Účinky ektoínu na bielenie pokožky prostredníctvom potlačenia melanogenézy stimulovanej MSH a aktivácie antioxidačných dráh Nrf2 v keratinocytoch ožiarených UVA

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 a Hsin-Ling Yang 8,*

Abstrakt:Produkcia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) indukovaná ultrafialovým žiarením A (UVA) sprostredkuje nadmernú produkciumelanogenézav kožných bunkách, čo vedie k pigmentácii. Preukázali sme depigmentačné a antimelanogénne účinky ektoínu, prirodzeného bakteriálneho osmolytu, v ľudských keratinocytoch ožiarených UVA (HaCaT) a boli objasnené základné molekulárne mechanizmy. HaCaT bunky boli vopred ošetrené nízkymi koncentráciami ektoínu (0,5–1,5 µM) a testované na rôzne depigmentačné a antimelanogénne parametre. Táto predbežná liečba významne znížila tvorbu ROS, produkciu hormónu stimulujúceho melanocyty (-MSH) a expresiu proopiomelanokortínu (POMC) v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením. tiežantioxidantExpresie proteínu heme oxygenáza-1 (HO-1), NAD(P)H dehydrogenáza [chinón 1] (NQO-1) a katalytická podjednotka (-GCLC) -glutamát-cysteín ligáza boli sprostredkované prostredníctvom jadrovej translokácie jadrového faktora erytroidného{7}}faktora 2 (Nrf2), ktorého knockdown skutočne narušil tento účinok, čo znamená dôležitosť dráhy Nrf2. Ektoín sprostredkovával aktiváciu Nrf2 prostredníctvom dráh p38, proteínkinázy B (tiež známej ako AKT), proteínkinázy C (PKC) a proteínkinázy kazeínkinázy II (CKII). Kondicionované médium získané z HaCaT buniek vopred ošetrených ektoínom a ožiarených UVA žiarením znížilotyrozináza, proteín príbuzný tyrozináze-1 a -2 (TRP-1/-2), proteín kináza cyklického AMP (c-AMP), proteín viažuci prvok c-AMP (CREB) ) a expresie transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF), čo vedie k bunkám melanómu B16F10, ktoré inhibujú syntézu melanínu. Je zaujímavé, že tento antimelanogénny účinok v bunkách B16F10 stimulovaných -MSH bol pozorovateľný iba pri 50–400 µM koncentráciách ektoínu, čo znamená kľúčovú úlohu, ktorú zohráva keratinocytezínová koža ošetrená ektoínom (0,5–1 µM)bielenieúčinky. Dospeli sme k záveru, že Ectoine môže byť použitý ako účinný lokálny prírodný kozmetický prostriedok s depigmentačným a antimelanogénnym účinkom.

Kľúčové slová:ektoín; keratinocyty;melanogenéza; tyrozináza; -MSH; Nrf2

Cistanche má antioxidačný účinok.

1. Úvod

Vystavenie ľudskej pokožky UVA žiareniu spúšťa tvorbu ROS a tiež nadmernú produkciu melanínu v kožných bunkách. Nekontrolovaná produkcia ROS by mohla viesť aj k melanómovým stavom. Väčšina činidiel na bielenie pokožky sa zameriava a snaží sa ich minimalizovaťmelanogenézaproces prostredníctvom inhibície -MSH atyrozinázaprodukcie [1]. Väčšina krémov na zosvetlenie tónu pleti sa skladá z hydrochinónu [2] alebo hydrokortizónu [3], o ktorých je známe, že znižujú tvorbu melanínu, ale sú tiež spojené so závažnými vedľajšími účinkami. Napríklad akné, šupinatá a svrbiaca pokožka, modré a čierne sfarbenie pokožky, ochronóza, pálenie a štípanie pokožky, podráždenie až zápaly.bielenielátky z prírodných zdrojov, napríklad kyselina kojová (derivát húb získavaný z druhov Penicillium a Aspergillus) tiež spôsobujú „kontaktnú dermatitídu“ u jedincov s citlivou pokožkou. U týchto jedincov môže viac ako 1 percento kyseliny kojovej spôsobiť závažné hypersenzitívne vedľajšie účinky [4,5]. Preto len málo prirodzene odvodených kožebielenieprodukty (oleozín, extrakt zo sladkého drievka, kyselina askorbová, sójový proteín, N-acetylglukosamín atď.) sa v súčasnosti používajú v kozmetickom priemysle [6]. Výrobky starostlivosti o pleť, ktoré sa zameriavajú predovšetkým na depigmentačné vlastnosti, sa však občas nezamerali na pôsobenie proti škodlivým účinkom spôsobeným nadmernou produkciou ROS sprostredkovanou UVA žiarením.melanogenézav kožných bunkách.

