Proteín-nezávislá úloha fosfátov v progresii chronického ochorenia obličiek

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Irene Faria Duayerová¹ a kol

Abstrakt:K tomu prispieva viacero faktorovrenálnej funkciepokles u pacientov s CKD a úloha obsahu fosfátov v strave je stále predmetom diskusie. Cieľom tejto štúdie je analyzovať mechanizmus, ktorým je fosfát, nezávislý od proteínu, spojený s progresiou CKD. Dospelé potkany Mníchov-Wistar boli podrobené 5/6 nefrektómii (Nx), kŕmené diétou s nízkym obsahom bielkovín a rozdelené do dvoch skupín. Diéty rozlišoval iba obsah fosfátov (nízky obsah fosfátov, LoP, 0,2 percenta; vysoký obsah fosfátov, HiP,0,95 percent). Po šesťdesiatich dňoch sa biochemické parametre aobličkyanalyzovala sa histológia. Skupina HiP vykazovala horšiu funkciu obličiek s vyššími hladinami PTH, FGF-23 a frakčnou exkréciou fosfátov. Pri histologickom rozbore obličkového tkaniva tiež preukázali vyššie percento intersticiálnej fibrózy, expresiu -aktínu, PCNA aobličkovéinfiltrácia makrofágmi. Skupina LoP vykazovala vyššiu expresiu beklinu-1 v bunkách renálnych tubulov, markera autofagického efluxu v porovnaní so skupinou HiP. Naše zistenia zdôrazňujú pôsobenie fosfátu pri indukciiobličkyintersticiálny zápal a fibróza, ktoré prispievajú k progresii ochorenia obličiek. Možný účinok fosfátu na dysreguláciu mechanizmu autofágie obličkových buniek si vyžaduje ďalšie skúmanie pomocou klinických štúdií.

Kľúčové slová:fosfát;diéta; CKDprogresia;obličkovéfibróza; autofágia;apoptóza

Kľúčový príspevok:Mechanizmy ochrany obličiek obmedzením fosfátovej diéty sa ešte musia určiť. V tejto štúdii pôsobilo preťaženie fosfátmi pri progresii CKD aktiváciou zápalových dráh a indukciouobličkyintersticiálna fibróza. Účinok hyperfosfatémie na apoptózu obličkových buniek a autofagického človeka si vyžaduje ďalšie skúmanie.

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

1. Úvod

Chronickýobličkychoroba (CKD) sa považuje za problém verejného zdravia. Jeho prevalencia sa zvyšuje s vekom a pohybuje sa medzi 11 a 13 percentami na celom svete [1]. Hoci je CKD vo všeobecnosti ireverzibilným stavom, na spomalenie progresie ochorenia možno použiť niekoľko prístupov, ako je kontrola krvného tlaku, dyslipidémia a hyperglykémia, použitie inhibítora angiotenzín-konvertujúceho enzýmu a nízkobielkovinová diéta [2–7]. . Spomedzi týchto stratégií je diéta s nízkym obsahom bielkovín najvyšším diskutabilným návrhom na oddialenieobličkyzhoršenie funkcie v dôsledku obáv o jeho súlad, bezpečnosť a účinnosť. Nedostatok konsenzu o výhodách zníženia bielkovín v strave závisí od prekrývajúcej sa úlohy obsahu bielkovín a fosfátov v strave. Keďže zdroje bielkovín sú bohaté na fosfáty, odporúča sa znížiť príjem bielkovín, aby sa dosiahol obmedzený príjem fosfátov. Je možné obmedziť proteín bez obmedzenia fosfátu, hoci opak je ťažký.

V experimentálnych štúdiách účinok nízkoproteínovej diéty chránil modely CKD pred poškodením glomerulov a proteinúriou [8], čím podporoval väčšiu ochranu rýchlosti glomerulárnej filtrácie [9]. Je potrebné poznamenať, že bielkoviny a fosfáty sú vo vysokej korelácii. Preto, aj keď sa niektoré experimentálne štúdie zamerali na vyhodnotenie izolovaného účinku proteínovej reštrikcie, mohli byť tiež skreslené v dôsledku neúmyselnej fosfátovej reštrikcie. Na druhej strane sa jasne preukázal individuálny príspevok stravy bohatej na fosfáty k rozvoju CKD [10,11]. Ukázalo sa, že diéta s vysokým obsahom fosfátov vyvoláva viac intersticiálnych stavovobličkyfibróza a tubulárna atrofia s minimálnou glomerulosklerózou u uremických potkanov. Je zaujímavé, že poškodenie bolo otupené po obmedzení fosfátov [12]. Je potrebné poznamenať, že obsah bielkovín v strave nebol v tejto štúdii spomenutý.

