Imd kondenzáty regulované theaflavínom kontrolujú intestinálnu homeostázu a starnutie Drosophila, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Pozadie:Fibróza je jedným z najčastejších patologických znakov procesu starnutia obličiek a fibróza v starnúcich obličkách tiež zhoršuje proces chronického ochorenia obličiek (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C. flabellata, CF) je bežne používaná botanická droga v čínskom folklóre. Len málo štúdií však zaznamenalo jeho farmakologické účinky. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať účinok etanolového extraktu CF na renálnu fibrózu u myší SAMP8 a identifikovať potenciálne aktívne zlúčeniny.

Metódy:Myši náchylné na starnutie 8 (SAMP8) sa použili ako zvieracie modely a sondou sa podávali rôzne dávky CF počas jedného mesiaca. Pozorovať stupeň starnutia obličiek u myší pomocou -galaktozidázového farbenia. Massonovo farbenie a hladiny expresie Col-ll, a-SMA a FN sa použili na vyhodnotenie renálnej fibrózy u myší. Merali sa hladiny proteínovej expresie dráhy Nrf2 a dráhy Wnt/-katenín/RAS v obličkách. A -galaktozidáza (-gal) indukovala NRK-52E bunky ako in vitro model na skríning aktívnych zložiek CF.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Výsledky:CF etanolový extrakt významne inhiboval aktivitu renálnej galaktozidázy a hladiny expresie Coll, a-SMA a FNin SAMP8 myší a zlepšil Massonovo farbenie u SAMP8 myší. CF pozoruhodne znížila hladinu proteínu v moči, kreatinínu, močovinového dusíka a sérové ​​hladiny TNF-a a IL-1 u myší SAMP8 a významne zvýšila hladiny SOD a GSH-Px. Okrem toho CF aktivovala dráhu Nrf2 a blokovala dráhu Wnt/-katenín/RAS v obličkách myší. Okrem toho 3,4-dihydroxyfenyletanol (SDC-0-14,16) a (3,4-dihydroxyfenyletanol-8-0-[4-0-trans -kafeoyl- -D-apiofuranozy-(1→3)- -D-glukopyranozyl (1→6)]- -D-glukopyranozid (SDC-1-8) boli izolované z CF , čo znížilo starnutie buniek NRK-52E, a možno aj aktívne zložky CF, ktoré hrajú úlohu proti starnutiu.

Závery:Naše experimenty ukázali, že etanolový extrakt CF môže zlepšiť renálnu fibrózu u myší SAMP8 prostredníctvom dráhy Wnt/-katenín/RAS. A SDC-0-14,16 a SDC-1-8 môžu byť materiálnym základom pre CF na uplatnenie účinkov súvisiacich so starnutím obličiek.

Kľúčové slová:Starnutie, Corallodiscus flabellata, obličky, fibróza obličiek, SAMP8, starnutie, Wnt/-katenín/RAS

Úvod

Globálna prevalencia chronického ochorenia obličiek (CKD) sa zvyšuje so starnutím populácie a predstavuje významnú záťaž pre spoločnosť [1-3]. Najčastejším patologickým prejavom CKD je niektorá forma renálnej fibrózy[4]. Rovnako aj renálna fibróza je jedným zo znakov starnutia obličiek [2]. Štúdie ukázali, že oxidačný stres, zápal, Wnt/-katenín, renín-angiotenzín-aldosterónový systém (RAS) a signalizácia rapamycínu (mTOR) súvisia s CKD vyvolaným starnutím [5]. Renálna fibróza u starnúcich obličiek úzko súvisí s aktiváciou Wnt/-katenínu a signálnej dráhy RAS [6]. Po aktivácii Wnts sa -katenín v cytoplazme translokuje do jadra, kde sa viaže na lymfoidný zosilňovač-väzbový faktor (LEF)/skupinu transkripčných faktorov faktora T-buniek (TCF) a iniciuje transkripciu cieľových génov v smere transkripcie. Je zaujímavé, že promótorová oblasť génu RAS obsahuje aj väzbové miesta LEF/TCF, čo umožňuje -katenínu podporovať väzbu LEF-1 na tieto miesta[7].cistanche cholesterol,Zameranie sa na signálnu dráhu Wnt/-katenín/RAS by preto mohlo byť potenciálnou terapeutickou stratégiou pre renálnu fibrózu [8,9]. V posledných rokoch pritiahla pozornosť mnohých odborníkov substitučná liečba renálnej fibrózy prírodnými produktmi [10]. . Xiaoyan Shen et al. zistili, že ginsenosid Rgl zlepšil glomerulárnu fibrózu počas starnutia obličiek inhibíciou aktivácie zápalu NLRP3 u myší SAMP8 [11]. Táto štúdia skúmala účinok extraktu C. flabellate (CF) na renálnu fibrózu u myší SAMP8 z dráhy Wnt/-katenín/RAS.

