MAPK42. Aktivita hydrolázy je jednou z dôležitých funkcií calpaínu. V imunitnej regulácii calpain{56}} podporuje uvoľňovanie NF-κB hydrolýzou IkB a aktivuje signálnu dráhu43. V tejto štúdii sme zistili, že calpain2a interaguje s TRAF6 a pôsobí ako negatívny regulátor v antibakteriálnych a antivírusových reakciách u teleost rýb, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpain2a podporuje degradáciu hladiny proteínu TRAF6 prostredníctvom svojej hydrolázovej aktivity. Medzitým mutantný calpain2a, ktorému chýba hydrolázová aktivita, inhibuje tvorbu ubikvitínového reťazca K63 inhibíciou diméru TRAF6. Ukazuje sa, že calpain2a aj mutantný calpain2a ukončujú ubikvitináciu TRAF6 na ECSIT / BENC1 / IRF3 / IRF7. calpain2a zastavuje proces signalizácie NF-KB a IFN zacielením na TRAF6. Naše výsledky poskytujú molekulu na štúdium imunitnej regulácie6-sprostredkovanej TRAF u nižších stavovcov.
Výsledky
calpain2a interaguje s TRAF6 a negatívne reguluje signalizáciu NF-KB.
Aby sme získali prehľad o proteínoch spojených s TRAF{0}} v reakcii vrodenej imunity u teleost rýb, charakterizovali sme interaktóm miiuy croaker TRAF6 pomocou afinitnej purifikácie a hmotnostnej spektrometrie. Zoradené podľa intenzity kvantifikácie bez označenia (LFQ) sme časť údajov zachytili a zobrazili (obr. 1a). Spomedzi proteínov spojených s TRAF6- môže calpain2a regulovať aktivitu TRAF6 a ovplyvňovať signálne dráhy sprostredkované TRAF6-. Najprv by sa mal preskúmať vzťah medzi calpain2a a TRAF6 na proteínovej úrovni, skontrolovali sme interakciu calpain2a s TRAF6 v bunkových líniách Miiuy croaker obličky (MKC). Endogénne koimunoprecipitačné experimenty ukázali, že calpain2a interaguje s TRAF6 (obr. 1b, c). Ako ukázali experimenty prechodnej transfekcie a koimunoprecipitácie, nadmerne exprimovaný calpain2a a TRAF6 vzájomne interagovali (obr. 1d, e). Všetky z nich naznačujú, že calpain2a interaguje s TRAF6 a na preskúmanie mechanizmu ich účinku sú potrebné ďalšie experimenty. Viacnásobným sekvenčným zoradením proteínov človeka, myši, zebričky a proteínu calpain2a môže byť calpain2a evolučne konzervovaný medzi rybami a cicavcami (obr. 1f). Aby sme určili funkciu calpain2a vo vrodenej imunite, skúmali sme, či calpain2a bol spojený s aktiváciou NF-KB indukovanou stimuláciou LPS. Transfekovali sme bunky epithelioma papulosum cyprinid (EPC) reportérom luciferázy NF-KB, reportérom internej kontroly renilovej luciferázy a vektorom kódujúcim calpain2a alebo prázdny vektor. calpain2a podstatne znížil aktivitu reportéra NF-KB po stimulácii LPS spôsobom závislým od dávky (obr. 1g). Navyše, prozápalové cytokíny, ako je IL-1 a IL{33}} promótor reagujúci na LPS stimuláciu, boli výrazne znížené v calpain2a-overexprimovaných EPC bunkách (obr. 1h, i), čo naznačuje potenciálnu úlohu calpain2a v zápalovej signalizácii dráh indukovaných LPS stimuláciou.
cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému
Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity
【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Negatívna regulácia LPS-indukovanej NF-KB signalizácie pomocou calpain2a.
Aby sme preskúmali potenciálnu úlohu calpain2a v signalizácii NF-KB, transfekovali sme calpain2a v MKC s časovým gradientom LPS a hodnotili sme prozápalové cytokíny reagujúce na LPS. Nadmerná expresia calpain2a viedla k zníženiu expresie IL-1, IL-8 a IL-6 (obr. 2a). Ďalej sme navrhli dve malé interferujúce RNA špecifické pre calpain2a (siRNA), ktoré účinne downregulovali calpain2a (obr. 2b, d). Knockdown calpain2a významne zvýšil LPS-indukované prozápalové cytokíny vrátane IL-1 a IL-8 v MKC a Miiuy croaker črevných bunkových líniách (MIC) (obr. 2c, e). V skupine buniek stimulovaných LPS, knockdown calpain2a zvýšil bunkovú proliferáciu. Podobne v neprítomnosti akejkoľvek stimulácie sme zistili, že knockdown calpain2a tiež zvýšil bunkovú proliferáciu (obr. 2f). Aby sa určilo, či calpain2a inhiboval proteíny v LPS-indukovanej NF-KB signalizácii, calpain2a výrazne inhiboval hladinu endogénneho proteínu TRAF6, ale nie MyD88, IRAK4 alebo TAK1 (obr. 2g). Stručne povedané, kinetika expresie calpain2a a prozápalového cytokínu naznačuje funkčné zapojenie calpain2a do signalizácie NF-KB indukovanej LPS.
Obr. 1 calpain2a interaguje s TRAF6 a inhibuje NF-KB signálnu dráhu. zoznam interakcií TRAF6 na základe intenzity kvantifikácie bez označenia (časť). b, c MKC bunky nasadené do 6 cm2 misiek. Po 24 hodinách boli bunkové lyzáty imunoprecipitované (IP) s anti-TRAF6 alebo anti-calpain2a afinitnými gélmi. Potom sa imunoprecipitáty a bunkové lyzáty analyzovali pomocou IB s anti-TRAF6 a anti-calpain2a Abs. d, e HEK 293 bunky nasadené do 6 cm2 misiek boli transfekované plazmidmi calpain2a-Flag a TRAF6-Myc (2 ug každý). Po 24 hodinách boli bunkové lyzáty imunoprecipitované (IP) s afinitnými gélmi anti-Myc d alebo anti-Flage. Potom sa imunoprecipitáty a bunkové lyzáty analyzovali pomocou IB s anti-Myc a anti-Flag Abs. f Rovnaké aminokyseliny medzi ľudským calpain2a (Hu-calpain2), myším calpain2a (Mu-calpain2), zebričkou calpain2a (ZF-calpain2a) a miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) sú zvýraznené čiernym pozadím. g–I EPC bunky boli transfekované calpain2a-Flag alebo prázdnym vektorom spolu s luciferázovými reportérmi NF-κB, IL-1 a IL-8. 24 hodín po transfekcii boli bunky neošetrené (Mock) alebo ošetrené LPS počas 6 hodín. Hodnota aktivity luciferázy sa dosiahla oproti aktivite luciferázy Renilla (n=3 na skupinu). Analýza Western blot sa použila na meranie expresie prechodne transfekovaného calpain2a Flag. Expresia tubulínu sa použila ako kontrola nanášania. Dáta sa analyzovali pomocou dvojcestnej ANOVA (g, h, i). **p < 0.01. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch.
Interakcia calpainu2a s TRAF6.