V klinickom scenári nízkoproteínová diéta znížila koncentráciu uremických toxínov a zachovala reziduálnu renálnu funkciu, dokonca aj pri prechode z konzervatívnej starostlivosti na inkrementálne dialyzačné režimy [13].Diétneproteínobmedzenie tiež oneskorilo progresiu CKD v nedávnej metaanalýze [14]. Keďže však obmedzenie proteínov korelovalo s nižšími hladinami fosfátov v sére, tento priaznivý účinok stravy mohol byť čiastočne vysvetlený obmedzením fosfátov. Doposiaľ najväčšia prospektívna štúdia MDRD [15] preukázala len malý prínos nízkoproteínovej diéty u pacientov so stredne ťažkou renálnou insuficienciou, zatiaľ čo progresia renálneho ochorenia nebola ovplyvnená u pacientov s ťažkou renálnou insuficienciou. Napriek tomu sa obsah fosfátov v strave v tejto skúške nezaoberal a vplyv jeho individuálneho príspevku na spomalenieCKDprogresia zostáva neznáma.

Je známe, že fosfát môže znížiť renálne a cirkulujúce Klotho [16], proteín proti starnutiu zapojený do cytoprotekcie a antifibrózy, s antioxidačnými a antiapoptickými účinkami [17]. Okrem toho už bola preukázaná defektná autofágia v obličkových bunkách v dôsledku Klotho deficitu [18]. Autofágia je katabolický proces s kritickými funkciami pri udržiavaní bunkovej homeostázy a zachovávaní životaschopnosti buniek v stresových podmienkach. Niektoré dôkazy naznačujú vzťah medzi autofágiou a progresiou CKD prostredníctvom rôznych dráh, vrátane signalizácie TGF [19], čo je silný fibrogénny faktor pre rozvoj renálnej fibrózy. TGF- ovplyvňuje niekoľko biologických procesov, reguluje bunkovú proliferáciu a diferenciáciu, apoptózu a pôsobí väzbou na špecifické transmembránové receptory, ktoré indukujú intracelulárnu signalizáciu sprostredkovanú proteínmi SMAD [20]. Apoptóza je mechanizmus programovanej bunkovej smrti, ktorý sa líši od nekrózy. Fosfát bol opísaný ako mediátor apoptózy v experimentálnych modeloch endotelových [21], osteoblastických [22] a peritoneálnych mezoteliálnych buniek [23]. Existujú dôkazy o účasti apoptotickej bunkovej smrti na progresiiobličkyporanenia [24], ale vplyv fosfátov na apoptózu obličkových buniek ešte nebol objasnený.

Pretože mechanizmus, ktorým vysokofosfátová diéta urýchľuje progresiu CKD, ešte nie je úplne objasnený, predpokladali sme, že by mohol súvisieť s dysfunkčným autofagickým človekom. Preto sme v súčasnej štúdii hodnotili dve skupiny potkanov Mníchov-Wistar podľa obsahu fosfátov v ich strave (nízky 0,2 percent oproti vysokému0,95 percenta) a testovali sme vplyv nízkofosfátová diéta naobličkyhistologické a imunohistochemické zmeny, vrátane autofágneho markera, beclin-1.

2. Výsledky

Hemodynamické, morfologické a biochemické parametre získané zo skupín s nízkou (LoP) a vysokofosfátovou diétou (HiP) sú uvedené v tabuľke 1. Ako sa očakávalo, 5/6- nefrektómia vyvolala zníženie klírensu kreatinínu a zvýšenie v sére močoviny a kreatinínu v oboch skupinách. Zvieratá zo skupiny HiP vykazovali nižšiu funkciu obličiek, o čom svedčí vyšší kreatinín a nižší klírens kreatinínu; tiež vykazovali nižší hematokrit a nižšiu konečnú hmotnosť. Skupina HiP vykazovala zvýšenie sérového a frakčného vylučovania fosfátu, ako aj parathormónu (PTH) a fibroblastového rastového faktora-23 (FGF-23). Je potrebné poznamenať, že kaudálny tlak, počiatočná hmotnosť a vylučovanie albumínu močom boli medzi skupinami podobné.

Histologické nálezy sú znázornené na obrázkoch 1–3. Glomeruloskleróza (GS) sa sotva zistila v oboch skupinách. Avšak percento intersticiálnej fibrózy bolo významne vyššie u potkanov v skupine HiP. V súlade s tým tieto zvieratá mali tiež vyššie percento - aktínom zafarbenej oblasti hladkého svalstva a vyššiu renálnu infiltráciu makrofágmi, hodnotenú expresiou ED-1, ako je uvedené v tabuľke 2. Expresia fosforylovaného SMAD (p-SMAD), marker aktivácie dráhy TGF-beta sa medzi skupinami nelíšil.

