Načasovanie a ischemické účinky na fibrózu obličiek po kontralaterálnej nefrektómii

Úvod

Výskytakútne poškodenie obličiek(AKI) sa v posledných rokoch celosvetovo dramaticky zvýšil [1]. AKI môže byť v klinickej praxi spôsobená transplantáciou orgánov, pooperačnou perfúziou, krvácaním, dehydratáciou, šokom a sepsou [2]. Nedávne epidemiologické a experimentálne štúdie ukázali, že závažnosť, frekvencia a trvanie AKI sú úzko spojené s následným výskytomchronické ochorenie obličiek(CKD). Fibróza obličiek po AKI môže viesť k CKD alebo dokoncakonečné štádium ochorenia obličiek(ESKD) [3–5], z čoho vyplýva, že AKI a CKD sú spojené syndrómy [6]. Mechanizmy, ktoré sú základom prechodu z AKI na CKD, však zostávajú neznáme napriek mnohým experimentálnym a klinickým štúdiám. Zvieracie modely sú dôležitými nástrojmi na skúmanie mechanizmov, ktorými AKI vedie k CKD. Ischemicko-reperfúzne poškodenie obličiek (IRI) je jednou z hlavných príčin AKI a bolo vyvinutých niekoľko zvieracích modelov AKI vyvolaných IRI [7], vrátane bilaterálneho modelu IRI (bIRI), unilaterálneho modelu IRI s intaktnou kontralaterálnou obličkou , model uIRI so súčasnou kontralaterálnou nefrektómiou a model uIRI s oneskorenou kontralaterálnou nefrektómiou.

Model bIRI je menej konzistentný, pretože keď je ischemické poškodenie oboch obličiek príliš mierne, z dlhodobého hľadiska nedochádza k významným fibrotickým zmenám. Keď je AKI príliš závažné, myši môžu zomrieť vo fáze akútneho poranenia. Okrem toho malé rozdiely v poškodení oboch obličiek môžu po niekoľkých týždňoch viesť k významným rozdielom v ich chronickej obličkovej patológii [8,9]. Model uIRI so súčasnou kontralaterálnou nefrotómiou je podobný modelu bIRI, keďže v dôsledku nefrektómie na druhej strane zostáva iba poškodená oblička [10]. V modeli IRI s intaktnou kontralaterálnou obličkou je fibróza ischemickej obličky závažná [11,12]. Tento model je veľmi konzistentný a spoľahlivý pre dlhodobé pozorovanie výskumníkmi. Vzhľadom na prítomnosť kontralaterálnej nepoškodenej obličky ju však nemožno použiť na hodnotenie odhadovanej rýchlosti glomerulárnej filtrácie (eGFR), sérového kreatinínu (SCr) a dusíka močoviny v krvi (BUN) [11–14]. V porovnaní s dvoma modelmi uIRI uvedenými vyššie model uIRI s oneskorenou kontralaterálnou nefrektómiou prekonáva tieto problémy a možno ho použiť na dlhodobé pozorovania po AKI a monitorovaní funkcie obličiek. Preto je tento model vhodný na štúdium prechodu AKI-CKD [15].

KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE CISTANCHE EXTRAKT PREAKÚTNE PORANENIE OBLIČIEK

Napriek tomu rôzne ischemické stavy a interval medzi kontralaterálnou nefrektómiou a uIRI môžu mať významný vplyv na progresiu a závažnosť CKD po AKI. Predchádzajúce štúdie sa zamerali na vplyv trvania ischemickej choroby na fibrózu obličiek po AKI a nevenovali veľkú pozornosť telesnej teplote počas ischémie. Napríklad Skrypnyk a kol. [12] kontrolovali ischemickú teplotu pri 38 °C systémom vodného kúpeľa s ischemickým trvaním 30 minút a kontralaterálna intaktná oblička bola odstránená 8 dní po uIRI. Výsledok ukázal, že ischemická oblička mala významné fibrotické zmeny 28 dní po uIRI. Pri rovnakom ischemickom trvaní Xiao a spol. [8] ukázali, že k významným fibrotickým zmenám došlo 11 dní po UIRI, keď bola ischemická teplota kontrolovaná na 37 C 38 C a časový interval medzi UIRI a kontralaterálnou nefrektómiou bol 10 dní. Niektorí výskumníci, ako napríklad Colombaro et al. [14] a Li a kol. [16] vo svojich štúdiách nespomínali ischemickú teplotu.

