Tolerancia NADH/NAD plus nerovnováha predvída starnutie a zásahy proti starnutiu

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

SÚHRN

Redoxné páry koordinujú bunkovú funkciu, ale dôsledky ich nerovnováhy sú nejasné. To je trochu spojené s obmedzeniami ich experimentálnej kvantifikácie. Tu obchádzame tieto ťažkosti predložením prístupu, ktorý charakterizuje profily tolerancie založené na fitness pre nerovnováhu redoxných párov pomocou silikónovej prezentácie metabolizmu. Zamerajúc sa na redoxný pár NADH / NAD1 v kvasinkách, demonštrujeme, že redukčné nerovnováhy vytvárajú metabolické syndrómy porovnateľné s tými, ktoré sa pozorujú v rakovinových bunkách.výhody extraktu z cistancheTolerancia kvasinkových mutantov voči redoxnej nerovnováhe môže tiež vysvetliť 30 percent variability v ich experimentálne meranej chronologickej životnosti. Okrem toho predpovedaním významu niektorých metabolitov, ktoré pomáhajú vyrovnať sa s nerovnováhou, správne identifikujeme živiny, ktoré sú základom mechanizmov patológie, molekuly chrániace životnosť alebo mimetiká na obmedzenie kalórií. Tolerancia voči redoxným nerovnováham sa týmto spôsobom stáva zvukom poskytujúcim rámec na rozpoznanie vlastností fenotypu starnutia, pričom je v súlade s biologickým odôvodnením hodnotenia zásahov proti starnutiu.

ÚVOD

Výskum redoxnej homeostázy sa za posledné dve desaťročia podstatne rozšíril a neustále pretváral klasické predstavy o oxidačnom poškodení buniek (Halliwell a Gutteridge, 2015). Medzi najparadigmatickejšie molekulárne činidlá, ktoré sú základom tejto homeostázy, sa objavujú pomery redoxných párov, ako sú pomery konjugovaných foriem glutatiónu, NADPH a NADH. Glutatión aj NADPH pôsobia ako nevyhnutné mechanizmy zachytávania reaktívnych foriem kyslíka (ROS) v mitochondriách, zatiaľ čo NADPH a NADH spájajú anabolické a katabolické dráhy s redoxným stavom bunky.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Napriek tomu sa naďalej uznávajú nové mechanizmy spájajúce páry NADPH/NADP* a NADH/NAD* s redoxnou homeostázou. Napríklad rovnováha NADPH/NADP plus čiastočne vysvetľuje dôsledky proteínkinázy aktivovanej AMP na prežitie (She et al., 2014). Tiež spája cirkadiánne meranie času s redoxnými stavmi (Rey et al., 2016). V súčasnosti sa predpokladá, že pomer NADH/NAD plus sa podieľa na koordinácii mitochondriálnej a jadrovej funkcie, epigenetickej regulácii opravy DNA a bunkovej identity a vyladení energetického metabolizmu na premenné prostredia (Canto et al., 2015; Gomes et al. 2013). V nepatologických podmienkach pomer NADH/NAD* kolíše s napätím kyslíka, pričom hypoxické podmienky a vyššia dostupnosť kyslíka sa zodpovedajúcim spôsobom vyskytujú súčasne s redukčnými a oxidačnými odchýlkami (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Ale rastúci záujem o redoxné párové pomery pochádza hlavne z ich dôsledkov v patológii.cistanche džingischánVýskyt ROS v redukčných (hypoxických, náchylných na NADH) aj oxidačných (hyperoxických, NAD plus náchylných) zmysloch súvisí s odchýlkami od optimálneho redoxného potenciálu, ktorý zabezpečuje najlepší výkon mitochondrií (Aon et al., 2010 Clanton, 2007). Pokiaľ ide o rakovinu, znížená NADH/NAD plus môže byť základom letality glioblastómov (Gujar et al., 2016) a podporovať progresiu rakoviny hrubého čreva (Hong et al., 2019), ale môže tiež zachrániť niektoré zdravé fenotypy v rôznych stupňoch v bunkách pred iné typy nádorov (Garrido a Djouder, 2017).