Cistanche môže proti starnutiu

CF ako liečivá rastlina v Číne bola prvýkrát zaznamenaná v "Dian Nan Ben Cao. Celá rastlina sa bežne používa na liečbu úplavice, predčasnej ejakulácie, choroby semenných váčkov a choroby obličiek v oblastiach etnických menšín v Číne [12]. V súčasnosti , v modernom výskume existuje len málo správ o CF. Farmakologické štúdie v našom laboratóriu zistili, že extrakt CF mal diuretické účinky a zlepšil zlyhanie pečene a poškodenie mozgu u potkanov vyvolané lipopolysacharidom/D-galaktozamínom [13, 14] a fytochemické štúdie odhalila, že fenyletanoidové glykozidy a flavonoidy boli hlavnými chemickými zložkami CF [15,16].Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať účinok extraktu CF na renálnu fibrózu u myší SAMP8 a objasniť jej možný mechanizmus, aby bolo možné poskytnúť experimentálne dôkazy o liečbe ochorenia obličiek pomocou CF opísané v starých knihách.

Materiály a metódy

Zber a extrakcia rastlinného materiálu

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" zaznamenáva, že CF možno zbierať počas celého roka. CF rastliny použité v tomto experimente boli zozbierané v septembri v okrese Xixia, provincia Henan, Čína. Identifikoval ho profesor Suiqing Chen z Henanskej univerzity čínskej medicíny a vzorky boli uložené v laboratórnej knižnici vzoriek.vedľajšie účinky cistanche deserticolaRastliny (1 kg) sa refluxovali s 50 percentným etanolom (3 x 12 1, každú 1 hodinu) a zmes sa prefiltrovala cez 16 vrstiev gázy. Spojené filtráty sa vysušili rotačným odparovaním s použitím vymrazovacej sušičky. Nakoniec, percentuálny výťažok 50 percentného etanolového surového extraktu CF bol 15,5 percenta. Vysušený extrakt sa uchovával v chladničke až do ďalšieho použitia. V doplnkových materiáloch sú uvedené príslušné údaje o označení zložky extraktu CF.

V tejto štúdii bol použitý iný separačný proces, ktorý bol predtým uvedený, na získanie vodnej elučnej frakcie, 20 percent etanolovej elučnej frakcie, 30 percent etanolovej elučnej frakcie a 40 percent etanolovej elučnej frakcie z CF [13]. 40-percentná etanolová frakcia sa oddelila pomocou Sephadexu LH-20 a silikagélovej kolóny a čistila semipreparatívnou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC), aby sa nakoniec získali zlúčeniny ako SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60 (p-hydroxybenzylalkohol).