Doménová analýza sa uskutočnila pomocou databázy Conserved Domain Database (CDD) NCBI. calpain2a obsahuje tri domény: cysteínovú proteázovú (CysPc) doménu rodiny Calpain (aa 46-339), centrálnu doménu III veľkej podjednotky Calpainu (aa 360-499) a C-terminálnu ručnú doménu Penta-EF ( aa 500-697). Aby sme určili, ktoré domény calpain2a boli potrebné na interakciu s TRAF6, vytvorili sme tri skrátené mutanty: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) a calpain (500-697) (obr. 3a). Bunky HEK293 boli transfekované calpain2a-Flag divokého typu (WT), skrátenými mutantmi calpain2a-Flag alebo TRAF6-HA vektorom. Zistili sme, že calpain2a v plnej dĺžke a tri skrátené mutanty by mohli interagovať s TRAF6 (obr. 3c). TRAF6 sa skladá z C-terminálnej TRAF domény, coiled-coil domény, domény zinkových prstov a prstencovej domény38. Aby sme preskúmali, ktoré domény TRAF6 boli potrebné na interakciu s calpain2a, vytvorili sme sériu skrátených mutantov TRAF6 vrátane TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36 }}) a TRAF6 (400-574). Medzitým sme vytvorili doménové mutanty: TRAF6ΔRing (v ktorom je vymazaná doména Ring finger), TRAF6ΔZF (v ktorom je vymazaná doména zinkových prstov), TRAF6ΔCC (v ktorom je vymazaná coiled-coil doména) a TRAF6ΔTRAF-C ( v ktorej je C-koncová TRAF doména deletovaná) (obr. 3b). calpain2a interagoval s plnou dĺžkou TRAF6, ako aj skráteniami TRAF6, ktoré obsahovali C-koncovú doménu TRAF, doménu coiled-coil, doménu zinkových prstov (obr. 3d, f), ale nie s doménou prstencového prsta (obr. 3e) . Luciferázové testy ukázali, že nadmerná expresia calpain2a a týchto skrátených mutantov významne inhibovala NF-KB a IL-1 reportérovú aktivitu v EPC bunkách (obr. 3h). Ďalej sa skúmali subcelulárne kolokalizácie calpain2a s TRAF6. Bunky EPC sme transfekovali TRAF6-GFP a prázdnym vektorom alebo calpain2a-mCherry. Analýza konfokálnou mikroskopiou preukázala, že zelené signály TRAF6 sa prekrývajú s červenými signálmi calpain2a, čo naznačuje, že calpain2a sa lokalizuje spolu s TRAF6 v bunkách EPC (obr. 3i, j). Tieto údaje naznačujú, že štrukturálny základ viacerých domén TRAF6 (C-terminálna doména TRAF, doména coiled-coil, doména zinkových prstov), ale nie doména Ring finger, je určujúci pre jej spojenie s calpain2a (obr. 3g).
Obr. 2 calpain2a negatívny reguluje LPS-indukovanú NF-KB signálnu dráhu. IL-1 , IL-8 a IL -6 mRNA v MKC transdukované calpain2a-Flag alebo prázdnym vektorom a ošetrené fyziologickým roztokom (0) alebo vystavené LPS na rôzne krát (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 na skupinu). b, d Bunky MKC a bunky MIC boli transfekované si-calpain2a #1 a si-calpain2a #2 (100 nM) alebo si-ctrl (100 nM). 48 hodín po transfekcii sa merala expresia calpain2a pomocou qRT PCR (n=3 na skupinu). Hladina proteínu calpain2a bola stanovená Western blotovaním. c, e IL-1, IL-8 mRNA v MKC a MIC stabilne transdukované si-calpainom2a #1 alebo si-ctrl (kontrolný vektor) a ošetrené fyziologickým roztokom (0) alebo vystavené LPS na rôzne krát (4 h, 8 h) (n=3 na skupinu). f MKC bunky boli transfekované buď si-ctrl alebo si-calpain2a #1. 36 hodín po transfekcii sa bunky stimulovali LPS počas 12 hodín, potom sa meral test bunkovej proliferácie (n=3 na skupinu). Mierka, 100 μm. g calpain2a-Flag sa transfekovalo do MKC buniek, ktoré boli vystavené LPS v rôznych časoch (3 h, 6 h, 9 h). Imunoblotová analýza bunkových lyzátov s uvedenými Abs. Relatívna hladina mRNA bola normalizovaná na expresiu génu kódujúceho -aktín v každej vzorke. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch. Dáta sa analyzovali dvojcestnou ANOVA (a, c, e, f) alebo jednosmernou ANOVA (b, d). *p < 0,05, **p < 0,01.
Obr. 3 Interakcia calpain2a s TRAF6. a, b V tejto štúdii boli použité schematické diagramy organizácie domén v miiuy croaker calpain2a, TRAF6 a mutantoch. "+" predstavuje interakciu s TRAF6 alebo calpain2a, "-" znamená žiadnu interakciu. c Bunky HEK293 boli transfekované falošnými, calpain2a-Flag divokého typu (WT) a calpain2a-Flag skrátenými mutantmi alebo TRAF6-HA, ako je uvedené. 24 hodín po transfekcii sa transfekované bunky extrahovali a bunkové lyzáty sa podrobili imunoprecipitácii s anti-HA protilátkou a následne IB s použitím anti-HA alebo anti-Flag protilátky. Bunky d–f HEK293 boli transfekované falošnými, TRAF6-HA divokého typu (WT) a TRAF6-HA skrátenými mutantmi alebo calpain2a-Flag, ako je uvedené. 24 hodín po transfekcii sa transfekované bunky extrahovali a bunkové lyzáty sa podrobili imunoprecipitácii s anti-HA protilátkou d, f alebo anti-Flag protilátkou e nasledovanou IB s použitím anti-HA alebo anti-Flag protilátky. g Miesto interakcie TRAF6 a calpain2a. h EPC bunky boli transfekované TRAF6-HA, skrátenými mutantmi calpain2a-Flag alebo calpain2a-Flag spolu s reportérmi luciferázy NF-KB a IL-1. Po 36 hodinách po transfekcii sa hodnota aktivity luciferázy dosiahla oproti aktivite luciferázy renilla (n=3 na skupinu). Bunky Ij EPC boli transfekované falošnými, calpain2a-mCherry a TRAF6-GFP. Jadrá zafarbené DAPI sú znázornené modrou farbou. calpain2a sa detegoval červenou fluorescenciou a TRAF6 sa detegoval zelenou fluorescenciou. Mierka, 10 μm. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch. Dáta boli analyzované jednosmernou ANOVA (h). **p < 0,01.
calpain2a inhibuje hladinu expresie proteínu TRAF6 proteolytickou aktivitou.