Bunky pozitívne na jadrový antigén proliferatívnych buniek (PCNA) prevládali v skupine HiP, čo naznačuje, že preťaženie fosfátmi podporovalo intenzívnejšiu proliferáciu obličkových buniek. Naopak, počet apoptotických buniek mal tendenciu byť vyšší v skupine LoP. Podobne, beclin 1-pozitívne bunky boli významne vyššie v tubulointersticiálnych léziách v skupine LoP, čo naznačuje možný účinok vyššieho fosfátu pri inhibícii regeneračného autofagického procesu naobličkytkaniva.

3. Diskusia

Táto experimentálna štúdia skúmala, či diétne obmedzenie fosfátov je účinným krokom na spomalenie progresie CKD, bez ohľadu na sprievodné diétne obmedzenie bielkovín. Skúmali sme účinok diét s rôznym obsahom fosfátov ({{0}},2 vs. 0,95 percenta) na zvieracom modeli s 5/6- nefrektómiou, pričom všetky zvieratá dostávali diétu s nízkym obsahom bielkovín (12 percent). Naše zistenia ukázali, že diéta s vysokým obsahom fosfátov bola spojená s hyperfosfatémiou, napriek zvýšeniu PTH, FGF-23 a následne aj frakčnej exkrécii fosfátov. Okrem toho HiP spôsobil poškodenie funkcie obličiek a zvýšenie intersticiálnej fibrózy, ktorá bola spojená s vyššou expresiou aktínu, infiltráciou makrofágov a bunkovou proliferáciou, ako aj inhibíciou autofágie.

Metaanalýza 12 kohortových štúdií zahŕňajúcich 25 546 nedialyzovaných pacientov s CKD preukázala nezávislú súvislosť medzi hladinami fosfátov v sére,obličkyzlyhanie a úmrtnosť [25]. Okrem toho retrospektívna kohortová štúdia u 13 772 pacientov s dialyzačným incidentom odhalila súvislosť medzi hyperfosfatémiou a inými abnormalitami CKD-minerálnej a kostnej poruchy so strmším poklesom zvyškovobličkyfunkcia [26]. Mechanizmus, ktorým reštrikcia fosfátov oneskoruje progresiu CKD, je ešte potrebné stanoviť. V experimentálnej štúdii sme ukázali, že diéta obohatená o fosfáty bola spojená s väčšou poruchou funkcie obličiek v porovnaní s diétou s nízkym obsahom fosfátov u potkanov Wistar podrobených paratyreoidektómii a 5/{4}}nefrektómii s použitím fixného prištítneho telieska suplementácia hormónov (PTH) [11]. Kusano a kol. [10] ukázali, že ochrana funkcie obličiek bola spojená s nízkofosfátovou (0,3 percenta) diétou, bez ohľadu na obsah bielkovín v strave u uremických potkanov. Potkany s normálnou fosfátovou (0,5 percenta) diétou však vykazovali tieto výhody iba vtedy, ak boli kŕmené diétou s veľmi nízkym obsahom bielkovín (8,4 percenta). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že úloha fosfátu v strave môže byť silnejšia ako bielkovina v strave. Žiadna z vyššie uvedených štúdií sa však nepokúšala preskúmať potenciálne cesty, ktoré by sa mohli podieľať na poškodení obličiek súvisiaceho s fosfátmi.

Pôsobenie preťaženia fosfátmi pri progresii CKD bolo predmetom viacerých štúdií. Štítky a kol. najprv navrhol túto možnosť na zvieracom modeli, ale diétny proteín [27] nebol kontrolovaný, čo pravdepodobne maskovalo izolovaný účinok fosfátov. Predpokladaný prínos obmedzenia nezávislého od fosfátov, a nie proteínového obmedzenia v scenári CKD, je veľmi zaujímavý, pretože riziko kontroly sérových fosfátov spolu s obmedzeným príjmom bielkovín môže viesť k podvýžive a spôsobiť vyššiu úmrtnosť.

Obsah fosfátovej diéty nemusí nevyhnutne určovať koncentráciu fosfátov v sére u pacientov s CKD [28], čo poukazuje na dôležitosť obmedzenia diéty nezávisle od koncentrácie tohto prvku v sére. Patologické účinky fosfátov na kosti a kardiovaskulárny systém motivujú intervencie na liečbu hyperfosfatémie. V klinickej praxi intervencie na zníženie hladín fosfátov pozostávajú z diétnych obmedzení a viazačov fosfátov. Hoci prínosy tohto prístupu na klinické parametre boli sporné v štúdii s malou vzorkou [29], vzhľadom na poznanie, že nadbytok fosfátov je zodpovedný za nadprodukciu PTH a FGF-23, je rozumné zachovať čo najnižšie hladiny fosfátov u pacientov s CKD [30].