Zvieratá a podávanie

V tejto štúdii boli použité šesťmesačné samce myši SAMP8 a myši 1 (SAMR1) odolné voči starnutiu z First Affiliated Hospital of Tianjin University of Tradičná čínska medicína (Tianjin, Čína). Zvieratá boli chované v podmienkach kontrolovaného svetla (12-h cyklus svetlo/tma), teploty (23-25 stupňa C) a vlhkosti (45-55 percent) a dostávali štandardnú stravu a vodu. libitum. Celkovo 48 myší SAMP8 bolo rozdelených do štyroch experimentálnych skupín (n=12/skupina): Modelové myši SAMP8 (M), myši SAMP8 liečené nízkou dávkou CF etanolového extraktu (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastricky), myši SAMP8 so strednou dávkou CF etanolového extraktu (CF-M, 775 mg/kg, intragastricky) a myši SAMP8 liečené vysokou dávkou CF etanolového extraktu (CF-H, 1550 mg/ kg, intragastricky). Myši v kontrolnej skupine SAMRI (Con, n=10) a modelovej skupine SAMP8 (M) boli liečené fyziologickým roztokom (0,9 percenta). Všetky myši boli liečené perorálne počas 1 mesiaca. Všetky experimenty na zvieratách schválila etická komisia Univerzity čínskej medicíny v Henane a vykonali sa podľa inštitucionálnych smerníc (Henan, číslo schválenia v Číne: HACTCM-2018009060-19). Počas experimentu došlo k jednému úmrtiu myši v každej zo skupín Con a M a dve myši zomreli v skupine CF-H.

Zbierka vzoriek

Na konci experimentu boli myši umiestnené individuálne v metabolických klietkach na 12-h odbery moču. Myši sa potom anestetizovali izofluránom a vzorky krvi sa odoberali cez retroorbitálne krvácanie. Obličky z každej myši boli potom chirurgicky odstránené a udržiavané pri 80 stupňoch až do analýzy.

Bunková kultúra a in vitro štúdia

Bunky NRK-52E zakúpené od Bunkovej banky Čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína) boli kultivované, aby sa preskúmal účinok extraktu CF na starnutie buniek spôsobené D-galaktózou (D-gal, S11050, Yuanye, Šanghaj, Čína). Bunky NRK-52E boli pestované v Dulbeccovej modifikácii Eaglovho média Dulbecco (DMEM, 12 100 046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) s 10 percentným fetálnym hovädzím sérom v inkubátore pri 37 °C a v prítomnosti 5 percent , CO. Bunky boli pestované na 96-jamkových platniach alebo 6-jamkových platniach do 80-85 percentného konfluencie a potom ošetrené rastovým médiom obsahujúcim rôzne kombinácie liečiv: Médium plus D-gal ( 20 mg/ml）, médium plus D-gal plus CF（10, 25,50, 100 ug/ml） alebo médium plus D-gal plus monomérna zlúčenina） (10 μM） v tomto poradí) počas 48 hodín. MTT) test sa použil na detekciu životaschopnosti buniek a farbenie -galaktozidázou sa použilo na pozorovanie starnutia buniek.

Farbenie galaktozidázou spojené so starnutím

Zmrazené obličky myší narezaných na rezy s hrúbkou 10-μm a bunky NRK-52E boli zafarbené galaktozidázou spojenou so starnutím (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína) podľa protokolov výrobcu.

Histologická analýza

Rezy obličiek boli fixované 4 percentným pufrovaným paraformaldehydom a rezy zaliate do parafínu s hrúbkou 10-μm boli zafarbené Massonovým trichrómom (G10}06, Service, Wuhan, Čína) a pozorované mikroskopicky. Modro sfarbené oblasti v Massonových rezoch zafarbených trichrómom sa merali kvantitatívne zo šiestich náhodne vybraných polí a analyzovali sa softvérom Image-Pro Plus 6.0.

Biochemické merania

Vzorky sérového a obličkového homogenátu sa rozmrazili na izbovú teplotu a stanovili sa hladiny superoxiddismutázy (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Čína), glutatiónperoxidázy (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína), interleukín-1 (IL-1, RK00006, ABklonal, Wuhan, Čína), faktor nekrózy nádorov- (TNF-, RK00027, ABklonal, Wuhan, Čína), močovinový dusík (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína), kreatinín (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína) v myšom sére, celkový proteín v moči (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Čína) v moči myší a hladiny expresie kolagénu typu I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Čína), -aktín hladkého svalstva (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Čína), fibronektín (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Čína) v tkanivách myších obličiek sa merali postupne podľa protokolu výrobcu testovacej súpravy.