Cistanche môže proti starnutiu

NADH sa stala aj bodom záujmu biológie v Toronte. V tejto súvislosti viedlo rozšírenie skupiny NAD plus k čiastočnému zvráteniu starnutia a iných súvisiacich patologických fenotypov v organizmoch (Das a kol., 2018; Mendelsohn a Larrick, 2014; Wei a kol., 2017; Zhu a kol. , 2017) a zistilo sa, že senescentné a neoplastické bunky vykazujú nerovnováhu v pomere NADH/NAD plus (Braidy a kol., 2011; Schwartz a Passonneau, 1974; Wiley a kol., 2016). Okrem toho novoobjavené úlohy NADPH a vznikajúci koncept NADH/NADH ako hlavného regulátora redoxnej homeostázy a starnutia sú v súlade s teóriou metabolickej stability starnutia (Demetrius, 2004). Táto teória navrhuje, že príčinou starnutia je zraniteľnosť rovnovážnych hladín redoxných párov voči náhodným environmentálnym poruchám rýchlosti enzýmových reakcií a prináša niekoľko zaujímavých predpovedí, ktoré sa vzťahujú na ľudí.

Vzhľadom na všetky tieto dôsledky mnohé štúdie skúmali fenomenológiu pomerov redoxných párov buď pasívnym hlásením ich hladín, alebo ich aktívnou modifikáciou. Experimentálne manipulácie sú však náročné. Najtradičnejšie obviňujúce hlboké experimentálne výhrady (Sun et al., 2012) a novšie stále chýbajú určité biologické okolnosti, pretože sú obmedzené na intervaly teploty a pH (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Okrem toho je experimentálne nákladné monitorovať širokú škálu fenotypov po zmene koenzýmových zásob doplnením metabolitov (Hou et al., 2010) a mutáciami alebo nadmernou expresiou enzýmov spotrebúvajúcich NAD(H) (Bait al., 2011; Felipe a kol., 1998). Existuje teda potreba alternatívnych stratégií na riešenie kontroly redoxnej homeostázy prostredníctvom manipulácie s redoxnými pármi, ako aj nášho chápania biologických dôsledkov tejto kontroly.

Modely in silico sa stávajú praktickou výskumnou stratégiou vždy, keď sú experimentálne prístupy obmedzené, s výhodou umožňujúcou úplný mechanistický popis pozorovaných javov. Metabolické modely na úrovni genómu, ktoré je možné študovať prostredníctvom analýzy flux balance (FBA) (Orth et al, 2010), sa stali štandardom v systémovej biológii na štúdium dôsledkov metabolických porúch na bunkovú funkciu (metódy S1). Okrem iného prispeli k objaveniu nových antibiotík a chemoterapeutík, návrhu bakteriálnych kmeňov optimalizovaných na priemyselnú výrobu záujmových látok a lepšiemu pochopeniu ľudských metabolických ochorení (Burgard a kol., 2003; Pagliarini a kol. 2016; Raman a kol., 2009). Použitie FBA má ďalšiu výhodu v tom, že poskytuje pohľad na metabolické javy bez vplyvu nemetabolických mätúcich faktorov (genetických, epigenetických, mechanických atď.). Metabolické modely na úrovni genómu sú teda obzvlášť vhodné na skúmanie metabolických dôsledkov odchýlok od redoxnej homeostázy.

Tu používame FBA na sondovanie rovnováhy redoxných párov na rekonštrukcii jednobunkového eukaryota Saccharomyces cerevisiae na úrovni genómu, čím charakterizujeme metabolické dôsledky a dôsledky súvisiace s dlhovekosťou riadenej poruchy dostupného NADH/NAD plus toku naprieč rôznymi genetickými faktormi. pozadia. Konkrétnejšie, naše výsledky odhaľujú, že tolerancia k tejto nerovnováhe vedie k špecifickému metabolickému presmerovaniu pripomínajúcemu patológiu a tiež vysvetľuje viac ako štvrtinu intrašpecifickej variability v postmitotickej dĺžke života. Okrem toho nám tento rámec pomáha načrtnúť výpočtový protokol (ktorý aplikujeme aj na zvieracie a ľudské metabolické modely) na identifikáciu metabolitov a enzýmov s potenciálom ako terapeutických cieľov v kontexte patológií súvisiacich s vekom.