Aby sme preskúmali regulačný mechanizmus calpain2a na TRAF6, najprv sme skúmali, či calpain2a mal vplyv na TRAF6 na úrovni proteínu. calpain2a-Myc a TRAF6-Flag boli kotransfekované do EPC buniek, hladina proteínu TRAF6 bola čiastočne degradovaná po 30 hodinách (obr. 4a). Ako je znázornené na obr. 4b, calpain2a podporoval degradáciu TRAF6 spôsobom závislým od dávky. V prítomnosti calpain2a to neovplyvnilo hladinu mRNA TRAF6, čo naznačuje, že calpain2a ovplyvňuje iba hladinu proteínu TRAF6. Test inhibítora cykloheximidu (CHX) medzitým preukázal, že calpain2a môže urýchliť polčas rozpadu proteínu TRAF6 (obr. 4c). Nadmerná expresia calpain2a v MKC bunkách viedla k destabilizácii endogénneho TRAF6 (obr. 4d). Aby sa zistilo, či degradácia TRAF6 sprostredkovaná calpain2a bola závislá od ubikvitín-proteazómu, autofagozómu, lyzozomálnych dráh alebo iných, bunky EPC boli ošetrené činidlami, ktoré inhibovali tieto dráhy: MG132, 3-MA a NH4Cl. Avšak destabilizáciu TRAF6 sprostredkovanú calpainom2a nezvrátil proteazomálny inhibítor MG132, autofagický inhibítor 3-MA alebo lyzozomálny inhibítor NH4Cl (obr. 4e). Ďalej boli bunky EPC ošetrené činidlami: E-64 (inhibítor calpainu, ktorý inaktivuje aktivitu hydrolázy calpainu) a PMSF (nešpecifický inhibítor serínovej proteázy). Zistili sme, že inhibítor calpainu E-64 zabraňuje degradácii na úrovni proteínu TRAF6 (obr. 4f). Ako je znázornené na obr. 4g, E-64 tiež zvrátil degradáciu hladín endogénneho TRAF6 proteínu calpaínom2a.
Obr. 4 calpain2a inhibuje expresiu TRAF6 proteínu. a Experiment s časovým gradientom prázdnych vektorov alebo plazmidov calpain2a-Myc spolu s TRAF6- Flag sa uskutočnil v bunkách EPC. Bunkové lyzáty boli podrobené IB s anti-Myc, anti-Flag a anti-tubulínovými Abs. RNA bola extrahovaná z buniek a reverzne transkribovaná a potom boli TRAF6 a aktín amplifikované pomocou PCR primerov. b Bunky EPC sa naočkovali na 12-jamkové platne cez noc a kotransfekovali sa s TRAF6-Flag a calpain2a-Myc (0.3, 0.6 alebo {6- 18}},9 ug) počas 48 hodín. Expresia TRAF6-Flag a calpain2a-Myc proteínov bola detegovaná pomocou Western blottingu. RNA bola extrahovaná z buniek a reverzne transkribovaná, potom boli TRAF6 a aktín amplifikované pomocou PCR primerov. c calpain2a-Myc alebo prázdne vektory boli kotransfekované TRAF6-Flag do EPC buniek. 36 hodín po transfekcii boli transfekované bunky ošetrené cykloheximidom (CHX) počas 2 alebo 4 hodín. d MKC bunky boli transfekované calpain2a-Flag alebo prázdnymi vektormi. 48 hodín po transfekcii boli bunkové lyzáty podrobené IB s anti-TRAF6, anti-Flag a anti-tubulínovými Abs. e, f EPC bunky boli transfekované uvedenými plazmidmi v prítomnosti alebo neprítomnosti MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 alebo 75 μM) alebo PMSF počas 6 h pred vykonaním imunoblotovej analýzy. g MKC buniek sa transfekovalo calpain2a-Flag v prítomnosti alebo neprítomnosti E{{50}} (50 alebo 75 uM) počas 6 hodín pred uskutočnením imunoblotovej analýzy. h calpain2a-Flag a calpain2a-ACysPc-Flag boli kotransfekované s TRAF6-HA do EPC buniek. 48 hodín po transfekcii boli bunkové lyzáty podrobené IB s uvedenými Abs. I calpain2a-Flag a calpain2a-ACysPc-Flag boli kotransfekované do MKC buniek. 48 hodín po transfekcii boli bunkové lyzáty podrobené IB s anti-TRAF6, anti-Flag a anti-tubulínovými Abs. j IL-1 , IL-8 mRNA v MKC stabilne transdukovaná calpain2a-Flag a calpain2a-ΔCysPc-Flag a liečená fyziologickým roztokom (0) alebo infikovaná LPS počas 4 hodín (n=3 za skupinu). Relatívna hladina mRNA bola normalizovaná na expresiu génu kódujúceho -aktín v každej vzorke. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch. Dáta sa analyzovali pomocou dvojcestnej ANOVA (j). **p < 0,01.
Aby sa určilo, či degradácia TRAF6 bola závislá od hydrolázovej aktivity calpain2a. S využitím predchádzajúcich štrukturálnych a biochemických štúdií calpain2a u cicavcov sme mutovali cysteínové, histidínové a asparagínové zvyšky calpain2a na alanín (calpain2a C105A, H262A, N286A a 3 A), ktorý stratil koordináciu katalytickej triády44–46. Zistili sme, že degradácia TRAF6 nebola ovplyvnená touto mutáciou (doplnkový obrázok 1a). Takže sme zmutovali proteázovú doménu, čo je cysteínová proteázová (CysPc) doména rodiny Calpain calpain2a (označená ako calpain2a-ACysPc). Ani nadmerne exprimovaný TRAF6, ani endogénny TRAF6 nie je ovplyvnený calpain2a-ACysPc (obr. 4h, i). Avšak prozápalové cytokíny IL-1 a IL-8 sú súčasne ovplyvnené divokým typom alebo mutovaným calpainom2a po stimulácii LPS (obr. 4j). Mutantný calpain2a bez hydrolázovej aktivity neovplyvňuje hladinu proteínu TRAF6, ale mutantný calpain2a bez hydrolázovej aktivity stále ovplyvňuje expresiu downstream prozápalových cytokínov. To spustilo naše skúmanie potenciálnych mechanizmov, ktorými calpain2a reguluje TRAF6. Celkovo tieto výsledky odhaľujú, že calpain2a reguluje signalizáciu NF-KB potlačením expresie hladín proteínu TRAF6 prostredníctvom svojej aktivity calpain hydrolázy.
calpain2a inhibuje aktivitu ubikvitín-ligázy TRAF6.
Ďalej sme skúmali molekulárne mechanizmy, ktorými calpain2a negatívne reguluje TRAF6-aktivovanú NF-kB signalizáciu, a či interakcia calpain2a s TRAF6 pri strate enzymatickej aktivity moduluje jeho aktivitu ubikvitín ligázy. Bunky MKC sme ošetrili LPS a potom imunoprecipitovali TRAF6. Ubikvitinačný test s purifikovanými rekombinantnými proteínmi potvrdil, že calpain2a a calpain2a-ACysPc znížili ubikvitináciu TRAF6 (obr. 5a). Ako je znázornené na obr. 5b, c, calpain2a aj calpain2a-ACysPc významne redukovali WT a K63 ubikvitinované proteíny TRAF6. Koncentračné gradienty calpain2a a calpain2a-ACysPc redukovali WT a K63 ubikvitinované proteíny TRAF6 spôsobom závislým od dávky. calpain2a-ACysPc stále bránil agregácii ubikvitínového reťazca K63 TRAF6 bez ovplyvnenia hladiny proteínu TRAF6 (obr. 5d, e). Potom sme transfekovali bunky MKC, aby sme exprimovali TRAF6 označeného Myc v prítomnosti alebo neprítomnosti calpain2a-ACysPc označeného Flag, potom sme vykonali imunoprecipitačné experimenty s protilátkou anti-Myc a analyzovali pomocou imunoblotu s anti-UB. Takáto ubikvitinácia TRAF6 bola podstatne zoslabená calpain2a-ACysPc (obr. 5f). Stimulovaný LPS, TRAF6 dodáva K63-ubikvitínový reťazec spojený s TAK1, ktorý stimuluje autofosforyláciu TAK1 a aktivuje NF-κB18. Ubikvitínové proteíny WT a K63 TAK1 boli významne zvýšené v prítomnosti TRAF6, zatiaľ čo ubikvitinácia spojená s TAK1- bola inhibovaná v prítomnosti calpain2a-ACysPc (obr. 5g, h). Tieto údaje podporujú, že mutantný calpain2a, ktorému chýba hydrolázová aktivita, podobne inhibuje aktivitu ubikvitín ligázy TRAF6 bez ovplyvnenia hladín proteínu TRAF6.