Medzitým len málo ľudí skúmalo účinok časového intervalu medzi kontralaterálnou nefrektómiou a uIRI v tomto modeli, čo viedlo k značne rozdielnym výsledkom medzi rôznymi laboratóriami, čo tiež dramaticky ovplyvnilo nasledujúce experimenty. V tejto štúdii sme skúmali účinky hlavných faktorov ovplyvňujúcich fibrózu obličiek po AKI, vrátane časového intervalu medzi kontralaterálnou nefrektómiou a uIRI, telesnej teploty počas ischémie a trvania ischémie. Naším cieľom bolo poskytnúť odkaz na vytvorenie vhodného zvieracieho modelu na štúdium prechodu AKI CKD

Materiály a metódy Zvieracie modely

Samcom myší C57BL/6J (vo veku 8 až 10 týždňov, hmotnosť približne 22 g; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Čína) bol poskytnutý voľný prístup k potrave a vode v Centre experimentov na zvieratách na Shanxi Medical University. Podmienky chovu boli nasledovné: vlhkosť 40–70 %, teplota 23 C, trieda čistoty vzduchu 7, riadený 12-h cyklus svetlo/tma v podmienkach bez patogénov, ožarovanie Co60 v krmive a čistená voda. Všetky postupy pre túto štúdiu boli schválené Výborom pre etiku zvierat Druhej nemocnice lekárskej univerzity Shanxi (etické číslo: DW2022028).

Protokoly

Vzhľadom na to, že ischemické trvanie, telesné teploty počas ischémie a načasovanie resekcie kontralaterálnej neporanenej obličky môžu mať vplyv na závažnosť AKI a následnú fibrózu obličiek, skúmali sme účinky vyššie uvedených troch faktorov jednotlivo, pričom ostatné dva boli fixné. Boli uskutočnené tri experimenty nasledovne.

Protokol 1: Na pozorovanie účinku intervalu medzi kontralaterálnou nefrektómiou a uIRI na funkciu obličiek a fibrózu po AKI bol ischemický čas ľavej obličky fixovaný na 24 minút a telesná teplota bola fixovaná na 37 C počas obličky medzitým ischémia. Resekcia pravej obličky bola vykonaná na 7. deň, 10. deň a 14. deň (n ¼ 8 na skupinu) po IRI ľavej obličky. Dĺžku trvania ischémie a resekcie obličky sme určili na základe výsledkov predchádzajúcich štúdií [8,10,12,15] a našich predexperimentálnych výsledkov. Pozri obrázok 1 (A–C) pre protokol štúdie.

Protokol 2: Aby sa pozoroval účinok telesnej teploty počas ischémie na prechod AKI-CKD, ischemický čas ľavej obličky bol fixovaný na 24 minút a pravá oblička bola odstránená 14 dní po IRI ľavej obličky. Teplota telesného jadra bola kontrolovaná na 36 °C, 36,5 °C, 37 °C, 37,5 °C a 38 °C (n=8 na skupinu). Pozri obrázok 1(D) pre protokol štúdie.

Protokol 3: Na pozorovanie vplyvu trvania ischemickej choroby obličiek na prechod z AKI na CKD bola telesná teplota fixovaná na 37 °C počas ischémie a pravá oblička bola odstránená 14 dní po IRI ľavej obličky. Tento časový bod sme vybrali preto, že fibróza obličiek, ktorá bola typickou zmenou po AKI na CKD, bola podľa správ [8,10,12,15] a našich predexperimentálnych výsledkov veľmi zrejmá. Ischemický čas ľavej obličky bol kontrolovaný na 21 minút, 24 minút, 27 minút a 30 minút (n=8 na skupinu). Pozri obrázok 1(E) pre protokol štúdie.

Všetky myši boli usmrtené 8 týždňov po IRI ľavej obličky. Časť tkaniva ľavej obličky sa skladovala pri 70 °C pre následnú RT-PCR a analýzu western blot a druhá časť sa fixovala v neutrálnom formalíne na histopatologickú analýzu. Vzorky krvi sa odoberali cez retroorbitálny sínus na biochemické testovanie.

Obrázok 1. Protokoly unilaterálneho ischemicko-reperfúzneho poškodenia (uIRI) s oneskorenou kontralaterálnou nefrektómiou. (A–C): Ľavá oblička bola podrobená IRI v deň 0 a resekcia pravej obličky bola vykonaná v rôznych časových bodoch (deň 7, deň 10 a deň 14) s trvaním ischemickej choroby fixovaná na 24 min s telesnou teplotou fixovanou na 37 C počas ischémie obličiek. (D): Ľavá oblička bola podrobená IRI v deň 0 a resekcia pravej obličky bola vykonaná pri rôznych telesných teplotách (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C a 38 C) s ischemickou chorobou čas ľavej obličky fixovaný na 24 minút a pravá oblička bola odstránená 14 dní po IRI ľavej obličky. (E): Ľavá oblička bola podrobená IRI v deň 0 a resekcia pravej obličky bola vykonaná v rôznych ischemických časoch (21 minút, 24 minút, 27 minút a 30 minút) s telesnou teplotou fixovanou na 37 °C počas obličiek. ischémia a pravá oblička bola odstránená 14 dní po IRI ľavej obličky. Hmotnosť obličiek, funkcia obličiek, histologické poškodenie obličiek a fibróza obličiek sa hodnotili do 56. dňa.