Ektoín je „prírodný extremolyt“ produkovaný niekoľkými druhmi mikroorganizmov v podstresových podmienkach [7,8]. Táto zlúčenina bola prvýkrát izolovaná z baktérií druhu Ectothiorhodospira, ktoré žijú v egyptskej púšti. Na produkcii tejto zlúčeniny sa podieľa kaskáda ect operónových génov (ectA, ectB, ectC alebo ectD). Ektoín je chemicky označený ako kyselina 1,4,5,6-tetrahydro-2-metyl-4-pyrimidínkarboxylová [9]. Ectoín ako látka viažuca vlhkosť pomáha pri reštrukturalizácii membrány kožných buniek [10], ochrane pred poškodením UV žiarením a znečistením [11,12], zvlhčuje pokožku [13], odďaľuje predčasné starnutie pokožky [14] atď. na ochranné funkcie kože sa ukázalo, že ektoín je užitočný pri liečbe atopickej dermatitídy [15], Alzheimerovej choroby [16], ako aj pri inhibícii replikácie HIV [17], rádioterapii a chemoterapii [18] a cirhóze pečene [ 19]. Predpokladá sa, že ektoín vykazuje svoje depigmentačné a bieliace vlastnosti bez toho, aby spôsoboval nežiaduce vedľajšie účinky [20]. Na rozdiel od toho nie sú známe molekulárne mechanizmy vyvolané ektoínom. Cieľom tejto štúdie bolo preto vymedziť depigmentačné a antimelanogénne mechanizmy sprostredkované ektoínom vyvolané v ľudských keratinocytoch ožiarených UVA (HaCaT) ako systém bunkového modelu. Účinok ektoínom indukovaných sekrécií činidiel na ochranu kože z HaCaT buniek do kultivačného média (kondicionované médium) bol tiež testovaný s použitím typickej melanómovej bunkovej línie (B16F10).

2. Materiály a metódy

2.1. Činidlá a protilátky

Ektoín (č. produktu: 81619, čistota väčšia alebo rovná 95 percent) bol zakúpený od Sigma-Aldrich (Taufkichen, Nemecko). Fetálne hovädzie sérum (FBS), penicilín/streptomycín, Dulbeccovo modifikované Eagle's médium (DMEM) a l-glutamín boli zakúpené od Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA). l-DOPA, melanín, 3-4,5-dimetyl-2-yl-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) a -MSH boli získané od Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA). N-acetylcysteín (NAC) a 20,70-dichlórfluoresceín-diacetát (DCFH2-DA) boli získané od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Všetky farmakologické inhibítory potrebné pre JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) a CKII boli získané od Calbiochem (La Jolla, CA, USA) Bol získaný inhibítor PI3K/AKT (LY294002) zo Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Všetky protilátky proti POMC, CREB, -aktín,tyrozináza, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelch-like ECH-asociated protein-1 (Keap-1), andTRP-1, TRP-2 boli získané od Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Nemecko). Protilátky proti -GCLC a HO-1 boli získané od Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, USA). Protilátky proti c-AMP proteínkináze a CKII sme získali od Abcam (Cambridge, MA, USA). Históny, MITF, p-p38, p38, p-AKT a AKT boli získané od Cell Signal Technology (Beverly, MA, USA). Činidlá na detekciu zosilnenej chemiluminiscencie (ECL) boli získané od Millipore, (Billerica, MA, USA). Všetky ostatné činidlá (v kvalite HPLC) boli buď zakúpené od Sigma-Aldrich alebo Merck & Co., Inc. (Darmstadt, Nemecko).

2.2. Bunková kultúra

Získali sme imortalizované bunky keratinocytov HaCaT ľudskej kože a myšieho melanómu B16F10 od Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Nemecko) a American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA). Bunky sa kultivovali v DMEM doplnenom 10 percentami tepelne aktivovaného FBS, 1 percenta streptomycínu/penicilínu a 2 mM L-glutamínu vo zvlhčenom inkubátore doplnenom 5 percentami CO2 pri 37 °C.