Výhody cistanche tubulosa-posilnenie imunitného systému
calpain2a inhibuje homo-oligomerizáciu TRAF6.
Lys63 ubikvitínový reťazec syntetizovaný TRAF6 hrá kľúčovú úlohu v signálnej transdukcii. Uvádza sa, že dimerizácia TRAF6 je nevyhnutná pre syntézu jeho ubikvitínového reťazca16. Dimerizačný model úzko súvisí s kombináciou Ubc13 na vytvorenie ubikvitinácie K6316,30. Na overenie, či ryby TRAF6 môžu tvoriť diméry, sme použili plazmidy TRAF6 s rôznymi značkami: TRAF6 označený Myc a TRAF6 označený HA pre experimenty s ko-IP. IP test sa uskutočnil s použitím anti-HA protilátky, HATRAF6 interagoval s Myc-TRAF6 (obr. 6a). Aby sa preskúmal inhibičný účinok calpain2a v interakcii s dimérom TRAF{21}}, calpain2a označený Flag, TRAF6 označený HA a TRAF6 označený Myc boli prechodne exprimované do buniek HEK293. Ako sa očakávalo, interakcia TRAF6-diméru bola znížená v prítomnosti calpainu2a (obr. 6b). Zároveň, aby sa predišlo prítomnosti degradácie TRAF6 calpainom2a. Transfekovali sme calpain2a-ACysPc označený Flag a zistili sme, že interakcia TRAF6-diméru sa postupne znižovala v prítomnosti calpain2a-ΔCysPc (obr. 6c). Ako je znázornené na obr. 6d, e, zistili sme HA-TRAF6 zosilnenú WT a K63 ubikvitináciu Myc-TRAF6. Zatiaľ čo bunky HEK293 boli kotransfekované s calpain2a a calpain2a-ACysPc, zvýšená ubikvitinácia by bola potlačená. Tieto výsledky naznačujú, že calpain2a divokého typu aj mutantný calpain2a bez hydrolázovej aktivity inhibujú homooligomerizáciu a autoubikvitináciu TRAF6.
calpain2a inhibuje dodávanie ubikvitinácie TRAF6 do ECSIT a BECN1.
Ako je znázornené na obr. 5d, zistili sme, že calpain2a interferuje s procesom ubikvitylácie z TRAF6 na TAK1. Uvádza sa, že ECSIT pôsobil ako adaptorový proteín TAK1 a TRAF6 na podporu signalizácie NF-KB stimuláciou LPS37. Aby sme overili, či má ECSIT uvedené funkcie v teleostových rybách, vykonali sme viacnásobné zarovnanie sekvencií proteínov ECSIT u ľudí, myší a sýkorovcov (doplnkový obrázok 1b). Transfekovali sme EPC bunky reportérom luciferázy NF-KB, ECSIT významne zvýšil aktivitu reportéra NF-KB po stimulácii LPS (doplnkový obrázok 1c). Nadmerná expresia ECSIT v MKC bunkách viedla k upregulácii hladiny mRNA TNF- (doplnkový obrázok 1d). Po transfekovaní rýb ECSIT a TRAF6 v bunkách HEK293 sme zistili, že TRAF6 interagoval s ECIST (obr. 7a). Podobne ECSIT a TAK1 boli kotransfekované a tieto dva proteíny si tiež zachovali interakciu (obr. 7b). Následne, aby sme overili, či calpain2a-ΔCysPc inhibuje tvorbu komplexu TRAF6-ECSIT, transfekovali sme tieto tri plazmidy do buniek HEK293 a zistili sme, že calpain2a-ΔCysPc zabraňuje komplexu TRAF6-ECSIT (obr. 7c ). Overiť prenosový proces ubikvitínového reťazca v NF-KB signalizácii. Ako je znázornené na obr. 7d, TRAF6 by mohol podporovať ubikvitináciu ECSIT; ako sa očakávalo, calpain2a-ACysPc inhiboval proces, ktorým TRAF6 prenášal ubikvitínový reťazec do ECSIT. BECN1 je dôležitým proteínom v autofágii indukovanej LPS. Potvrdilo sa, že ubikvitinácia K63 by mohla modifikovať a aktivovať BECN1. Deubikvitinačný enzým A20 odstraňuje ubikvitináciu BECN1 a inhibuje autofágiu spôsobenú LPS a TRAF6 je E3 ligáza zodpovedná za ubikvitináciu BECN1 v tomto signáli47. Ako je znázornené na obr. 7e, TRAF6 interagoval s BECN1 a podporoval ubikvitináciu BECN1. Potom sme transfekovali BECN1, TRAF6, calpain2a a calpain2a-ACysPc do buniek HEK293, TRAF6 podporil ubikvitináciu BECN1. calpain2a-ACysPc inhiboval proces, ktorým TRAF6 prenášal ubikvitínový reťazec na BECN1 (obr. 7f). Tieto výsledky naznačujú, že calpain2a divokého typu a mutantný calpain2a bez hydrolázovej aktivity inhibujú ubikvitinačnú schopnosť TRAF6 v autofágii indukovanej LPS a signalizácii NF-KB.
Negatívna regulácia antivírusovej odpovede calpaínom2a.
V dráhe RLR pôsobí TRAF6 ako E3 ligáza získaná pomocou MAVS na aktiváciu NF-KB, produkciu IFN a cytokínov. Ďalej sme skúmali, či calpain2a zohral úlohu pri prevencii TRAF6 v antivírusovom procese sprostredkovanom IFN. V bunkách EPC sa exprimovali luciferázové reportéry riadené promótorom IFN-1, ISRE a IRF3. Zistili sme, že calpain2a podstatne znížil tieto luciferázové aktivity riadené promótorom spôsobom závislým od dávky po stimulácii Ploy (I: C) a infekcii Siniperca cheats rabdovirus (SCRV) (obr. 8a, b). Knockdown calpain2a významne zvýšil Ploy (I: C) a expresiu génu spustenú SCRV vrátane Viperinu, Mx1 a ISG15 (obr. 8c, d). Knockdown calpain2a viedol k vyššej expresii bunkovej životaschopnosti po infekcii SCRV v MKC bunkách (obr. 8e). Ako je znázornené na obr. 8f, testy bunkovej proliferácie odhalili, že knockdown calpain2a zvýšil bunkovú proliferáciu po infekcii SCRV. Nadmerná expresia calpain2a ostro podporovala propagáciu vírusu, čo sa odráža vo vírusovej replikácii po infekcii SCRV (obr. 8g). calpain2a a calpain2a-ACysPc podstatne znížili reportéry luciferázy riadené promótorom IFN-1, ISRE a IRF3 po stimulácii Ploy (I:C) a infekcii SCRV (doplnkový obrázok 2a, b). Tieto výsledky naznačujú, že calpain2a môže negatívne regulovať signálnu dráhu RLR prostredníctvom inhibície TRAF6, čím inhibuje aktiváciu IFN.