Chirurgický postup

Pred operáciou všetky myši hladovali 12 hodín s voľným prístupom k vode a intraperitoneálne im bol injikovaný 3 % pentobarbital sodný 50 mg/kg. Počas anestézie bola rektálna teplota udržiavaná na 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C alebo 38 C, v tomto poradí, v rôznych experimentálnych skupinách. Aby sa to dosiahlo, bola myš umiestnená chrbtom na vyhrievaciu podložku (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, Čína) v polohe s hlavou a krkom natiahnutým, aby sa zabezpečilo, že jej dýchacie cesty ostanú zachované. bez prekážok a oči sa zakryli teplou gázou s fyziologickým roztokom, aby sa zabránilo vysychaniu počas procedúry. Po anestézii sa srsť na ľavej zadnej strane myši oholila strojčekom na srsť. Koža v operačnej oblasti sa potom utrela 75% alkoholovým tampónom. Vo všeobecnosti sa telesná teplota myši po holení srsti zníži. Chirurgický zákrok sa uskutočnil, keď sa telesná teplota stala konštantnou, čo mohlo trvať asi 15 minút. Ľavú obličku bolo možné vidieť narezaním ľavej dorzálnej kože 0,5 cm vedľa strednej čiary a 0,5 cm pri spodnom okraji hrudného koša myši. Potom sme jednou rukou stlačili ľavé brucho, aby sa ľavá oblička dostala von z telesnej dutiny, obličku sme nadvihli tupými zakrivenými kliešťami (dbali sme, aby sme nepoškodili obličku), oddelili obličkový pedikel a rýchlo ho upevnili a umiestnili svorku obličky pod kožou, aby bola teplá a zvlhčená. Úspešná ischémia bola charakterizovaná postupnou zmenou farby obličky z červenej na tmavofialovú, ktorá trvala 21 minút, 24 minút, 27 minút a 30 minút v rôznych experimentálnych skupinách. Farba obličiek sa zmenila späť na červenú v priebehu 2–5 minút po uvoľnení svorky. Potom sme brušnú dutinu uzavreli vrstvenými stehmi. Pravá dorzálna koža a sval boli narezané na 7. deň, 10. deň a 14. deň po uIRI v rôznych experimentálnych skupinách a pravá oblička bola resekovaná. Potom ranu zatvorte štandardnými stehmi. Po každom chirurgickom zákroku sa intraperitoneálne injikovalo 500 ul fyziologického roztoku, aby sa kompenzovala strata tekutín počas operácie. Zároveň bola myš držaná na vyhrievacej podložke asi 2 až 3 hodiny, kým nezískala plné vedomie a potom bola prenesená do klietky. Simulovaná skupina neusvorkovala obličkový pedikel a zvyšok chirurgických operácií bol rovnaký ako v skupine uIRI. Všetky chirurgické operácie vykonávala tá istá osoba s viac ako 2-ročnou praxou v prevádzke tohto modelu.

Test funkcie obličiek

Hladiny SCr boli merané pomocou súpravy Creatinine Kit (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Hladiny BUN sa merali pomocou súpravy Urea Kit (metóda ureáza-glutamát dehydrogenázy, Biosino Biotechnology and Science).

Test hmotnosti obličiek

Po močení sa telesná hmotnosť myší merala pomocou presnej elektronickej váhy. Čerstvé obličky sa trikrát prepláchli vo vopred vychladenom fyziologickom roztoku, potom sa prebytočná voda z obličiek odsala filtračným papierom. Obličkové kapsuly sa odlúpli na ľade a obličky sa ihneď odvážili. Pomer hmotnosti obličiek k telesnej hmotnosti sa vypočítal na vyhodnotenie korigovanej hmotnosti obličiek v mg/g.