Imunohistochemická analýza

Imunohistochemická analýza bola vykonaná rutinnou metódou [17]. Použité protilátky zahŕňali nasledovné: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin (17565-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), receptory angiotenzínu II typu 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), erytroidný 2-faktor súvisiaci s p-nukleárnym faktorom 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo), pc-Fos (ab27793,Abcam,Cambridge, Spojené kráľovstvo ), rastový faktor spojivového tkaniva (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Čína). Rezy boli pozorované pod mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonsko).cistanche dávkovanie redditZmerajte plochu a integrovanú optickú hustotu (IOD) oblasti s opálením pomocou softvéru Image-Pro Plus 6.0 a vypočítajte strednú optickú hustotu (MOD, MOD=IOD/plocha) pre polo -kvantitatívna analýza.

Western blot analýza

Western blot test sa uskutočnil tak, ako je opísané v predchádzajúcej štúdii [18]. V stručnosti, obličkové tkanivá sa homogenizovali v lyzovacom pufri a kvantifikovali sa pomocou súpravy Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Čína). Homogenáty sa potom podrobili elektroforéze na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným, preniesli sa na polyvinylidénfluoridovú membránu a blokovali sa v blokovacom pufri (4 % odtučnené sušené mlieko) počas 90 minút. Potom boli inkubované s primárnymi protilátkami (Wnt4; renín; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelch-like ECH asociovaný proteín 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Čína); -aktín (AC026, Abclonal, Wuhan, Čína); a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Čína)) cez noc pri 4 stupňoch, po ktorej nasleduje inkubácia s vhodnou sekundárnou protilátkou konjugovanou s fluo-prítomnosťou počas 1 hodiny pri izbovej teplote . Požadované proteíny boli skenované IR skenerom Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) a intenzity signálu boli kvantifikované pomocou softvéru Image Studio. Hladiny proteínov boli normalizované voči -aktínu alebo GAPDH.

UPLC-Q-TOF-MS analýza vzoriek obličiek

Obličkové tkanivá sa odvážili a homogenizovali v ľadovo studenom fyziologickom roztoku (w/v =1:1). Potom sa do 200 ul vzoriek tkanivového homogenátu pridal 1 ml acetonitrilu, po čom nasledovala ultrazvuková extrakcia počas 30 minút. Extrakt sa centrifugoval pri 12,{7}} g a 4 stupňoch počas 10 minút. Supernatant sa odobral do liekovky na analýzu. Chromatografická separácia sa uskutočnila pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA), s LC systémom obsahujúcim kolónu Acclaim RSLC 120 C18 （2,2 μm, 2,1 x 100 mm; Thermo Scientific).výhody extraktu z cistancheMobilná fáza pozostávala z rozpúšťadla A (acetonitril) a vody s {{0}},1 % kyseliny mravčej (B). Separácia sa uskutočnila gradientovou elúciou takto:10-70 percent A od 0 do 3 minút, 70-78 percent A od 4 do 13 minút, 78-90 percent A od 14 do 14 minút 15 minút, 90 percent -10 percent A od 15 do 16 minút a 10 percent A od 16 do 20 minút. Injekčný objem testovanej vzorky bol 2 μl. Analýza hmotnostnou spektrometriou (MS) sa uskutočnila s použitím zdroja ESI za nasledujúcich podmienok: kapilárne napätie v pozitívnom režime bolo 3,5 kV a kapilárne napätie v negatívnom režime bolo 3,2 kV. Tlak rozprašovača bol 2,0 bar, teplota suchého plynu bola 230 stupňov a prietoková rýchlosť bola 8 l/min.

Štatistická analýza

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; na porovnanie medzi skupinami sa použila jednosmerná analýza rozptylu. Hodnota AP menšia ako 0,05 sa považovala za štatisticky významnú.