Nízkoproteínová diéta indukuje nízku biologickú dostupnosť fosfátu a znižuje sérový FGF-23 [31,32], mediátor sodíkovej závislej reabsorpcie fosfátov na renálnych tubulárnych bunkách. To naznačuje, že mechanizmus regulácie fosfátov pri pokročilom CKD môže byť nejakým spôsobom ovplyvnený príjmom fosfátov úplne nezávislým spôsobom od obsahu proteínovej stravy. Z tohto dôvodu sme hodnotili vplyv obsahu fosfátovej stravy na progresiu CKD na modeli 5/6- nefrektómie. Predchádzajúca experimentálna štúdia už preukázala, že fosfát môže modifikovať antiproteinurickú odpoveď na diétu s veľmi nízkym obsahom bielkovín (0,3 g/kg), čo ukazuje koreláciu medzi hladinami fosfátov v sére a fosfatúriou s antiproteinurickou odpoveďou na diéta s obmedzením bielkovín, nezávislá od funkcie obličiek [33]. V krížovej štúdii, ktorá zahŕňala 11 pacientov s CKD (eGFR 30–55 ml/min/m2), sa cirkadiánny rytmus sérových fosfátov zmenil diétou s vysokým obsahom fosfátov, čo nebolo vysvetlené vylučovaním fosfátov močom, PTH alebo FGF -23 [34]. Tento výsledok posilňuje význam obmedzenia fosfátovej diéty u pacientov s CKD ako nezávislého terapeutického cieľa.

Nezdá sa, že by sa hemodynamický stav podieľal na zhoršení funkcie obličiek v skupine HiP, keďže arteriálny tlak bol v oboch skupinách podobný. Okrem toho sme v našom modeli nenašli významné poškodenie glomerulov, čo by sa dalo vysvetliť obmedzením proteínov. V skupine s diétou HiP sme však zaznamenali viac intersticiálnej fibrózy.

Intersticiálna fibróza dobre koreluje so stratou funkcie obličiek u ľudí a potkanov.

Predchádzajúca štúdia spájala vývoj renálnej fibrózy vyvolanej vysokofosfátovou diétou prostredníctvom peptidyl-prolylizomerázy Pin 1 [35], zatiaľ čo iné práce poukázali na škodlivú úlohu deficitu aKlotho naobličkytkanivová fibróza [36,37]. Genetická delécia Klotho v experimentálnych modeloch spôsobuje starnutie, spomalenie rastu a kalcifikácie [38]. Signalizácia FGF23-Klotho inhibuje renálnu reabsorpciu fosfátov. V podmienkach CKD je expresia Klotho v renálnych tubuloch znížená [39]. Okrem toho diéta bohatá na fosfáty zhoršila deficit aKlotho v modeli ischemicko-reperfúzneho akútneho poškodenia obličiek a ďalej podporila zvýšenieobličkytkanivovej fibrózy, čo urýchľuje progresiu CKD [18]. Vplyv fosfátovej diéty na renálnu expresiu Klotho bol už preukázaný na myšacích modeloch [40]. Možno, okrem iných ciest, preťaženie fosfátmi zhoršuje funkciu obličiek moduláciou expresie Klotho na tubulárnych bunkách; mala by sa ďalej skúmať v budúcich štúdiách.

Apoptóza a fibróza sú sprostredkované cytokínmi, ako je TGF- [41,42]. Popísali sme asociáciu sekundárnej hyperparatyreózy a následnej vyššej expresie TGF- na procese remodelácie srdca [43]. Predpokladá sa, že existuje súvislosť medzi aktiváciou PTH a signalizáciou TGF, ktorá stimuluje proliferáciu fibroblastov, syntézu kolagénu a fibrózu. Existujú dokonca experimentálne dôkazy o integrovanom pôsobení TGF- a PTH receptorov na kostné bunky, ktoré regulujú signalizáciu kostnej remodelácie [44]. Úloha signalizácie TGF-/Smad vobličkychoroba už bola popísaná. TGF- sa viaže na transmembránový receptor, spúšťa fosforyláciu proteínov Smads a podporuje ich translokáciu do jadra pre transkripčné účinky. Preto sú nevyhnutné pre signálnu transdukciu členov rodiny TGF-. Nadmerná expresia proteínov Smad2 a Smad3 vo fibrotickej obličke na zvieracích modeloch s CKD už bola skutočne preukázaná [45]. Je zaujímavé, že existujú dôkazy o aktivácii Smads inými mediátormi nezávislými od TGF-, ako sú koncové produkty pokročilej glykácie [46] a angiotenzín II [47]. Keďže účinok hyperfosfatémie na progresiu CKD nebol ovplyvnený náhradou PTH v experimentálnom modeli [11], zaujímalo by nás, či fosfát bude mať priamu úlohu v signalizácii Smad obličiek. V našom modeli nebol žiadny vplyv hyperfosfatémie na expresiu p-Smad v renálnych tubulárnych bunkách.