Farbenie hematoxylín-eozín (HE) a skóre poškodenia obličiek

Neutrálne formalínom fixované obličkové tkanivá boli rutinne dehydratované, zaliate do parafínu, narezané (3 μm) a zafarbené HE, aby sa pozorovalo poškodenie obličkových tkanív. Desať náhodne vybraných polí kôry obličiek každého rezu bolo zachytených svetelnou mikroskopiou pri 400 zväčšení. Dvaja patológovia hodnotili poranenie glomerulov a obličkových tubulov oddelene. Tubulárne poranenie bolo hodnotené na škále {{20}}–4 pomocou nasledujúcich kritérií [17]: 0, žiadne zranenie; 1, postihuje 1–25 % oblasti obličiek; 2, postihuje 26–50 % oblasti obličiek; 3, postihuje 51–75 % oblasti obličiek; a 4, ktoré postihujú 75–100 % oblasti obličiek. Stupeň tubulárneho poškodenia sa hodnotil semikvantitatívne výpočtom plochy tubulárneho poškodenia obličiek. Glomerulárne poškodenie bolo hodnotené a hodnotené na škále 0–4 podľa percentuálnej oblasti mezangiálnej expanzie alebo sklerózy s použitím nasledujúcich kritérií [17]: 0, normálne glomeruly; 1, 1–25 % poranenej plochy; 2, 26–50 % poranenej plochy; 3, 51–75 % poranenej plochy; a 4, 76–100 % poranenej plochy. Konečné skóre poškodenia glomerulov ¼ 0 (% glomerulov 0. stupňa) þ 1 (% glomerulov 1. stupňa) þ 2 (% glomerulov 2. stupňa) þ 3 (% glomerulov 3. stupňa) þ 4 (% glomerulov 4. stupňa). Na jednu myš bolo zaznamenaných viac ako 50 glomerulov.

Massonovo trichrómové farbenie

Neutrálne formalínom fixované obličkové tkanivá boli rutinne dehydratované, zaliate do parafínu, narezané na rezy (3 μm) a zafarbené Massonovým trichrómom, aby sa pozorovala fibróza obličiek. V Massonových rezoch zafarbených trichrómom bolo zachytených dvadsať neprekrývajúcich sa polí obličkovej kôry pod 200-násobným zväčšením. Na automatické meranie a analýzu bol použitý softvér Image-Pro Plus Image Analysis. Percento fibrotickej oblasti sa použilo na zistenie úrovne obličkovej intersticiálnej fibrózy [8].

RT-PCR

Celková mRNA bola extrahovaná z obličkového tkaniva každej skupiny pomocou Trizolu a bola zmeraná jej koncentrácia, potom bola prevedená na cDNA (Taka Reverse Transscription Kit). Na kvantifikáciu expresie RNA fibronektínu (FN) a kolagénu I (COL-I) v tkanivách obličiek sa použila fluorescenčná metóda Taqman (TB Green Premix Ex Taq II RT-PCR v reálnom čase). Špecifické priméry boli použité pre FN (dopredu: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 a spätne: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30) a COL-I (dopredu: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} a naopak: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (poskytuje Sangon Biotech Co., Ltd., Šanghaj, Čína). Podmienky amplifikácie sú nasledovné: 95 °C počas 30 s, 95 °C počas 5 s, 60 °C počas 30 s, 40 cyklov; 95 °C po dobu 10 s, 65 °C po dobu 5 s a 95 °C/5 °C. Po analýze amplifikačných kriviek a kriviek rozpustnosti produktov sa stanovili relatívne hladiny mRNA komparatívnou CT metódou (2-DDCt) s 18SrRNA (dopredu: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 a naopak: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30) ako internou referenciou.

Western blot

Na lýzu obličkových tkanív sa použil lyzačný pufor pre rádioimunoprecipitačný test (RIPA) a koncentrácia proteínu sa stanovila metódou BCA. Na oddelenie proteínov z 50 lg vzoriek sa použila gradientová gélová elektroforéza. Potom sa proteíny preniesli na nitrocelulózovú membránu. Po blokovaní 5 % odtučneným mliekom počas 2 hodín sa membrány blotovali cez noc pri 4 °C králičou anti-myšou monoklonálnou protilátkou proti a-aktínu hladkého svalstva (a-SMA) (1:1000, č. 19245, Cell Signaling Technology ), FN (1:1000, č. ab2413, ABCam), alebo COL-I (1:1000, č. 72026, Cell Signaling Technology). Nasledujúci deň sa membrány znova zahriali na teplotu miestnosti počas 0,5 hodiny. Po premytí TBST boli membrány inkubované s HRP konjugovaným AffiniPure kozím anti-králičím IgG(H+L)(1:1000, č.BA1054, BOSTER Biological Technology) počas 2 hodín. Po opätovnom premytí TBST sa zafarbili ultra-vysoko citlivým ECL chemiluminiscenčným činidlom na vizualizáciu imunoblotov. b-aktín sa meral na rovnakej membráne ako vnútorná referencia. Proteínové expresie boli stanovené kvantifikáciou relatívnych expresií cieľových proteínov oproti b-aktínu.

Dáta a štatistická analýza

Všetky skúmané údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. Porovnania medzi týmito dvoma skupinami boli získané nezávislým t-testom. Porovnania medzi viacerými skupinami sa získali pomocou jednosmernej ANOVA, keď je distribúcia údajov normálna a rozptyl je homogénny, na posúdenie štatistickej významnosti, keď bol rozptyl heterogénny, sa použila Welchova ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test na viacnásobné porovnania. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softvéru GraphPad Prism 8.0. p < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.