Výsledky

CF zlepšila starnutie a fibrózu obličiek u myší SAMP8

Aby sa preskúmal účinok CF na obličky myší SAMP8, aktivita SA- -gal sa merala v obličkách. Na obr. la je aktivita SA- -gal v tkanivách obličiek signifikantne zvýšená v skupine M (modré zvýraznenie). Podávanie CF-L a CF-M významne inhibovalo aktivitu -galaktozidázy v obličkách myší SAMP8, zatiaľ čo zlepšenie pomocou CF-H nebolo významné. Tiež obličkový index modelovej skupiny bol významne nižší ako u kontrolnej skupiny (obr. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF zlepšila funkciu obličiek, oxidačný stres a hladiny zápalu u myší SAMP8

Okrem toho sa testovali ukazovatele funkcie obličiek každej skupiny myší, ktoré zahŕňali objem moču u myší počas 12 hodín, hladiny Cr a dusíka močoviny v sére a hladiny bielkovín v moči. Ako je znázornené na obr. 2a-d, hladiny proteínu v moči, sérového Cr a dusíka v sére močoviny v modelovej skupine boli významne vyššie ako v kontrolnej skupine (obr. 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche džingischánĎalej sa skúmalo, či CF priaznivo moduluje oxidačný stres a zápal v obličkách rýchlo starnúcich myší. Ako je znázornené na obr. 2e-h, hladiny SOD a GSH-Pxin v obličkách skupiny M boli významne nižšie ako hladiny v skupine Con a hladiny IL-1 boli významne vyššie ako hladiny skupina Con. Po liečbe CF došlo k zlepšeniu uvedených ukazovateľov, lepší je najmä zlepšovací efekt CF-L a CF-M.

CF aktivovala dráhu Nrf2 v obličkách myší SAMP8

Hladina expresie p-Nrf2 sa merala v obličkových tkanivách, aby sa zistilo, či sa dráha Nrf2 podieľala na ochrannom účinku CF (obr. 3a-c) v tejto štúdii. Hladina expresie p-Nrf2 sa významne znížila v samotnej skupine SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF zoslabila aktiváciu signalizácie Wnt/-katenín/RAS v obličkách myší SAMP8

Aby sa ďalej preskúmal potenciálny mechanizmus CF s antifibróznym účinkom. Lokalizácia proteínu bola uskutočnená pomocou imunohistochémie. Ako je znázornené na obr. 4a, úroveň expresie Wnt4 a

-katenín bol indukovaný prevažne v renálnych tubulárnych bunkách. Podobné výsledky boli pozorované, keď sa hodnotili AGTR1, ciele downstreamovej dráhy Wnt signalizácie (obr. 4a). Potom sa kvantifikovala hladina proteínovej expresie a výsledky ukázali, že proteíny Wnt4, -katenín, renín a AGTR1 sa akumulovali v obličkovom tkanive myší v modelovej skupine, zatiaľ čo CF tieto zmeny významne inhibovala (obr. 4b-f ). Okrem toho bola tiež lokalizovaná a kvantitatívne analyzovaná hladina expresie CTGF. V súlade s vyššie uvedenými výsledkami sa CTGF exprimoval hlavne v renálnych tubuloch a CF výrazne inhibovala aktivitu CTGF (obr. 4d g).

CF a jeho zlúčeniny inhibovali starnutie buniek NRK{0}}E vyvolané D-gal

Bunky NRK-52E indukované D-gal sa použili na skríning určitých aktívnych zložiek v CF, aby sa určil materiálový základ pre liečbu senilných obličiek extraktom z CF. Výsledky ukázali, že CF zvyšuje životaschopnosť buniek v závislosti od dávky a zlúčenín

SDC-0-14,16 a SDC-1-8 izolované z CF mali lepšie účinky na bunkovú proliferáciu. Okrem toho, 25 ug/ml CF a zlúčeniny SDC-0-14,16 a SDC-1-8 všetky vykazovali účinok inhibície -galaktozidázovej aktivity (obr. 5).