2.3. Ošetrenie buniek a ožarovanie UVA

Pred UVA ožiarením boli bunky vopred ošetrené ektoínom (0,5–1,5 uM počas 24 hodín) alebo vehikulom (PBS). Po inkubácii boli bunky premyté PBS vystavené 3 J/cm2 UVA žiareniu (na 27 minút, λmax, 365 nm, žiadne detekovateľné emisie pod 320 nm) pomocou UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec,Cambridge, Spojené kráľovstvo) [21].

2.4. Intracelulárny test ROS

HaCaT bunky sa naočkovali v hustote 1,5 x 105 do 8-jamkovej komory Lab Teck obsahujúcej DMEM doplnený 10 percentami FBS a nechali sa rásť do 80 percent konfluencie. Tieto bunky sa najskôr ošetrili 1,5 uM ektoínu, potom nasledovalo vystavenie 3 J/cm2 UVA žiareniu na predpísaný čas. Bunky sa premyli PBS a na stanovenie intracelulárnej produkcie ROS sa použila metóda DCFH2-DA pomocou softvéru Olympus Software pre každý stav [21].

2.5. Kvantifikácia melanínu

Na 6-jamkovú doštičku boli bunky myšacieho melanómu B16F10 nasadené v hustote 2,5 x 105 buniek/jamku. Boli vopred ošetrené 100, 200 a 400 uM ektoínu počas 2 hodín v neprítomnosti alebo prítomnosti -MSH (1 uM). Protokol použitý na kvantifikáciu melanínu nasledoval skôr opísanú metódu [21]. Merali sme obsah melanínu pomocou čítačky mikrodoštičiek ELISA s vlnovou dĺžkou absorbancie 470 nm.

cistanche inhibuje melanín.

2.7. Western Blot

Bunky HaCaT (1 × 106 buniek/10 cm miska) alebo B16F10 (1 × 106 buniek/10 cm miska) boli vopred ošetrené rôznymi koncentráciami ektoínu (0,5, 1 a 1,5 uM) alebo -MSH (1 uM), po ktorom nasleduje ožarovanie v neprítomnosti alebo prítomnosti UVA počas predpísaného času. Bunky premyté PBS sa zozbierali, po ošetrení sa izoloval obsah proteínu (jadrový a cytosolický). Potom boli bunky podrobené metóde Western blot, ktorá sa predtým používala na stanovenie expresie rôznych jadrových a cytosolických proteínov [21].

2.8. Extrakcia RNA a RT-PCR

Bunky HaCaT vopred ošetrené ektoínom (1,5 uM, 24 h) boli podrobené pôsobeniu činidla TRIzol (Invitrogen, Carlsbad) na izoláciu celkovej RNA z týchto buniek. 1 ug celkovej RNA a reagencie dodané súpravou SuperScript-III One-Step RT-PCR platinum Taq kit (Invitrogen, Carlsbad) sa použili v experimente PCR s prístrojom Bio-Rad iCycler PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, Spojené štáty). Použité priame a spätné priméry pre Nrf2 boli: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Použité dopredné a spätné priméry pre GAPDH boli: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Na konci experimentu sa produkt PCR analyzoval použitím 1% agarózového gélu. Potom sa vizualizoval farbením etídiumbromidom. Ako vnútornú kontrolu sme použili GAPDH [22].

2.9. Imunofluorescenčný test

Bunky HaCaT sa kultivovali pri hustote 1 x 104 buniek/jamku v doplnku DMEM s 10 percentami FBS v 8-jamkovej komore Lab Tek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Bunky sme vopred ošetrili 1,5 uM ektoínu počas uvedeného času, po ktorom nasledovalo ožiarenie v neprítomnosti alebo prítomnosti UVA. Bunky boli podrobené imunofluorescenčnému testu, ktorý využíva metódu opísanú vyššie [21].