Obr. 5 calpain2a inhibuje aktivitu ubikvitín-ligázy TRAF6. a Ubikvitinácia endogénneho TRAF6 v MKC bunkách transdukovaných calpain2a-Flag a calpain2a-ACysPc-Flag a neinfikovaná (-) alebo vystavená LPS (+), hodnotená imunoblotovou analýzou s anti-ubikvitínom po imunoprecipitácii s anti-TRAF6 a vstupnou imunoblotovou analýzou s uvedeným Abs. b, c Bunky HEK293 boli kotransfekované s TRAF6-HA a WT-ubikvitín-His alebo K630 ubikvitín-His (v ktorom sa uchováva iba lyzín 63) spolu s calpain2a-Flag, calpain2a-ACysPc-Flag alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. d, e bunky HEK293 boli kotransfekované s TRAF{{30}}HA a WT-ubikvitín-His alebo K63O-ubikvitín-His (v ktorom sa uchováva iba lyzín 63) spolu s calpain2a-Flag ({{45 }},5 ug, 1 ug), calpain2a-ACysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) alebo prázdny vektor. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. f Ubikvitinácia nadmerne exprimovaného TRAF6 v MKC bunkách transdukovaných calpain2a-ACysPc-Flag, hodnotená imunoblotovou analýzou s anti-ubikvitínom po imunoprecipitácii s anti-Myc a vstupnou imunoblotovou analýzou s indikovanými Abs. g, h Bunky HEK293 boli kotransfekované s TAK1-Myc, TRAF6-HA a WT-ubiquitin-His alebo K63O-ubiquitin-His (v ktorých je uchovávaný iba lyzín 63) spolu s calpain2a-Flag , calpain2a-ACysPc-Flag alebo prázdny vektor. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. Všetky imunoprecipitáty a vstupná imunoblotová analýza s anti-Myc, anti-Flag, anti-HA a anti-tubulínovými protilátkami. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch.
calpain2a potláča ubikvitináciu IRF3 a IRF7 z TRAF6.
Uvádza sa, že v antivírusovom signáli spúšťanom komplexom MAVS-TRAF3/6 je aktivita TRAF6 nevyhnutná na aktiváciu IRF3 a NF-KB48. Ako je znázornené na obr. 9a, b, TRAF6 podporuje ubikvitináciu IRF3 spojenú s WT a K63- a toto zvýšenie je inhibované expresiou calpain2a-ACysPc. Medzitým, keď vírus spustí signálny signál závislý od TLR, TRAF6 úzko súvisí s IRF7 a podporuje ubikvitináciu IRF7 spolu s aktivovanými antivírusovými faktormi22, 49, 50. TRAF6 podporuje ubikvitináciu IRF7 spojenú s WT a K63- a toto zvýšenie je inhibované expresiou calpain2a-ACysPc (obr. 9c, d). Tieto údaje naznačujú, že divoký typ calpain2a a mutantný calpain2a bez hydrolázovej aktivity inhibujú TRAF6-sprostredkovanú ubikvitináciu IRF3 a IRF7.
Diskusia
TRAF6 je jedným zo siedmich členov rodiny faktorov spojených s receptorom faktora nekrózy nádorov (TNF) (TRAF), ktorý bol identifikovaný ako signálny adaptér a vykonáva signálnu transdukciu51,52. Rodina TRAF obsahuje doménu Ring finger, ktorá vlastní aktivitu E3 ligázy. E3 ligázy s doménou HECT podporujú polyubikvitináciu substrátu a E3 s kruhovou doménou vyžadujú E2~ub na prenos polyubikvitinácie53,54. Potvrdilo sa, že dimér Ub viažuci enzým Ubc13/Uev1A sa podieľa na agregácii TRAF6 polyubikvitinácie16. Kým K124 myšieho TRAF6 je vyradený, TRAF6 stratí aktivitu autoubikvitinácie K63 a mutácia na tomto mieste eliminuje ubikvitináciu TRAF{20}}sprostredkovaného NEMO a aktiváciu TAK1, IKK a NF-κB55 . Je to presné, pretože PRDX1 sa viaže na doménu TRAF6 Ring Finger obsiahnutú v K124 a eliminuje ubikvitináciu TRAF638. Uvádza sa, že ubikvitinácia TRAF6 úzko súvisí s dimerizáciou jeho N-terminálnej domény (doména prstencových prstov a ZF prstov). Viaceré N-terminálne interakčné miesta s Ubc13 boli zmutované a Ubc13 nemohol prenášať polyub na TRAF616. Interakcia medzi mutantmi calpain2a a TRAF6 ukázala, že väčšina domén TRAF6 interagovala s calpain2a, s výnimkou domény Ring finger. V dôsledku interakcie medzi calpain2a a doménou ZF prstov TRAF6 sme špekulovali, že calpain2a môže inhibovať auto-ubikvitináciu blokovaním dimerizácie TRAF6. Následne sme overili interakciu rôznych značiek TRAF6. Keď sa zvýšila expresia mutantného calpain2a bez hydrolázovej aktivity, interakcia rôznych značiek TRAF6 sa oslabila. TRAF6 označený HA podporuje ubikvitináciu TRAF6 označeného Myc a mutantný calpain2a inhibuje ubikvitináciu zosilnenú pomocou TRAF6 označeného HA. Ako medziprodukt v procese prenosu signálu TRAF6-TAK1 sa ECSIT viaže na C-terminálnu doménu TRAF6 (CC doména a TRAF-C doména) a je potvrdené, že sa podieľa na signalizácii NF-KB37. Expresia prozápalových cytokínov sa v ECSITKD THP-1 bunkách znížila. Avšak po nadmernej expresii ECSIT v ECSITKD THP{62}} bunkách sa gény ako IRF7, IL-1 a CD44 významne zvýšili37. PRDX1 sa viaže na Ring finger doménu TRAF6 a inhibuje ubikvitináciu ECSIT a BECN1 v NF-KB a autofágových signáloch inhibíciou tvorby polyubikvitinácie TRAF638. V teleostových rybách sme potvrdili signálnu dráhu NF-KB aktivovanú ECSIT, ktorá interagovala s TRAF6 a TAK1 a prenášala polyubikvitínový reťazec produkovaný TRAF6. calpain2a viazaný na doménu ZF, CC doménu a TRAF-C doménu TRAF6, čo inhibovalo interakciu TRAF6-ECSIT. Potvrdili sme, že mutantný calpain2a bez hydrolázovej aktivity zabránil polyubikvitínovému reťazcu z TRAF6 na ECSIT a BECN1.
Obr. 6 calpain2a tlmí autoubikvitináciu TRAF6. a bunky HEK293 boli transfekované TRAF6-Myc, TRAF6-HA alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované s HA protilátkou. b Bunky HEK293 boli transfekované TRAF6-Myc, TRAF6-HA, prázdnym vektorom alebo calpain2a-Flag. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované s HA protilátkou. c Bunky HEK293 boli transfekované TRAF6-Myc, TRAF6-HA, prázdnym vektorom alebo rôznymi koncentráciami calpain2a-ACysPc-Flag. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované s HA protilátkou. d, e bunky HEK293 boli kotransfekované s TRAF6-Myc, TRAF6-HA a WT-ubiquitin-His alebo K63O-ubiquitin-His (v ktorých je uchovávaný iba lyzín 63) spolu s calpain2a-Flag , calpain2a-ACysPc-Flag alebo prázdny vektor. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. Imunoprecipitáty a vstupná imunoblotová analýza s anti-Myc, anti-Flag, anti-HA a anti-tubulínovými protilátkami. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch.