To však nevylučuje možnosť aktivácie dráhy TGF nezávisle od fosforylácie Smads. Na preskúmanie tejto alternatívnej cesty sú potrebné ďalšie štúdie.

Pri hodnotení kostného tkaniva indukovalo preťaženie fosfátmi apoptózu buniek podobných osteoblastom [22]. Rojas a kol. v kostných biopsiách transplantovaných pacientov preukázali, že počet apoptotických buniek bol vyšší u pacientov s nízkym obsahom fosfátov a PTH by mal vplyv na zvýšenie počtu osteoblastov a prevenciu apoptózy [48]. Tento inhibičný účinok PTH na apoptózu kostných buniek už bol preukázaný [49]. Okrem účinkov na kostné tkanivo súvisia apoptotické dráhy aj s akútnym zlyhaním obličiek [48] a mohli by byť možným mediátorom progresie CKD. V našom modeli sme pozorovali vyšší podiel buniek podstupujúcich apoptózu v skupine LoP bez štatistickej relevancie. Tieto úvahy naznačujú narušený mechanizmus apoptózy spôsobený hyperfosfatémiou. Musíme však mať na pamäti, že nebolo možné vyhodnotiť výhradný účinok fosfátu naobličkyapoptóza tkaniva, keď sa u zvierat vyvinulo aj zvýšenie PTH a FGF-23.

V súčasnej štúdii sme sa zaoberali ďalším možným mechanizmom poškodenia obličiek vysokofosfátovou diétou, autofágnou dysfunkciou, meraním proteínu beclin-1, regulačného proteínu potrebného na nukleáciu autofagozomálnej membrány [50]. Autofágia je katabolická dráha, ktorá zahŕňa degradáciu bunkových komponentov prostredníctvom lyzozómov [51,52]. Fosforylácia Beclin{5}} sa považovala za signál špecifický pre autofágiu pre aktiváciu komplexu fosfatidylinozitol-3-fosfátkinázy a nábor do miest membrány autofagozómovej biogenézy [53]. Knockdown beclinu-1 potláča autofágiu [54] a ischemicko-reperfúzia zvyšuje jeho hladiny [55]. Zníženie beklinu- 1 a sprievodná upregulácia mTOR znižujú rast malígnych buniek, čím sa zdôrazňuje účinok autofágie na prežitie [52].

Antifibrotické účinky Klotho boli tiež spojené s upregulovaným autofágovým procesom, dráhou, prostredníctvom ktorej bolo ischemické poškodenie oslabené v modeli AKI a narušené vysokými hladinami fosfátov [18]. Experimentálne štúdie ukázali, že autofagický tok zmierňuje infiltráciu makrofágov a fosfátmi indukovanú renálnu fibrózu. Okrem toho prostredie bohaté na fosfáty indukuje mitofágiu v tubulárnych bunkách in vitro [56]. Naše údaje ukázali, že obsah fosfátov v strave tiež moduloval expresiu beklinu-1 v obličkových tubuloch in vivo. Diéta HiP bola tiež spojená s väčšou bunkovou proliferáciou a trendom k nižšej apoptotickej rýchlosti, ako je znázornené analýzou PCNA a TUNEL. V našom modeli však nebolo možné identifikovať, či k tomu došlo ako priamy účinok preťaženia fosfátmi alebo v dôsledku abnormalít hladín PTH a FGF-23 vyvolaných hyperfosfatémiou. Toto zistenie je potrebné potvrdiť klinickým scenárom.

Kľúčovou výhodou tejto štúdie bolo posúdiť vplyv obmedzenia fosfátov v nízkoproteínovej diéte na progresiu CKD, čo zahŕňalo skúmanie jeho vplyvu na histologické vzorce a molekulárne fenotypyobličkytkaniva. Pokiaľ vieme, toto je prvá štúdia, ktorá demonštruje moduláciu expresie beclin{0}}, autofágového markera na renálnych tubulárnych bunkách, pomocou fosfátovej diéty in vivo. Hlavným obmedzením bola nemožnosť oddeliť účinok hyperfosfatémie od iných abnormalít súvisiacich s CKD-MBD, ako je zvýšenie PTH a FGF-23. Neboli sme schopní vyhodnotiť ani stravu so stredným obsahom fosfátov alebo renálnu expresiu Klotho. Náš model však reprodukuje stav v reálnom živote, kde je HiP diéta zvyčajne spojená s hyperparatyreózou a vysokými hladinami FGF-23.