CF zlepšená PCA analýza obličkového tkaniva u myší SAMP8 Bola vykonaná analýza hlavných zložiek (PCA), aby sa preskúmali účinky CF na myši SAMP8. Ako je znázornené na obr. 6a, medzi kontrolnou a modelovou skupinou bolo zrejmé zoskupenie (R2X=0.542; Q2=0.38), čo naznačuje, že endogénne metabolity myší SAMP8 sa líšili od SAMR1 myši, čo spôsobuje, že sa odchyľujú od skupiny SAMR1. Ako je znázornené na obr. 6b, rôzne skupiny CF sa tiež zoskupili do rôznych tried z kontrolnej a modelovej skupiny a skupiny CF sa posunuli bližšie ku kontrolnej skupine, čo naznačuje, že

endogénne metabolity myší SAMP8 intervenovaných CF boli podobné ako metabolity myší SAMR1.

Diskusia

V progresii CKD hrá dôležitú úlohu starnutie [19]. Ako fibróza CKD postupuje, senescentné bunky exprimujú a vylučujú profibrotické faktory (TGF-, CTGF atď.) a prozápalové faktory (IL-1, IL-6, TNF- atď. ), čo sú faktory sekrečného fenotypu spojené so starnutím, čím sa urýchľuje renálna fibróza [20, 21]. V súčasnosti tradičná čínska medicína dosahuje dobré výsledky v liečbe renálnej fibrózy s menším počtom vedľajších účinkov [22]. Táto štúdia skúmala intervenčné účinky extraktu CF na renálnu fibrózu u myší SAMP8. Myší kmeň vybraný pre túto štúdiu bol SAMP8, ktorý bol vyvinutý na základe dĺžky života, starnutia a skóre patologického fenotypového gradingu AKR/ myší a bol modelom zrýchleného starnutia výlučne genetického pôvodu [23,24]. Štúdie ukázali, že zmeny v renálnej patológii myší SAMP8 (9 mesiacov) zahŕňajú tubulointersticiálnu fibrózu a fokálnu segmentálnu glomerulosklerózu [25]. Zistilo sa, že renálna fibróza u myší SAMP8 súvisí s vekom [6]. Preto sme testovali aktivitu -galaktozidázy a

úroveň renálnej fibrózy u myší SAMP8 a zistili, že CF-L a CF-M zlepšili fibrózu obličiek a aktivitu -galaktozidázy u myší SAMP8 (obr. 1). A testovali sme aj výdaj moču myší. V súlade s predtým publikovanými štúdiami, ktoré naznačujú, že CF získaná dvoma rôznymi procesmi mala diuretické účinky [13], extrakt významne zvýšil objem moču myší SAMP8. Táto štúdia tiež ukázala, že suplementácia CF zlepšila funkciu obličiek, aktivitu antioxidačných enzýmov a hladiny zápalových faktorov u myší SAMP8 (obr. 2).

Systém Keap1-Nrf2 si v posledných rokoch získal pozornosť mnohých vedcov vďaka svojim antioxidačným a protizápalovým vlastnostiam. Jeho farmakologický potenciál pri liečbe ochorení obličiek bol dôkladne študovaný v neklinických a klinických štúdiách [26]. Nrf2 je hlavný transkripčný regulátor pre gény súvisiace s redoxným stavom a antioxidačnými účinkami [27]. Štúdie ukázali, že na aktiváciu Nrf2 a indukciu cieľového génu je potrebná fosforylácia [28]. Aktivácia Nrf2 zlepšila progresiu CKD prevenciou oxidačného stresu a udržiavaním bunkovej redoxnej homeostázy [29]. Ako kľúčový transkripčný faktor hrá Nrf2 kľúčovú úlohu v obrane proti oxidačnému stresu reguláciou svojich downstream antioxidantov a detoxikačných enzýmov [30]. Kim a spol. uviedli, že resveratrol ako silný aktivátor Nrf2 zlepšil progresívne poškodenie obličiek súvisiace so starnutím [31]. V tejto štúdii CF zlepšilo zoslabenie Nrf2 v obličkách myší SAMP8 bez ovplyvnenia hladiny expresie Keapl, čo naznačuje, že surový extrakt CF môže zlepšiť oxidačné poškodenie v obličkách aktiváciou dráhy Nrf2 (obr. 3).