Obr. 7 calpain2a inhibuje TRAF6-sprostredkovanú ubikvitináciu ECSIT a BECN1. bunky HEK293 boli transfekované ECSIT-Myc, TRAF6-Flag alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované protilátkou Flag. b Bunky HEK293 boli transfekované TAK1-Flag, ECSIT-Myc alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované s protilátkou Myc. c Bunky HEK293 boli transfekované TRAF6-Myc, ECSIT-HA, prázdnym vektorom alebo rôznymi koncentráciami calpain2a-ACysPc-Flag. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované s protilátkou Myc. d Bunky HEK293 boli kotransfekované s ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His spolu s calpain2a-Flag, calpain2a-ACysPc-Flag alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. Bunky HEK293 boli transfekované vektorom BECN1-Flag, TRAF6-Myc alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a IP analyzované s protilátkou Myc. f Bunky HEK293 boli kotransfekované s BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His spolu s calpain2a-Flag, calpain2a-ACysPc-Flag alebo prázdnym vektorom. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. Imunoprecipitáty a vstupy s anti-Myc, anti-Flag, anti-HA a anti-tubulínovými Abs. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch.
Všimli sme si, že calpain2a má hydrolázovú aktivitu ako jednu z rodiny proteáz závislých od vápnika. m-calpain (calpain{3}}) hrá pozitívnu regulačnú úlohu v signálnej dráhe NF-KB pečeňových buniek HepG2. Nezávisle od 26 s proteazómového prístupu calpain2a hydrolyzuje IkB, aby uvoľnil transkripčný faktor NF-KB. Špecifický inhibítor proteínu calpain zabraňuje degradácii IkB 56. Pre calpain však existuje len málo štúdií o vrodenej imunitnej odpovedi rýb. V bunkách MKC nadmerná expresia calpain2a inhibovala NF-KB downstream prozápalové cytokíny indukované LPS. Tento jav bol v rozpore s výsledkami v pečeňových bunkách HepG2. Je možné, že druhová špecifickosť rodiny proteínov calpain spôsobila rôzne účinky. Podobne sme použili špecifický inhibítor calpaínového proteínu E-64, aby sme zabránili calpaínu2a hydrolyzovať TRAF6. Mutantný calpain2a, ktorému chýba hydrolázová aktivita, inhibuje aktivitu ubikvitín ligázy TRAF6 bez ovplyvnenia jej proteínových hladín. Nenašli sme enzýmovo aktívne miesta pre calpain2a. Podľa predchádzajúcich štúdií na cicavcoch sú to tri miesta: cysteínové (C105A), histidínové (H262A) a asparagínové zvyšky (N286A). Naše experimenty však potvrdzujú, že tri aktívne miesta miiuy croaker calpain2a neovplyvňujú expresiu hladín proteínu TRAF6, ale mutantný calpain2a bez hydrolázovej domény áno. Preto sme sa rozhodli zmutovať celú štruktúrnu doménu aktivujúcu enzým. Aj keď je proteín calpain2a u cicavcov a nižších stavovcov relatívne konzervovaný, špecifické miesta enzymatickej aktivity si zaslúžia ďalšie skúmanie.
cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém
V súhrne sme identifikovali calpain2a ako negatívny regulátor LPS-indukovanej NF-KB signalizácie a vírusom indukovanej IFN aktivácie (obr. 9e). V hmotnostnej spektrometrii môže calpain2a interagovať s TRAF6 a tento jav sme demonštrovali experimentom endogénnej koimunoprecipitácie. Zistili sme, že calpain2a sa podieľa na regulácii signálnej dráhy NF-KB indukovanej LPS. Okrem toho hrá TRAF6 tiež dôležitú úlohu v antivírusových signálnych dráhach. Použili sme SCRV a Ploy (I: C) na stimuláciu signálnej dráhy IFN a zistili sme, že calpain2a môže tiež inhibovať signalizáciu IFN reguláciou hladiny proteínu a autoubikvitináciou TRAF6. Pretože TLR3 dokáže rozpoznať štruktúru dvojvláknovej RNA (dsRNA) produkovanú vírusovými infekciami. Viac nás zaujíma objasnenie regulácie calpain2a signálnej dráhy IFN sprostredkovanej TRAF{16}}, ale nevylučujeme potenciálny vzťah medzi signálnou dráhou calpain2a a TLR3. calpain2a podporoval degradáciu TRAF6 hydrolytickým spôsobom a interagoval s TRAF6, aby inhiboval tvorbu dimérov a autoubikvitináciu. Táto inhibícia zabránila interakcii TRAF6 a ECSIT a procesu prenosu ubikvitinácie z TRAF6 do ECSIT, BECN1, IRF3 a IRF7. Naše súčasné výsledky prispejú k pochopeniu negatívnych regulačných mechanizmov zacielením TRAF6 vo vrodených imunitných odpovediach. Okrem toho tento výskum naznačuje kľúčovú úlohu homooligomerizácie a autoubikvitinácie TRAF6 v procese vrodenej imunitnej odpovede rýb. Súčasne sa calpain2a navrhuje ako proteín regulačného mechanizmu na inhibíciu imunitnej odpovede TRAF6 a zabránenie normálnym a usporiadaným signálnym dráham. Tieto poznatky sú užitočné pri pochopení imunológie stavovcov a vývoja imunitného systému stavovcov.
Obr. 8 calpain2a inhibuje SCRV- alebo Poly(I:C)-indukovanú aktiváciu IFN. ab EPC bunky boli transfekované rôznymi koncentráciami calpain2a-Flag alebo prázdneho vektora spolu s IFN-1, ISRE a IRF{7}}pro luciferázovými reportérmi. 24 hodín po transfekcii boli bunky simulovane infikované alebo infikované SCRV alebo Poly(I:C) počas 12 hodín (n=3 na skupinu). Na meranie expresie prechodne transfekovaného calpain2a-Flag sa použila analýza Western blot. Expresia tubulínu sa použila ako kontrola nanášania. c, d Viperín, Mx1, ISG15 mRNA v MKC stabilne transdukovaná si-calpain2a #1 alebo si-ctrl (kontrolný vektor) a ošetrená fyziologickým roztokom (0) alebo stimulovaná SCRV alebo Poly(I: C) pre 24 h. Relatívna hladina mRNA bola normalizovaná na expresiu génu kódujúceho -aktín v každej vzorke (n=3 na skupinu). e, f MKC bunky boli transfekované buď si-ctrl alebo si-calpain2a #1. 24 hodín po transfekcii sa bunky stimulovali SCRV počas 24 hodín, potom sa meral test životaschopnosti buniek a test bunkovej proliferácie (n=3 na skupinu). Mierka, 100 μm. g MKC buniek sa transfekovalo s calpain2a-Flag alebo pcDNA3.1, potom sa infikovalo SCRV počas 24 hodín (n=3 na skupinu). Analýza qRT-PCR sa uskutočnila pre intracelulárnu a supernatantnú expresiu SCRV RNA. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch. Dáta sa analyzovali jednosmernou ANOVA (a, b), dvojcestnou ANOVA (c, d, e, f) alebo dvojstranným Studentovým t-testom (g). *p < 0,05, **p < 0,01.
Metódy
Bunková kultúra.