4. Závery

Stručne povedané, táto štúdia poskytla dôkaz, že fosfátová diéta hrá úlohu v progresii CKD, čo môže viesť k zvýšeniu intersticiálnej fibrózy. Okrem toho môže diéta bohatá na fosfáty zmeniťobličkyproces autofágie. Identifikácia proteínovo nezávislej dráhy, prostredníctvom ktorej fosfát zhoršuje funkciu obličiek, môže otvoriť dôležitú cestu pre vývoj nových prístupov zameraných na prevenciu alebo zníženie progresie CKD v klinickom prostredí.

5. Materiály a metódy

Do tejto štúdie boli zahrnuté dospelé samce potkanov Munich-Wistar získané z miestneho zariadenia. Potkany boli udržiavané pri teplote 23 ± 1 ◦C s vlhkosťou vzduchu 60 ± 5 percent v 12:12-hodinovom cykle svetlo-tma. Všetky zvieratá mali voľný prístup k vode z vodovodu a boli kŕmené stravou s nízkym obsahom bielkovín (12 percent bielkovín). Zvieratá sa usmrtili o dva mesiace neskôr, keď sa analyzovala krv, moč a obličkové tkanivo. Tlak manžety na chvoste, klírens kreatinínu a denné vylučovanie albumínu močom boli stanovené u všetkých potkanov. Návrh experimentu je znázornený v prílohe A (obrázok A1).

5.1. Analytické techniky

Šesťdesiat dní po Nx sa zvieratá anestetizovali tiopentalom sodným (50 mg/kg telesnej hmotnosti) a odobrali sa vzorky krvi. Koncentrácia kreatinínu v sére bola stanovená kolorimetrickou metódou. Sérový albumín, fosfát, močovina, vápnik a hematokrit sa merali štandardnými metódami. PTH sa meral pomocou ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, USA). FGF-23 sa meral pomocou súpravy ELISA (KAINOS, Japonsko) podľa protokolu výrobcu. Vypočítali sme glomerulárnu filtráciu pomocou klírensu kreatinínu na základe hladín kreatinínu v sére a moči a vyjadrené v ml/min, vypočítané podľa vzorca: kreatinín v moči (mg/dl) × spolužiak v moči (ml/min)/sérový kreatinín (mg/dl). Močový albumín bol stanovený radiálnou imunodifúziou.

- tretiny ľaviceobličkyuzavretím dvoch alebo troch vetiev ľavej renálnej artérie. Falošne operované krysy podstúpili anestéziu a manipuláciu s obličkovými stopkami bez redukcie obličkovej hmoty. Po prebratí z anestézie boli zvieratá vrátené do svojich pôvodných klietok, ktoré boli zahrievané počas nasledujúcich 24 hodín.

Frakčné vylučovanie fosfátu (FEP) sa získalo prostredníctvom moču a sérového fosfátu (mg/dl), moču a kreatinínu v sére (mg/dl) a vyjadrilo sa v percentách s nasledujúcim vzorcom: (moč/sérový fosfát)/ (moč/sérum kreatinínu) × 100.

5.2. Experimentálne skupiny

Zvieratá boli rozdelené do dvoch skupín podľa obsahu fosfátov v strave, ako je špecifikované nižšie: Nízkofosfátová diéta (LoP): n=20; zvieratá dostávali TD-90016, 12-percentnú bielkovinovú diétu, upravenú na 0,2-percentnú koncentráciu fosfátov. Diéta s vysokým obsahom fosfátov (HiP): n=19; zvieratá dostávali TD-90016, 12-percentnú bielkovinovú diétu, upravenú na 0,95-percentnú koncentráciu fosfátov.

5.3. Histologické techniky

Zvyšokobličkybol perfundovaný in situ pri pozorovanom MAP fyziologickým roztokom a potom roztokom Duboscq-Brasil na fixáciu. Po zvážení boli dva strednokoronálne obličkové rezy dodatočne fixované v pufrovanom 4% formaldehyde. Renálne tkanivo sa potom zalialo do parafínu a pripravilo sa na histomorfometriu a imunohistochémiu, ako už bolo opísané [57].