VÝSLEDKY

Profil tolerancie založený na kondícii charakterizuje poruchy redoxného páru

Aby sme reprezentovali nerovnováhu medzi konjugovanými formami redoxného páru, začlenili sme umelú reverzibilnú reakciu - "nerovnovážnu reakciu" - do rekonštrukcie zodpovedajúcej metabolickej siete na úrovni genómu (metódy STAR). Reakcia oxiduje alebo redukuje pár, pričom sa berú do úvahy špecifické bunkové kompartmenty (napr. cytosol, mitochondrie atď.) a jej aktivita môže byť fixovaná na akúkoľvek požadovanú hodnotu rýchlosti. Pre ktorúkoľvek z týchto hodnôt je možné vypočítať rýchlosť rastu ("fitness"), ktorá funguje ako náhrada za toleranciu kvasinkových buniek na daný konkrétny stav. Nakoniec je profil tolerancie definovaný výpočtom rýchlosti rastu pre určitý rozsah hodnôt nerovnováhy (obrázok 1A; všimnite si, že redukčné/oxidačné podmienky sú v celom rukopise znázornené modrou/červenou farbou).

Profily tolerancie typicky vykazujú maximálny rast okolo nulového bodu nerovnováhy, pričom zhruba akákoľvek odchýlka (tj nenulová hodnota reakcie) vedie k zníženej kondícii. To zdôrazňuje skutočnosť, že na to, aby metabolizmus fungoval, musí byť aktivita reakcií, ktoré vylaďujú pomer redoxných párov v jednom zmysle, úmerná aktivite tých, ktoré ho vylaďujú v druhom zmysle. Konkrétnejšie, cytosolické nerovnováhy NADH/NADt u S.predĺženie života cistanchecerevisiae rastúce v glukóze a aeróbnych podmienkach poskytujú profil s maximálnym rastom výrazne posunutým smerom k oxidačnej strane v bode profilu nerovnováhy, kde sa ~ 50 mmol/DW/hodinu NADH premieňa na NADH (obrázok 1B). Keď namiesto toho zvažujeme nerovnováhu v mitochondriách, pozorovali sme maximum v bode nulovej nerovnováhy (obrázok 1C), čo je vzor, ​​ktorý sme podobne pozorovali v iných profiloch (obrázok S1). Vo všeobecnosti sa stávajú redukčné podmienky

Obrázok 1. Profil tolerancie charakterizuje reakciu na redoxné nerovnováhy

(A) Hore. Zaviedli sme umelú reakciu v modeli metabolickej rekonštrukcie organizmu (v tomto prípade kvasiniek) na vzájomnú premenu dvoch konjugovaných foriem redoxného koenzýmu (tu pár NADH/NADH). Pri každej zo série podmienok nerovnováhy, tj hodnôt rýchlosti umelej reakcie, aplikujeme analýzu rovnováhy toku na výpočet rýchlosti rastu. Spodná časť. Predpovedané hodnoty rastu sú vynesené oproti hodnotám miery nerovnováhy, ktorá vymedzuje profil tolerancie; zástupný znak tolerancie metabolizmu, keď čelíme zvolenej poruche.cistanche nz(B) Profil tolerancie v kvasinkách spojený s nerovnováhou lokalizovanou v cytosóle.

(C) Profil tolerancie v kvasinkách spojený s nerovnováhami lokalizovanými v mitochondriách. Modré/červené tieňovanie predstavuje režimy zníženej a oxidovanej nerovnováhy a sivé bodky označujú hodnoty zodpovedajúce žiadnej nerovnováhe alebo extrémnej redukčnej/oxidačnej nerovnováhe, ktorá nespôsobuje rast. škodlivé a smrteľné rýchlejšie ako oxidačné režimy. V dvoch prípadoch (konjugované páry cytosolického NADH alebo mitochondriálneho tioredoxínu) mierna umelá oxidácia páru zlepšuje rast (obrázok S1).

Porucha NADH/NAD* spôsobuje metabolické syndrómy, ktoré pripomínajú patológiu

Energetický metabolizmus kvasiniek bez nerovnováhy zodpovedá charakteristickému aeróbnemu metabolizmu v prítomnosti glukózy (študované podmienky rastu), v ktorom je glykolýza spojená s cyklom trikarboxylových kyselín (TCA) a oxidačnou fosforyláciou. Pentóza fosfátová dráha oxiduje glukózu a poskytuje ribózu-5P pre syntézu nukleotidov a redukčnú silu z NADPH pre anabolizmus, zatiaľ čo anaplerotické cesty opúšťajú cyklus TCA, podobne ako metabolizmus glutamínu, sú stredne využívané na primárne podávanie pyrimidínu a syntéza aminokyselín. FBA nám umožňuje kvantifikovať zmeny v týchto dráhach a ako nakoniec podrobne popisujú metabolické vlastnosti, ktoré sú základom akéhokoľvek konkrétneho režimu nerovnováhy.