2.10. Štatistická analýza

Použili sme priemer ± štandardná odchýlka (priemer ± SD) pre všetky výsledky použité v tejto štúdii. Všetky údaje sa analyzovali analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Dunnettov test na párové porovnania a prezentovali sa ako priemer ± SD troch alebo viac nezávislých experimentov. Štatistická významnosť bola nastavená na * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" v="" porovnaní="" s="" neošetrenými="" kontrolnými="" bunkami="" a="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" v="" porovnaní="" s="" bunkami="" hacat="" vystavenými="" uva="" alebo="" bunkami="" b16f10="" ošetrenými="">

3. Výsledky

3.1. Ektoínom inhibovaná UVA-indukovaná tvorba ROS v HaCaT bunkách

Najprv sme testovali cytotoxické účinky ektoínu (obrázok 1A) na HaCaT bunky ožiarené UVA. Naše MTT údaje ukázali, že v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami, ektoín vopred ošetrený (0,5–1,5 µM) a 3 J/cm2 UVA vystavené HaCaT bunky neboli schopné vykazovať významné zníženie bunkovej životaschopnosti (obrázok 1B). Ďalej, predbežné ošetrenie ektoínom zoslabilo bunkovú smrť indukovanú UVA (3 J/cm2) spôsobom závislým od dávky (obrázok 1B). Okrem našich fluorescenčných údajov, ktoré ukázali, že v porovnaní s kontrolnými bunkami, ožiarenie 3 J/cm2 UVA a ošetrenie samotným ektoínom (1,5 µM) významne zvýšili hladiny ROS 5- a 2-násobne, resp. Avšak v prípade ektoínu pred liečbou boli hladiny ROS výrazne znížené a môžeme usúdiť, že ektoín máantioxidantúčinok proti UVA žiareniu. To tiež indukuje bazálne hladiny ROS v bunkách HaCaT (obrázok 1C, D).

3.2. Expresie POMC a -MSH potlačené ektoínom v bunkách HaCaT ožiarených UVA

Keratinocyty vystavené UVA boli stimulované na ich ROS-p53 sprostredkované POMC a tiež malý peptidový hormón -MSH, ktorý je odvodený z POMC [23]. Preto sme určili vzory inexpresie zmien -MSH, POMC a iných asociovaných proteínov v HaCaT bunkách vopred ošetrených ektoínom a potom sme ich vystavili UVA (3 J/cm2). Údaje Western blot ukázali, že UVA-indukovaná upregulácia expresie -MSH a POMC bola znížená predošetrením ektoínom; zatiaľ čo liečba ektoínom bez ožiarenia UVA úplne inhibovala expresiu -MSH a POMC neožiarených HaCaT buniek (obrázok 2A). Neskôr sme testovali účinok „kondicionovaného média“ (10 ml/100 mm doštička), získaného z HaCaT buniek vopred ošetrených ektoínom a ožiarených UVA žiarením, namelanogenézaB16F10 melanómových buniek. Obrázok 2B ukazuje, že toto upravené médium má zníženú reguláciutyrozinázahladiny , TRP-1, TRP-2, c-AMP proteínkinázy, p-CREB, CREB a MITF v bunkách B16F10.

3.3. Ektoínom znížená expresia melanínu a tyrozinázy v bunkách B16F10 stimulovaných MSH

Bunky melanómu B16F10 sa najskôr podrobili vyšším koncentráciám ektoínu a účinok cytotoxicity sa stanovil pomocou testu MTT. Obrázok 3A ukazuje, že ektoín nemal žiadny významný vplyv na životaschopnosť buniek B16F10 pri vyšších koncentráciách (100–400 uM počas 72 hodín). Životaschopnosť buniek však nebola ovplyvnená po 24 a 48 hodinách liečby ektoínom (údaje nie sú uvedené). Preto sa tieto koncentrácie použili na stanovenie účinku ektoínu na stimuláciu -MSHmelanogenézav bunkách B16F10. Údaje kvantifikácie melanínu ukázali, že v porovnaní s kontrolnými bunkami liečba samotným -MSH (1 μM) významne zvýšila hladiny melanínu o viac ako 25 percent. Avšak v porovnaní s liečbou samotnou -MSH bunky vystavené zvyšujúcim sa koncentráciám ektoínu (100–400 μM po 72 hodinách) v závislosti od dávky a významne znížili percento obsahu melanínu s maximálnou downreguláciou iba 85 percent (alebo -15 percent ako neošetrené). kontrola) bola pozorovaná pri 400 uM predbežného ošetrenia ektoínom (obrázok 3B). Okrem toho naše údaje Western blot tiež ukázali, že stimuloval -MSHtyrozinázaExpresie (24 h) a p-CREB (2 h) boli významne znížené so zvyšujúcimi sa koncentráciami predbežného ošetrenia ektoínom v týchto melanómových bunkách (obrázok 3C).