Všetky morfometrické hodnotenia sa uskutočňovali v rezoch s hrúbkou 4- µm jediným pozorovateľom, ktorý bol voči skupinám zaslepený. U každého potkana sa odhadla závažnosť glomerulosklerózy (GS) v rezoch zafarbených kyselinou jodistou Schiff (PAS) priradením skóre každému glomerulu (vyšetrilo sa aspoň 120 na potkana) na odhadnutie sklerotizovanej frakcie oblasti chumáčov. a odvodenie GS indexu (GSI) pre každého potkana, ako je opísané vyššie [58]. Na posúdenie stupňa intersticiálnej expanzie sa odhadlo percento renálnej kortikálnej oblasti obsadenej intersticiálnou fibrózou (percento IF) v Massonovo farbených rezoch technikou počítania bodov [59].

5.4. Imunohistochémia

Štyri um hrubé obličkové rezy zaliate v parafíne boli pripevnené na sklenené podložné sklíčka potiahnuté 6 % silánom. Rezy boli zbavené parafínu, rehydratované a potom zahrievané v citrátovom tlmivom roztoku, aby sa zlepšilo získavanie antigénu. Boli predinkubované s 5 percentným normálnym králičím (pre ED-1) alebo konským (pre -aktín) sérom v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS) alebo v roztoku proteínového bloku na báze kazeínu (Protein Block; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (pre PCNA, pSmad a Beclin)), aby sa zabránilo nešpecifickej väzbe. Inkubácia s primárnou protilátkou sa uskutočnila cez noc pri 4 °C. Negatívne kontroly sa uskutočnili vynechaním primárnej protilátky.

Boli použité nasledujúce primárne protilátky: monoklonálna myšacia anti-potkania ED-1 protilátka (Serotec, Oxford, UK), na detekciu makrofágov; myšia monoklonálna anti-alfa hladká (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), na detekciu -aktínu; polyklonálna anti-Beclin 1 protilátka (Boster, Pleasanton, CA, USA) na autofagickú analýzu. Po premytí boli rezy inkubované s biotinylovaným anti-myším IgG (H plus L), (Vector, Burlingame, CA, USA) počas 45 minút, po čom nasledovala súprava VECTASTAIN® ABC-AP, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA , USA) počas 30 minút. Rezy sa potom vyvolali roztokom rýchločerveného farbiva.

V prípade monoklonálnych myších anti-proliferujúcich bunkových nukleárnych antigénov (Dako, Dánsko) a phosphor-smad2 (Ser465/467) protilátky (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) sa inhibícia endogénnej peroxidázy uskutočnila 3-percentným roztokom peroxidu vodíka a metanolom počas 30 min. Rezy sa potom inkubovali cez noc s primárnou protilátkou vo zvlhčenej komore pri 4 °C. Nasledujúci deň boli rezy inkubované s biotinylovaným anti-myším IgG (H plus L) alebo biotinylovaným anti-potkaním IgG (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, USA) počas 45 minút, po čom nasledovala inkubácia s VECTASTAIN® ABC- Súprava HRP (Vector, Burlingame, CA, USA) na 30 min. Rezy sa potom vyvolali pomocou 3-amino-9-etylkarbazolového substrátového chromogénu (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Všetky rezy boli opláchnuté v destilovanej vode, kontrastne zafarbené roztokom Mayer's Hemalum (Merck, Darmstadt, Nemecko) pokrytým Kaiserovou glycerín-želatínou (Merck, Darmstadt, Nemecko).

Na odhad intersticiálnej renálnej hustoty ED-1, p-Smad, Beclin a PCNA sa počet pozitívnych buniek/mm2 hodnotil zaslepeným spôsobom pri 400-násobnom zväčšení. Na vyhodnotenie -aktínu sme použili techniku ​​počítania bodov pomocou mikroskopu s 100-bodovým okulárom pripojeným k video monitoru. Analyzovali sme 25 polí pri zväčšení 3200. Výsledky boli vyjadrené v percentách vzhľadom na celkovú plochu.

5.5. Apoptóza

Apoptóza bola stanovená v renálnych tubulárnych bunkách technikou TUNEL (TdT sprostredkované X-dUTP Nick end labeling) s použitím inštrukcií poskytnutých Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, USA). Apoptotické bunky sa analyzovali v 25 poliach s 1000-násobným zväčšením, aby sa získala konečná hodnota vyjadrená v bunkách/mm2.

5.6. Štatistická analýza

Rozdiely medzi skupinami LoP a HiP boli testované pomocou nezávislého Studentovho testu alebo Mann-Whitneyho testu. Vzťahy medzi premennými boli skúmané Spearmanovým korelačným koeficientom. Údaje sú prezentované ako priemer ± SE, pokiaľ nie je uvedené inak. P-hodnota<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Financovanie:Túto štúdiu podporila Sáo Paulo Research Foundation (FAPESP – grant č. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz a Elias sú podporovaní CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico), ale táto finančná podpora nezohrávala žiadnu úlohu pri písaní tohto článku.