Konkrétne obrázok 2A ukazuje, ako redukčné nerovnováhy cytosolického NADH / NADH vyvolali zvýšenie glykolytického toku, zníženie aktivity cyklu TCA a elektrónového transportného reťazca a zvýšenie metabolizmu glutamínu. Tento pseudohypoxický metabolický podpis – v prítomnosti kyslíka – pripomína anaeróbny metabolizmus, kde je glykolýza spojená s alkoholovou alebo mliečnou fermentáciou na úkor mitochondriálnych dráh; kyslíková časť pentózofosfátovej dráhy je vypnutá a metabolizmus glutamínu, ktorý je aktívnejší, môže byť presmerovaný na produkciu pyruvátu okrem toho, že prispieva k anabolizmu. Tento fenotyp predovšetkým zachytáva niektoré črty paradoxného metabolizmu výťažku pozorovaného v rôznych typoch rakovinových buniek (Warburgov efekt) (Potter et al., 2016).

Obrázok 2. Toky hlavných ciest energetického manažmentu, ktoré sú základom profilu tolerancie u kvasiniek (A) Cytosolická nerovnováha NADH/NAD (hore) a hodnoty toku piatich reprezentatívnych ciest (dole); i/glykolýza (glykolýza, jadro), ii/Krebsov cyklus (TCA, ružová), fosforečnan ili/pentóza (Penphos, zelená), iv/oxidačná fosforylácia (Oxphos, sivá) a metabolizmus glutamínu (glutamín, fialová). Reprezentované vektory toku sú výsledkom spriemerovania toku všetkých reakcií konkrétnej dráhy.

(B) Rovnako ako (A), pokiaľ ide o mitochondriálnu nerovnováhu. Všimnite si, že prítomnosť negatívnych tokov v glykolýze (panel A, dole) predstavuje zvýšenú glukoneogenézu. Podrobnosti nájdete v hlavnom texte.

Na rozdiel od toho, energetický metabolizmus, ktorý je základom oxidačnej tolerancie (vzhľadom na cytosól, obrázok 2A) vykazoval viac aeróbnu konfiguráciu, ale so zvláštnosťami, ako je obzvlášť aktívny metabolizmus polyamínov; a extrémne vlastnosti, vrátane zvýšenej glukoneogenézy, oxidačnej fosforylácie a aktivity cyklu TCA, ako aj veľmi vysoký (až 12-násobok normálnej hladiny) tok cez pentózofosfátovú dráhu. Ten môže byť napriek tomu artefaktom rozdielov v pseudoreakcii biomasy pri veľmi vysokej (viac ako 55 mmol/gDW/h) oxidačnej nerovnováhe (pozri metódy S1).

Keď sa nerovnováha nachádza v mitochondriách, zníženie NADH opäť vyvolalo určité pseudohypoxické správanie s jedným rozdielom (obrázok 2B). Tok cez glykolýzu a metabolizmus glutamínu sa zvýšil so súčasnou stratou častí cyklu TCA a pentózofosfátovej dráhy. Na rozdiel od cytosolického prípadu sa však oxidatívna fosforylácia výrazne zvýšila. Na druhej strane, oxidačná stránka mitochondriálneho profilu bola viac idiosynkratická: glykolytická aktivita sa zvýšila paralelne s cyklom TCA, ale oxidatívna fosforylácia fungovala z väčšej časti na nižších úrovniach ako normálne a metabolizmus glutamínu mal malý význam,

Metabolické syndrómy sú výsledkom kompromisu medzi redoxnou rovnováhou, produkciou biomasy a kompromisom medzi ATP/NADH

Identifikovali sme niekoľko kľúčových prvkov v hre, ktoré formovali predchádzajúce syndrómy.veľkosť penisu cistancheOxidačná perturbácia sa stretla s exacerbovanou aeróbnou odozvou ako kompromisom medzi udržiavaním rastu a vyrovnávaním narušenia nerovnováhy. To zahŕňalo presmerovanie toku cez maximálny možný počet reakcií, ktoré znížili NAD plus pri zachovaní globálnej distribúcie toku, ktorá bola schopná generovať zložky biomasy. Tieto dva mechanické prvky (pufrovanie porúch a maximalizácia biomasy) sú najdôležitejšími požiadavkami optimalizačného problému a postačujúce na opísanie oxidačného režimu profilu tolerancie.