3.4. Ektoín upreguloval expresiu HO-1, NQO-1 a -GCLC proteínov v HaCaT bunkách

Na určenie účinku času na ektoínom sprostredkovanú jadrovú translokáciu Nrf2 a následnú downstream expresiu HO-1, NQO-1 a -GCLC proteínov boli HaCaT bunky vystavené 1,5 uM ektoínu a bunkové proteíny boli zozbierané 0.5, 1, 2, 4, 8 alebo 12 hodín po ektoínovej liečbe. Údaje Western blot ukázali, že okrem proteínu -GCLC 1,5 uM ektoínu spôsobilo maximálnu expresiu proteínov HO-1, Nrf2 a NQO-1 v časovom bode 4 hodiny. -GCLC bola ukázaná v časovom bode 8 hodín (obrázok 5A). Údaje získané z časovej krivky nás vedú k testovaniu vplyvu koncentrácie ektoínu na expresiuantioxidantproteíny v časovom bode 4 hodiny. Obrázok 5B ukazuje, že všetky tri antioxidačné proteíny vykazovali maximálnu expresiu pri koncentrácii ektoínu 1,5 uM. Neskôr boli účinky predbežného ošetrenia ektoínom testované na expresiu pomeru Nrf2 a Keap-1 v HaCaT bunkách ožiarených UVA. Analýza západných údajov ukázala, že predbežné ošetrenie 1,5 uM ektoínu vykazovalo zvýšenie pomeru Nrf2/Keap-1 v HaCaT bunkách ožiarených UVA (obrázok 5C). Tiež sme videli konzistentné údaje so zvýšenou expresiou NQO -1, HO-1 a -GCLC proteíny v HaCaT bunkách vopred ošetrených ektoínom, ktoré boli ožiarené 3 J/cm2 UVA (obrázok 5D). Z týchto údajov vyplýva, že predbežné ošetrenie ektoínom hrá ochrannú úlohu v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením.

3.5. Do aktivácie Nrf2 v bunkách HaCaT ošetrených ektoínom boli zapojené rôzne signálne dráhy

Určili sme signálne dráhy zapojené do jadrovej translokácie Nrf2 sprostredkovanej ektoínom. HaCaT bunky boli vopred ošetrené farmakologickými inhibítormi signálnych dráh PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS a CKII, po ktorých nasledoval 1,5 uM ektoín. Údaje Western blot jadrového Nrf2 ukázali, že do tohto mechanizmu boli zapojené dráhy p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC a CKII (obrázok 6A). Zo získaných informácií sme tiež určili vplyv predúpravy Ectoine na úlohu, ktorú tieto dráhy zohrávajú pri expresii antioxidačných proteínov. Obrázok 6B ukazuje, že farmakologická inhibícia dráh MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII a PKC znížila expresiu NQO-1, HO-1 a -GCLCantioxidantproteínov v HaCaT bunkách. Okrem toho čas potrebný na fosforyláciu AKT, p38 a expresiu PKC a CKII pri vystavení ektoínu naznačuje, že okrem p-AKT sa fosforylácia p38 a expresie PKC a CKII uskutočnili neskôr. iba časové body (po 30 minútach) (obrázok 6C). V prípade AKT sa fosforylácia pozorovala od časového bodu 15 minút, ktorý dosiahol vrchol po 30 minútach (obrázok 6C). V prípade AKT bola fosforylácia pozorovaná od časového bodu 15 minút, ktorý dosiahol vrchol po 30 minútach (obrázok 6C). Tieto kumulatívne výsledky naznačujú, že signálne dráhy p38, AKT, PKC a CKII aktivovali nukleárnu translokáciu sprostredkovanú antioxidantmi ektoínom. Nrf2 vedie k expresii antioxidačných proteínov.