Renálna fibróza je charakterizovaná nadmerným ukladaním extracelulárnej matrice (ECM), čo vedie k tvorbe jaziev v renálnom parenchýme [32]. Transformujúci rastový faktor- (TGF-) sa považuje za kľúčový cytokín pri nadmernej aktivácii fibroblastov [33, 34]. Samozrejme, zacielenie iba na signálnu dráhu TGF je nedostatočné na zníženie renálnej fibrózy. Niektoré štúdie ukázali, že CTGF, Wnt/-katenín, renín-angiotenzínový systém, oxidačný stres atď. sa podieľajú na renálnej fibróze [35-37]. Wnt/-katenín je evolučne zachovaná signálna dráha zapojená do regulácie tkanivovej homeostázy, vývoja orgánov a opravy poranení[38]. Cisternas a kol. diskutovali o profibróznom účinku Wnt signalizácie v kostrovom svale aj v obličkách [39]. Pribúdajúce dôkazy preukázali, že signálna dráha Wnt/-katenínu hrá kľúčovú úlohu pri regulácii vývoja a progresie renálnych fibrotických lézií po poranení [40-42]. Signál Wnt/-katenínu je v obličkách zdravých dospelých relatívne tichý a aktivuje sa, keď sú obličky vystavené rôznym druhom poškodenia [43].

U cicavcov má rodina Wnt najmenej 19 členov rodiny kritických pre vývoj obličiek. A najmenej 15 z týchto členov rodiny je rozdielne upregulovaných v starnúcej obličke, vrátane Wnt4 [6]. Výsledky tejto štúdie ukázali, že hladina expresie proteínu Wnt4 v obličkách myší SAMP8 bola významne vyššia ako u myší SAMR1, čo bolo overené tak Western blot, ako aj imunohistochemickými analýzami (obr. 4a, d a f). Zhodou okolností bola tiež zvýšená hladina expresie -katenínového proteínu. Wnt4 aj -katenín boli tiež exprimované v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách, ako sa ukázalo imunohistochemickou analýzou (obr. 4a a f). Wnt/-katenín vyvolal renálnu fibrózu indukciou viacerých fibrogénnych génov, ako sú zložky RAS, matrix metaloproteináza-7 (MMP-7), inhibítor aktivátora plazminogénu 1 (PAI{16}}) a slimák [37 ]. Zhou a kol. opísali Wnt/-katenín ako hlavný upstream regulátor, ktorý riadi expresiu všetkých testovaných zložiek RAS v obličkách [44]. Zhou et al. použili model 5/6 nefrektómie (5/6 NX) potkanov na zobrazenie hladín expresie hlavných zložiek RAS v mozgu a obličkách, ako je angiotenzinogén, angiotenzín-konvertujúci enzým a angiotenzín II AT{{25 }}receptor bol výrazne upregulovaný. Zvýšená hladina expresie bola inhibovaná centrálnym blokátorom Wnt, ktorým bol adeno-asociovaný vírusový vektor nadmerne exprimujúci gén DKK1 [45]. Podobne táto štúdia zistila, že AGTR1 bol stále exprimovaný v renálnom tubulárnom epiteli a hladiny expresie renínu a AGTRl v obličkových tkanivách myší SAMP8 boli významne vyššie ako hladiny u myší SAMR1 (obr. 4a a dg). Tieto výsledky ukázali, že signálna dráha Wnt/-katenín/RAS bola aktivovaná v obličkách myší SAMP8 a CF účinne inhibovala aktiváciu tejto dráhy.