Bunkové línie ľudskej embryonálnej obličky (HEK) 293 a bunkové línie Epithelioma papulosum cyprini (EPC) boli zakúpené od American Type Culture Collection a uchovávané v našom laboratóriu. Miiuy croaker (M. miiuy) obličkové bunkové línie (MKC) a Miiuy croaker črevné bunkové línie (MIC) boli kultivované z obličkových a črevných tkanív miiuy croaker57,58. Miiuy croaker obličkové bunkové línie a Miiuy croaker črevné bunkové línie boli kultivované pri 26 stupňoch vo zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 0,5 % CO2 v L-15 médiu (HyClone, USA) doplnenom 15 % FBS (Gibco , USA), 100 U/ml penicilínu (Gibco, USA), 100 ug/ml streptomycínu (Gibco, USA) a 20 U/ml heparínu (Solarbio, Čína). Bunky Epithelioma papulosum cyprini sa pestovali pri 26 stupňoch vo zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 5 % C02 v médiu 199 (Hyclone) doplnenom 10 % FBS, 2 mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu. Bunky 293 ľudských embryonálnych obličiek boli pestované pri 37 stupňoch vo zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 5 % CO2 v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) (Invitrogen) doplnenom 10 % FBS, 2 mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 mg /ml streptomycínu.
Obr. 9 calpain2a inhibuje TRAF6-sprostredkovanú ubikvitináciu IRF7 a IRF3. b Bunky HEK293 boli kotransfekované s IRF3-Myc, TRAF6-HA a WTubiquitin-His alebo K63O-ubiquitin-His (v ktorých sa uchováva iba lyzín 63) spolu s calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Vlajka alebo prázdny vektor. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. c, d Bunky HEK293 boli kotransfekované s IRF7-Myc, TRAF6-HA a WT-ubiquitinHis alebo K63O-ubiquitin-His (v ktorých sa uchováva iba lyzín 63) spolu s calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag alebo prázdny vektor. Po 24 hodinách po transfekcii boli bunky lyzované a purifikované Ni-NTA agarózou. Všetky imunoprecipitáty a vstup s anti-Myc, anti-Flag, anti-HA a anti tubulínovými Abs. Všetky experimenty sa uskutočnili aspoň v troch nezávislých experimentoch. e Model podrobne opisujúci úlohy calpain2a v signálnych dráhach sprostredkovaných TRAF{39}. Po LPS a víruse by sa mohol aktivovať TRAF6, homo-oligomerizácia a autoubikvitinácia. BECN1, ECSIT, IRF7 a IRF3 sú ubikvitinované pomocou TRAF6 a spúšťajú aktiváciu downstream signálov. calpain2a ako negatívny regulátor sa zameriava na TRAF6, aby inhiboval TRAF6-sprostredkované signálne dráhy.
Referencie
1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Rozpoznanie patogénov a vrodená imunita. Cell 124, 783-801 (2006).
2. Takeuchi, O. & Akira, S. Receptory na rozpoznávanie vzorov a zápal. Cela 140, 805-820 (2010).
3. Wu, J. & Chen, ZJ Vrodené imunitné snímanie a signalizácia cytosolových nukleových kyselín. Annu. Rev. Immunol. 32, 461 – 488 (2014).
4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-like receptors. Curr. Biol. 21, R488 – R493 (2011).
5. Schlee, M. Master senzory patogénnej RNA - RIG-I like receptory. Imunobiológia 218, 1322–1335 (2013).
6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR proteíny: integrálne členy vrodenej imunity a mediátory zápalových ochorení. J. Leukoc. Biol. 83, 13-30 (2008).
7. Akira, S. & Hemmi, H. Rozpoznávanie molekulárnych vzorov spojených s patogénom rodinou TLR. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
8. Kawai, T. & Akira, S. Úloha receptorov rozpoznávajúcich vzory vo vrodenej imunite: aktualizácia receptorov podobných Toll. Nat. Immunol. 11, 373-384 (2010).
9. Kawagoe, T. a kol. Sekvenčná kontrola reakcií závislých od Toll-like receptora pomocou IRAK1 a IRAK2. Nat. Immunol. 9, 684-691 (2008).
10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4-zdieľaný aktivátor NF-kappaB vo vrodenej a získanej imunite. Trends Immunol. 27, 566-572 (2006).
11. Kawai, T. & Akira, S. Signalizácia TLR. Cell Death Differ. 13, 816-825 (2006).
12. Deng, L. a kol. Aktivácia komplexu IkappaB kinázy pomocou TRAF6 vyžaduje dimérny komplex enzýmu konjugujúceho ubikvitín a jedinečný polyubikvitínový reťazec. Cell 103, 351-361 (2000).
13. Ninomiya-Tsuji, J. a kol. Kináza TAK1 môže aktivovať NIK-I kappaB, ako aj MAP kinázovú kaskádu v IL-1 signálnej dráhe. Nature 398, 252-256 (1999).
14. Takaesu, G. a kol. TAB2, nový adaptorový proteín, sprostredkováva aktiváciu TAK1 MAPKKK spojením TAK1 s TRAF6 v IL-1 signálnej transdukčnej dráhe. Mol. Bunka. 5, 649-658 (2000).
15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm sprostredkovaná translokácia TRAF6 a TAB2 v interleukínom-1-indukovanej aktivácii NF-kappa BJ Biol. Chem. 276, 41661-41667 (2001).
16. Yin, Q. a kol. E2 interakcia a dimerizácia v kryštálovej štruktúre TRAF6. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 658-666 (2009).
17. Wang, C. a kol. TAK1 je ubikvitín-dependentná kináza MKK a IKK. Nature 412, 346-351 (2001).
18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF Funkcia TAK1 špecifická pre bunkový typ vo vrodenej imunitnej signalizácii. Trends Immunol. 34, 307 – 316 (2013).
19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Neočakávaný zvrat k aktivácii IKKbeta: TAK1 primuje IKKbeta na aktiváciu autofosforyláciou. Biochem. J. 461, 531 – 537 (2014).
20. Emmerich, CH a kol. Aktivácia kanonického komplexu IKK pomocou K63/M1- spojených hybridných ubikvitínových reťazcov. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).
21. Kawai, T. a kol. Indukcia interferónu-alfa prostredníctvom Toll-like receptorov zahŕňa priamu interakciu IRF7 s MyD88 a TRAF6. Nat. Immunol. 5, 1061-1068 (2004).
22. Kitagawa, Y. a kol. Ľudský proteín vírusu parainfluenzy typu 2 V inhibuje TRAF6-sprostredkovanú ubikvitináciu IRF7, aby sa zabránilo indukcii interferónu závislej od TLR7- a TLR9-. J. Virol. 87, 7966 – 7976 (2013).
23. Kawai, T. a kol. IPS-1, adaptér spúšťajúci indukciu interferónu typu I sprostredkovanú RIG-I a Mda5-. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
24. Zust, R. a kol. Ribóza 2'-O-metylácia poskytuje molekulárny podpis na rozlíšenie vlastnej a inej mRNA v závislosti od RNA senzora Mda5. Nat. Immunol. 12, 137 – 143 (2011).
25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ Identifikácia a charakterizácia MAVS, mitochondriálneho antivírusového signálneho proteínu, ktorý aktivuje NF kappaB a IRF 3. Cell 122, 669–682 (2005).
26. Xu, LG a kol. VISA je adaptérový proteín potrebný na vírusom spustenú signalizáciu IFN beta. Mol. Bunka. 19, 727-740 (2005).
27. Yoshida, R. a kol. TRAF6 a MEKK1 hrajú kľúčovú úlohu v antivírusovej dráhe helikázy podobnej RIG-I. J. Biol. Chem. 283, 36211 – 36220 (2008).