3.6. Antimelanogénny účinok sprostredkovaný ektoínom bol potlačený v dôsledku zníženia Nrf2

Úloha Nrf2 v ektoínom sprostredkovanom anti-melanogenézasa určilo umlčaním Nrf2 v HaCaT bunkách. Údaje z Western blotu ukázali, že knockdown bunky Nrf2 vystavené 1,5 μM ektoínu vykazovali minimálnu expresiu NQO-1, HO-1 a -GCLCantioxidantproteíny (obrázok 7A). Neskôr sme testovali účinok knockdownu Nrf2 na expresiu hladín -MSH v bunkách HaCaT ožiarených UVA (3 J/cm2). Výsledky Western blotu ukázali, že na kontrolu buniek transfekovaných siRNA bolo UVA-žiarenie významné pri upregulácii expresie hladín -MSH v bunkách neexponovaných ektoínu (obrázok 7B). Avšak 1,5 μM ektoínu tento efekt potlačil. V druhom prípade bunky transfekované siNrf2 vykazovali zníženie expresie hladín -MSH v neošetrených aj ošetrených bunkách (obrázok 7B). Podobne ako pri údajoch -MSH, naše fluorescenčné údaje tiež ukázali, že ožarovanie UVA významne zvýšilo produkciu ROS v kontrolných bunkách siRNA neošetrených ektoínom (obrázok 7C, D). Tento účinok bol však významne potlačený, keď boli bunky vystavené 1,5 uM ektoínu. Na druhej strane bunky HaCaT transfekované Nrf2 a bunky HaCaT ožiarené UVA vykazovali približne 8-násobné zvýšenie hladín ROS v porovnaní s bunkami transfekovanými Nrf2, ktoré neboli ožiarené UVA, ale boli vystavené ošetreniu ektoínom (obrázok 7C, D). Všetky tieto údaje naznačujú ochrannú úlohu sprostredkovanú ektoínom, ktorú hrá Nrf2 pri minimalizácii produkcie melanínu v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením. Antioxidanty 2020, 9, x PRE PEER REVIEW 11 of 15 ožiarené UVA, ale vystavené ektoínovej liečbe (obrázok 7C, D) . Všetky tieto údaje znamenajú ochrannú úlohu sprostredkovanú ektoínom, ktorú hrá Nrf2 pri minimalizácii produkcie melanínu v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením.

cistanche benefit: bielenie pokožky

4. Diskusia

Rôzne kože -bieleniečinidlá sa používajú v kozmetickom priemysle. Mnohé z týchto látok sú chemického pôvodu a trpia obmedzením spôsobovania rôznych vedľajších účinkov vrátane rakoviny [24–26]. Preto identifikácia bezpečných a prirodzených bieliacich činidiel na pokožku predstavuje nevyhnutnosť hodiny. Je známe, že ektoín (obrázok 1A) sa používa ako aktívna zložka v pleťových krémoch a iných kozmetických prostriedkoch. Pôsobí ako činidlo hydratujúce pokožku a tiež sa predpokladá, že odďaľuje predčasné starnutie pokožky [27]. Takmer všetky známe činidlá na bielenie pokožky sa zameriavajú na zníženie regulácietyrozinázaenzýmová aktivita v bunkách ožiarených UV žiarením, ktorá znižujemelanogenézav kožných bunkách.Yao et al. demonštrovalbielenievlastnosti biosyntetizovaného ektoínu a predpokladá sa, že ide o aputatívne bieliace činidlo. Vo svojej štúdii testovali vysokú koncentráciu (500 µM) ektoínu na jeho bieliaci účinok na bunkové línie myšacieho melanómu (B16F0) a ľudského melanómu (A2058) a dospeli k záveru, že ektoín je bezpečný a potenciálne činidlo pre kozmetické a klinické použitie [20]. V tejto štúdii sme však ďalej testovali priaznivé účinky nízkych koncentrácií ektoínu (0, 5–1, 5 µM) na bunky HaCaT ožiarené UVA a boli dešifrované základné molekulárne mechanizmy. V našej štúdii sa ukázalo, že ektoín prostredníctvom dráhy Nrf2/ARE nielen indukoval expresiu antioxidačnej génovej expresie, ale tiež znížil hladinu -MSH v UVA-ožiarených HaCaT bunkách prostredníctvom supresie POMC. Pokles hladín -MSH koreloval so znížením aktivity enzýmu tyrozinázy, čo viedlo k zníženiu produkcie melanínu. Z našich vedomostí je to prvá správa, ktorá bola dokázaná mechanizmom vyvolaným ektoínom v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením. Táto štúdia načrtla molekulárne mechanizmy vykazované ektoínom v HaCaT bunkách ako bunkovom modelovom systéme.