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady:Táto štúdia bola vykonaná v súlade s odporúčaniami miestnej rady pre etické hodnotenie. Protokol bol schválený Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas das Faculdade de Medicina da USP (CEUA, proces #090/10 a dátum schválenia 10. augusta 2010). Všetky experimentálne postupy dodržiavali prísne medzinárodné štandardy pre manipuláciu a starostlivosť o laboratórne zvieratá.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:Údaje uvedené v tejto štúdii sú k dispozícii na požiadanie od príslušného autora.

Poďakovanie:Autori ďakujú Wagnerovi Dominguezovi za jeho odbornú technickú pomoc. Konflikt záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Hill, NR; Fatoba, ST; Oke, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Globálna prevalencia chronickýchobličkychoroba – systematický prehľad a metaanalýza. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.

2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; a kol. Diabetes so skorýmobličkyzapojenie môže skrátiť očakávanú dĺžku života o 16 rokov. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.

3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Bills, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Účinok inhibície angiotenzínu nezávislý od krvného tlaku na vaskulárne lézie chronického zlyhania obličiek.ObličkyInt. 1992, 42, 46-55.

4. Vyprážaný, LF; Sad, TJ; Kasiske, BL Vplyv zníženia lipidov na progresiu ochorenia obličiek: metaanalýza.ObličkyInt. 2001, 59, 260-269.

5. Ishidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Antagonista receptora angiotenzínu II zlepšuje renálnu tubulointersticiálnu fibrózu spôsobenú jednostrannou ureterálnou obštrukciou.ObličkyInt. 1995, 47, 1285-1294.

6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB Regresia existujúcej glomerulosklerózy inhibíciou aldosterónu. J. Am. Soc. Nephrol. 2005, 16, 3306-3314.

7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Obmedzenie diétneho proteínu pri zistenom poškodení obličiek u potkanov. Selektívna úloha glomerulárneho kapilárneho tlaku pri progresívnej glomerulárnej dysfunkcii. J. Clin. Vyšetrovať. 1986, 78, 1199-1205.

8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Príjem bielkovín v strave a progresívny charakterobličkychoroba: Úloha hemodynamicky sprostredkovaného glomerulárneho poškodenia v patogenéze progresívnej glomerulárnej sklerózy pri starnutí, renálnej ablácii a vnútornom renálnom ochorení. N. Engl. J. Med. 1982, 307, 652-659.

9. Bellizzi, V. Nízkobielkovinová diéta alebo nutričná terapia u chronickýchobličkychoroba? Blood Purif. 2013, 36, 41–46.

10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukušima, N.; Miyamoto, K. Úloha stravy s nízkym obsahom bielkovín a fosforu v progresii chronickejobličkyochorenie u uremických potkanov. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008, 54, 237–243.

11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Nežiaduce účinky hyperfosfatémie na hypertrofiu myokardu, funkciu obličiek a kosti u potkanov so zlyhaním obličiek.ObličkyInt. 2004, 66, 2237-2244. [CrossRef] [PubMed]

12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Reštrikcia fosforečnanov významne znižuje úmrtnosť u uremických potkanov so zavedenou vaskulárnou kalcifikáciou. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.

13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Ochrana reziduálnej funkcie obličiek a nutričná liečba: Stratégia prvého kroku na zníženie uremických toxínov u pacientov v konečnom štádiu ochorenia obličiek. Toxíny 2021, 13, 289.

14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Vplyv obmedzenia bielkovín v strave na progresiu chronickejobličkychoroba: Systematický prehľad a metaanalýza. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]

15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Účinky obmedzenia bielkovín v strave a kontroly krvného tlaku na progresiu chronického ochorenia obličiek. Modifikácia stravy v skupine skúmajúcej ochorenie obličiek. N. Engl.

J. Med. 1994, 330, 877-884. [CrossRef]

16. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Hill, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; a kol. Klotho a fosfát sú modulátory patologickej uremickej prestavby srdca. J. Am. Soc. Nephrol. 2015, 26, 1290–1302.

17. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Erytropoetínový receptor je downstream efektor cytoprotekcie indukovanej Klotho. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.

18. Shi, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho zmierňuje progresiu AKI na CKD prostredníctvom aktivácie autofágie. J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 2331–2345.

19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Autofágia reguluje expresiu TGF-beta a potláča juobličkyfibróza vyvolaná jednostrannou ureterálnou obštrukciou. J. Am. Soc. Nephrol. 2014, 25, 2835–2846.

20. Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S.; Heldin, CH Regulácia Smad v transdukcii signálu TGF-beta. J. Cell Sci. 2001, 114, 4359-4369.