28. Liu, S. a kol. MAVS získava viacero ubikvitínových E3 ligáz na aktiváciu antivírusových signalizačných kaskád. Elife 2, e00785 (2013).
29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT Regulácia reakcií interferónu I. typu. Nat. Rev. Immunol. 14, 36 – 49 (2014).
30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Mechanizmus prenosu ubikvitínu podporovaný TRAF6. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).
31. Boone, DL a kol. Enzým A20 modifikujúci ubikvitín je potrebný na ukončenie reakcií Toll-like receptorov. Nat. Immunol. 5, 1052-1060 (2004).
32. Kovalenko, A. a kol. Nádorový supresor CYLD negatívne reguluje signalizáciu NF kapaB deubikvitináciou. Nature 424, 801-805 (2003).
33. He, X. a kol. USP2a negatívne reguluje IL-1beta a vírusom indukovanú aktiváciu NF kappaB deubikvitináciou TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39 – 47 (2013).
34. Xiao, N. a kol. Ubikvitín-špecifická proteáza 4 (USP4) sa zameriava na TRAF2 a TRAF6 na deubikvitináciu a inhibuje migráciu rakovinových buniek indukovanú TNFalfa. Biochem. J. 441, 979-986 (2012).
35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubikvitín-špecifická peptidáza 20 sa zameriava na TRAF6 a vírus ľudskej T bunkovej leukémie typu 1, aby negatívne reguloval signalizáciu NF-kappaB. J. Virol. 85, 6212 – 6219 (2011).
36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O negatívne reguluje TRAF6-sprostredkovanú aktiváciu NF-kappaB inhibíciou polyubikvitinácie TRAF6. Cell Res. 23, 366 – 377 (2013).
37. Wi, SM a kol. Komplex TAK1-ECSIT-TRAF6 hrá kľúčovú úlohu v signáli TLR4 na aktiváciu NF-kappaB. J. Biol. Chem. 289, 35205 – 35214 (2014).
38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Inhibícia aktivity ubikvitín-ligázy TRAF6 pomocou PRDX1 vedie k inhibícii aktivácie NFKB a aktivácii autofágy. Autofágia 14, 1347–1358 (2018).
39. Jiao, S. a kol. Kináza MST4 obmedzuje zápalové reakcie prostredníctvom priamej fosforylácie adaptéra TRAF6. Nat. Immunol. 16, 246 – 257 (2015).
40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 a Calpain-2: Jin a jang synaptickej plasticity a neurodegenerácie. Trendy Neurosci. 39, 235 – 245 (2016).
41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Regulácia migrácie buniek: calpaíny robia rez. J. Cell Sci. 118, 3829-3838 (2005).
42. Katsube, M. a kol. Calpaínom sprostredkovaná regulácia odlišných signálnych dráh a migrácia buniek v ľudských neutrofiloch. J. Leukoc. Biol. 84, 255-263 (2008).
43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Účinky inhibície calpainu na degradáciu IkB alfa po aktivácii PBMC: identifikácia miest štiepenia calpainu. Neurochem. Res. 29, 1443-1451 (2004).
44. Tompa, P. a kol. O sekvenčných determinantoch štiepenia calpaínom. J. Biol. Chem. 279, 20775 – 20785 (2004).
45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Stanovenie špecificity peptidového substrátu pre mu-calpain prístupom založeným na peptidovej knižnici: dôležitosť primárnych vedľajších interakcií. J. Biol. Chem. 280, 40632-40641 (2005).
46. DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpainova predikcia štiepenia pomocou učenia viacerých jadier. PLoS One. 6, e19035 (2011).
47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 a A20 regulujú s lyzínom 63-spojenú ubikvitináciu Beclina-1 na kontrolu autofágie vyvolanej TLR4-. Sci. Signál. 3, ra42 (2010).
48. Loo, YM & Gale, M. Immune Signaling by RIG-I-like Receptors. Imunita 34, 680-692 (2011).
49. Ling, T. a kol. TARBP2 inhibuje aktiváciu IRF7 potlačením TRAF6-sprostredkovanej K63-ubikvitinácie IRF7. Mol. Immunol. 109, 116 – 125 (2019).
50. Zhou, Z. a kol. Zebrafish otud6b negatívne reguluje antivírusové reakcie potlačením K63-viazanej ubikvitinácie irf3 a irf7. J. Immunol. 207, 244 – 256 (2021).
51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Úloha TRAF6 v signálnej transdukcii a imunitnej odpovedi. Mikróby infikujú. 6, 1333-1338 (2004).
52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, molekulárny most preklenujúci adaptívnu imunitu, vrodenú imunitu a osteoimunológiu. Bioessays 25, 1096-1105 (2003).
53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: štruktúry, funkcie, mechanizmy. Biochim. Biophys. Acta. 1695, 55 – 72 (2004).
54. Pickart, CM & Fushman, D. Polyubikvitínové reťazce: polymérne proteínové signály. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 610-616 (2004).
55. Lamothe, B. a kol. Miestne špecifická autoubikvitinácia faktora 6 spojená s receptorom nekrotizujúceho faktora tumoru viazaná na Lys-63- je kritickým determinantom aktivácie I kappa B kinázy. J. Biol. Chem. 282, 4102 – 4112 (2007).
56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tumor nekrotizujúci faktor-alfa-indukovateľná IkappaBalpha proteolýza sprostredkovaná cytosolickým m-calpaínom. Mechanizmus paralelný s ubikvitín-proteazómovou dráhou pre aktiváciu jadrového faktora-kappa B. J. Biol. Chem. 274, 787-794 (1999).
57. Chu, Q. a kol. Vysoko konzervovaná cirkulárna RNA circRasGEF1B zvyšuje antivírusovú imunitu reguláciou dráhy miR-21-3p/MITA u nižších stavovcov. J. Virol. 95, e02145–20 (2021).
58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a indukuje autofágiu, aby blokovala signalizáciu NF-kappaB a apoptózu na uľahčenie infekcie Vibrio harveyi. iScience 26, 106105 (2023).
59. Sepulcre, MP a kol. Evolúcia rozpoznávania a signalizácie lipopolysacharidov (LPS): ryba TLR4 nerozoznáva LPS a negatívne reguluje aktiváciu NF kappaB. J. Immunol. 182, 1836 – 1845 (2009).
60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Dlhá nekódujúca RNA NARL reguluje imunitné reakcie prostredníctvom downregulácie NOD1 sprostredkovanej mikroRNA u teleost rýb. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).
61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular RNA circRNF217 Podporuje vrodenú imunitu a antibakteriálnu aktivitu u teleostových rýb znížením miR-130-3p Funkcia. J. Immunol. 208, 1099 – 1114 (2022).
62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovírusom indukovateľná mikroRNA-210 moduluje antivírusovú vrodenú imunitnú odpoveď prostredníctvom zacielenia STING/MITA u rýb. J. Immunol. 201, 982 – 994 (2018).
63. Bi, D. a kol. Rozpoznanie lipopolysacharidu a aktivácia NF-kappaB cytosolickým senzorom NOD1 v Teleost Fish. Predné. Immunol. 9, 1413 (2018).
64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 a IRF8 regulujú signalizáciu NF-kappaB zacielením na MyD88 v rybách Teleost. Predné. Immunol. 11, 606 (2020).
65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k inhibuje signalizáciu NF-kappaB zacielením na MyD88 na autofagickú degradáciu sprostredkovanú ATG5- u teleost rýb. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).