Najprv sme určili subletálne koncentrácie ektoínu, ako aj účinok UVA žiarenia na životaschopnosť HaCaT buniek. Naše údaje MTT ukázali, že nízke koncentrácie ektoínu (0,5–1,5 µM) nemali významný vplyv na životaschopnosť HaCaT buniek (obrázok 1B). Predbežné ošetrenie ektoínom zvýšilo životaschopnosť 3 J/cm2 UVA-ožiarených HaCaT buniek (obrázok 1B). Na základe týchto pozorovaní sme pokračovali v našich ďalších experimentoch s použitím 1,5 uM predbežného ošetrenia ektoínom a ožiarenia UVA v dávkach 3 J/cm2.

Produkcia ROS v kožných keratinocytoch indukovaná UVA žiarením je dobre známa skutočnosť [28]. Preto sme tiež testovali akékoľvek priaznivé účinky z predbežného ošetrenia ektoínom pri produkcii ROS indukovanej UVA žiarením v bunkách HaCaT. Naše údaje o intenzite fluorescencie DCF ukázali, že predbežné ošetrenie 1, 5 uM ektoínu významne znížilo produkciu inkeratinocytov ROS indukovaných UVA žiarením. Bolo tiež pozorovateľné, že 1,5 uM ektoínu by mohlo spôsobiť zvýšenie základnej hladiny v hladinách ROS v HaCaT bunkách, ktoré sa ukázali ako štatisticky významné (obrázok 1D, E).

Rousseau a kol. uviedli, že POMC je vylučovaný ľudskými epidermálnymi keratinocytmi a melanocytmi a je stimulovanýmelanogenéza[29]. Pri zohľadnení toho sme tiež testovali účinok ožiarenia UVA a predbežného ošetrenia ektoínom na proteíny spojené s melanogenézou v bunkách HaCaT. Naše údaje Western blot ukázali, že zníženie expresie -MSH a POMC proteínov v UVA-ožiarených HaCaT bunkách bolo spôsobené predošetrením ektoínom.melanogenéza- pridružené proteíny. Najmä takmer všetky testované proteíny (tyrozináza, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkináza, CREB a MITF) vykazovali znížené expresie so zvyšujúcimi sa koncentráciami ektoínu pred liečbou v UVA-ožiarených HaCaT bunkách (obrázok 2A, B). Tieto údaje znamenajú skutočnosť, že ektoín má antimelanogénne vlastnosti v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením.

Antimelanogénna účinnosť ektoínu bola ďalej testovaná na bunkách B16F10, dobre známej bunkovej línii melanómu používanej vmelanogenézaštúdie [30]. Jedným z pozoruhodných pozorovaní v našej štúdii bolo, že na rozdiel od buniek HaCaT boli na potlačenie syntézy melanínu v bunkách B16F10 stimulovaných MSH potrebné vysoké koncentrácie ektoínu (100–400 uM) (obrázok 3B). Naše údaje Western blot ukázali, že ektoín v závislosti od dávky znižuje expresiutyrozinázaa p-CREBproteíny v -MSH-stimulovaných B16F10 bunkách, čo vedie k vyššie uvedenému účinku (obrázok 3C). Preto sa tiež testovalo, či tieto vysoké koncentrácie ektoínu môžu ovplyvniť životaschopnosť buniek B16F10. Naše výsledky MTT ukázali, že vysoké koncentrácie ektoínu (100–400 uM) nemali žiadny vplyv na životaschopnosť buniek B16F10 (obrázok 3A). Tieto výsledky naznačujú, že keratinocyty hrajú kľúčovú úlohu v anti-melanogenézaa depigmentačné účinky.