CTGF vykonáva viaceré biologické funkcie, vrátane podpory mitózy chemotaktických buniek, indukcie adhézie a podpory bunkovej proliferácie a syntézy ECM [35,46]. CCN2(CTGF) moduloval Wnt signalizáciu väzbou na proteín 5/6 súvisiaci s lipoproteínovým receptorom s nízkou hustotou (LRP5/6), aby ďalej sprostredkoval fibrózu [39, 47]. Iné štúdie použili umlčanie génov na objavenie a potvrdenie, že Nrf2 reguluje dráhu Wnt reguláciou hladiny expresie CTGF, čo ovplyvňuje renálne intersticiálne ochorenie. Nrf2 tiež reguloval úroveň transkripcie CTGF hlavne prostredníctvom regulátora transkripcie CTGF c-Fos [48]. Imunohistochemická analýza odhalila, že CTGF a pc-Fos boli exprimované hlavne v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách a pc-Fos boli tiež distribuované v glomeruloch. Kvantitatívna analýza ukázala, že hladiny expresie oboch proteínov boli inhibované CF (obr. 3b a e a 4a a c). Nakoniec sa analýza PCA použila na ďalšie overenie, že CF zlepšila poškodenie obličiek u myší SAMP8 (obr. 6). Táto štúdia poskytla dôkaz, že CF nielen aktivovala signalizáciu Nrf2, ale spoliehala sa aj na Nrf2 na vyváženie oxidačného stresu a zápalu, inhibovala signalizáciu Wnt/-katenín/RAS a zlepšila starnutie obličiek a renálnu fibrogenézu. V tomto experimente sme však zistili aj nekonzistentné zlepšenie účinku CF na farbenie podľa Massona a SA{27}}gal. Predpokladá sa, že to môže byť spôsobené nekonzistentnou progresiou starnutia obličiek a renálnej fibrózy u myší SAMP8. Stupeň starnutia obličiek u myší v tomto experimente môže byť vážnejší ako fibróza. Preto zmierňujúci účinok CF-H na starnutie obličiek u myší SAMP8 nebol taký zrejmý ako účinok renálnej fibrózy.

Ako redukujúci monosacharid sa D-galaktóza široko používa pri rôznych ochoreniach súvisiacich s vekom in vivo a in vitro. Zistilo sa, že D-gal spôsobuje starnutie a poškodenie v bunkách NRK-52E [49], vyvoláva starnutie buniek proximálneho tubulárneho epitelu ľudskej obličky (bunky HKC-8) a zvyšuje hladiny expresie dvoch obličkových buniek markerové proteíny fibrózy FN a a-SMA [6]. V tejto štúdii sa D-gal použil na indukciu NRK-52E buniek in vitro. Pomocou MTT testu a farbenia -galaktozidázou na detekciu zlúčenín izolovaných z CF sa zistilo, že SDC-0-14,16 a SDC{13}} zvýšili životaschopnosť buniek indukovanú D-gal a inhibovali D-gal indukovanú starnutie buniek (obr. 5). Naznačovali, že SDC-0-14,16 a SDC-1-8 môžu byť materiálnym základom pre CF na oddialenie starnutia obličiek. SDC-1-8 je jeden z fenyletanoidných glykozidov. Zistilo sa, že fenyletanoidové glykozidy predlžujú životnosť Caenorhabditis Elegans [50], majú anti-aging, [51] a neuroprotektívne účinky [52-54]. Tieto poskytujú smer pre našu následnú štúdiu o farmakologických účinkoch CF.

Závery

Na záver, štúdie in vivo ukázali, že CF redukovala renálnu fibrózu u starších myší. Niektoré potenciálne aktívne zložky boli nájdené in vitro experimentmi. Tieto zistenia poskytli farmakologickú podporu pri liečbe ochorenia obličiek pomocou CF a smer pre ďalší výskum aktívnych zložiek CF.

Tento článok je prevzatý z Cao et al. BMC Complementary Medicine and Therapes (2022) 22:52