Úloha transkripčného faktora Nrf2 v metabolizme kožných buniek bola dobre zdokumentovaná [31]. Preto sme ďalej testovali mechanizmy, ktoré hrá dráha Nrf2/Keap{3}} v účinkoch sprostredkovaných ektoínom v keratinocytoch. Obrázok 4A ukazuje, že ektoín v závislosti od dávky a významne zvýšený pomer Nrf2/Keap-1 s maximálnym účinkom bol pozorovaný pri koncentrácii ektoínu 1,5 uM. Tiež sa pozorovalo, že 1,5 uM ektoínu podporovalo jadrovú translokáciu proteínu Nrf2 s maximálnou expresiou Nrf2 z frakcie jadrového proteínu pozorovanou v časovom bode 2 hodín (obrázok 4B). Tento účinok tiež podporili údaje získané z imunofluorescenčného farbenia buniek HaCaT (Obrázok 4D).

V ľudských melanocytoch a keratinocytoch Marrot et al. a iní vysvetlili dôležitosť obrannej dráhy Nrf2 v reakciách na fotooxidačný stres [32]. Študovali sme aj účinok expresie antioxidačného proteínu sprostredkovaného ektoínom v HaCaT bunkách. Naše údaje z časovej krivky ukázali, že expresia všetkých troch antioxidačných proteínov (HO-1, NQO-1, -GCLC) a Nrf2 sprostredkovaná ektoínom sa exprimuje dvojfázovým spôsobom s narastajúcim časom ({{ 8}}.5–12 h) s pozorovateľným účinkom bol zaznamenaný v časovom bode 4 h (obrázok 5A). Z toho sa získa krivka koncentrácie, ktorá meria účinok koncentrácie ektoínu naantioxidantexpresia proteínu bola tiež stanovená v časovom bode 4 hodín. Obrázok 5B ukazuje, že v porovnaní s neošetrenými bunkami liečba ektoínom zvýšila v závislosti od dávky expresiu HO-1, NQO-1, -GCLC proteínov. Tiež sme merali, ako koncentrácia ektoínu vykazovala ochranné účinky v HaCaT bunkách, ktoré boli vystavené UVA žiareniu. Údaje Western blot ukázali, že ektoín v závislosti od dávky zvýšil expresiu antioxidačných proteínov s dramatickou upreguláciou v pomere Nrf2/Keap-1 (obrázok 5C, D). Tieto výsledky ukázali, že predbežné ošetrenie ektoínom (1,5 uM, 4 h) má potenciálny účinok na vyvolanie expresie antioxidačného proteínu v HaCaT bunkách, čo by mohlo pôsobiť proti škodlivým účinkom spôsobeným vystavením UVA žiareniu.

antioxidant cistanche

5. Závery

Z vyššie uvedených údajov sme dospeli k záveru, že nízke koncentrácie ektoínu (0,5–1,5 µM) by mohli znížiť produkciu -MSH a melanínu prostredníctvom potlačenia POMC atyrozinázadráha v UVA ožiarených HaCaT bunkách, čo naznačuje jeho anti-melanogenézaúčinnosť. Okrem toho sa ektoín podieľal aj na potláčaní intracelulárnej produkcie ROS v HaCaT bunkách. Na rozdiel od buniek HaCaT boli vysoké koncentrácie ektoínu (50–400 µM) schopné vykazovať podobný účinok v melanómových bunkách B16F10, čo znamená, že keratinocyty by mohli hrať kľúčovú úlohu v ektoínom sprostredkovanom anti-melanogenézaa koža-bielenieúčinky v kožných bunkách. Najdôležitejšie je, že ektoín sprostredkovával priaznivé účinky prostredníctvom aktivácie dráhy Nrf2, ktorá indukuje expresiuantioxidantproteíny HO-1, NQO-1 a -GCLC. Ukázalo sa, že AKT je prvou signálnou dráhou, ktorá iniciuje aktiváciu Nrf2, po ktorej nasledujú ďalšie dráhy (p38, PKC a CKII). Nakoniec, umlčanie Nrf2 priamo poskytlo dôkaz, že Nrf2 hrá kľúčovú úlohu pri regulácii intracelulárneho ROS, ako aj produkcie -MSH. Dospeli sme k záveru, že hlavný bieliaci mechanizmus ektoínu by mal byť odôvodnený inhibíciou dráhy ROS-p53/POMC{10}}MSH v bunkách HaCaT ožiarených UVA žiarením. ktoré sa používajú ako potenciálna koža na prírodnej bázebielenieprostriedky v kozmetickom priemysle.

antioxidant cistanche doplnok