Obrázok 3. Konkurenčné mechanizmy spôsobujú pseudohypoxické správanie kvasiniek

(A) Rovnováha medzi produkciou NADH, ATP a prekurzorov biomasy uprednostňuje reakčné moduly, ktoré produkujú toľko ATP a čo najmenej NADH, aby sa kompenzovali dôsledky redukčných režimov, napr. použitie glykolýzy na TCA. Všimnite si, že fialové šípky predstavujú produkciu ATP, žlté šípky predstavujú produkciu NAD(H) a biele kruhy označujú tvorbu prekurzorov biomasy, (B) Porucha NADH/NADt náchylná na NADH (os x) sa prekrýva s umelým ADP. fosforylačná reakcia (os y), ktorá násilne zavádza redukčnú silu vo forme ATP do nevyváženého metabolizmu. Zelený farebný gradient predstavuje pomer medzi glykolytickým tokom a tokom Krebsovho cyklu normalizovaný jeho normálnou hodnotou (až do 100-násobku). Možno si uvedomiť, že fosforylácia ADP znižuje pseudohypoxický fenotyp a oneskoruje pokoj.

Reduktívna strana si však vyžadovala jeden dodatočný pohľad. Keďže stále viac a viac NADH sa sekvestruje do reakcií NADH, ktoré využívajú NADt a sú priamo alebo nepriamo nevyhnutné na produkciu zložiek biomasy, sú stále viac a viac obmedzené, takže energetický metabolizmus musí byť presmerovaný, aby sa umožnila zvýšená konverzia NADH na NAD' a aby sa obmedzil zníženie NAD'na NADH. To je stále nedostatočné na to, aby sme čelili poruchám, pretože väčšina redukčnej sily vo forme NADH je v podstate zbytočná pre mnohé metabolické ciele, reakcie a rast: energia uložená v NADH sa musí prerozdeliť do ADP. Metabolizmus teda musí uprednostňovať reakčné moduly, ktoré produkujú čo najviac ATP a čo najmenej NADH; musí sa spoliehať na skraty a cesty, ktoré majú vysoký výťažok ATP/NADH, napr. glykolýzu a oxidačnú fosforyláciu.

Výsledkom je okrem iného znížený cyklus TCA a zvýšený glykolytický tok (obrázok 3A). Aby sme ďalej preskúmali vplyv tohto kompromisu ATP/NADH, prekryli sme redukčnú poruchu NADH/NAD umelou reakciou, ktorá umožňuje fosforyláciu ADP. . Simulácie ukázali, že zvýšený pomer toku cyklu glykolýzy k TCA, ktorý charakterizuje redukčný metabolizmus, závisí od výťažku ATP/NADH

Obrázok 4. Skóre tolerancie ako prediktor chronologickej dĺžky života u kvasiniek

(A) Profily tolerancie získané pre kvasinkové mutanty; modré/červené sektory krivky predstavujú redukčný/oxidačný režim nerovnováhy NADH/NADH.

(B) Asociácia medzi normalizovaným skóre tolerancie (úmerné šírke hodnôt nerovnováhy v oxidačnom aj redukčnom režime, metódy STAR) a chronologickou životnosťou. Korelácia vysvetľuje ~ 30 percent celkového rozptylu (R'= 0). 29, p-hodnota=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Ako alternatívny spôsob zobrazenia tejto asociácie sme získali histogram hodnôt regresného sklonu získaných z desaťtisíc náhodne generovaných asociácií medzi skóre tolerancie a dĺžkou života. Z tejto vzorky nájdeme len 3 prípady, v ktorých je súvislosť medzi skóre tolerancie a údajmi o dĺžke života silnejšia ako tá, ktorá bola nájdená (označená červenou zvislou čiarou).

(Obrázok 3B). Silná fosforylácia ADP znižuje tento pseudohypoxický podpis aj napriek veľmi silným mieram nerovnováhy náchylnej na NADH.

Tolerancia vysvetľuje experimentálne rozdiely v chronologickej životnosti medzi rôznymi kvasinkovými mutantmi

Pýtali sme sa, do akej miery by mohol profil tolerancie pôsobiť ako prediktor dĺžky života, vzhľadom na to, že redoxné páry boli diskutované ako potenciálne determinanty dĺžky života. Jedným zo spôsobov, ako to študovať, je vypočítať profil v rôznych mutantoch (obrázok 4A) a potom kvantifikovať, ako to zodpovedá presným mieram životnosti, normalizovaným chronologickým dĺžkam života (CLS), dostupným z experimentálne nameraných kriviek prežitia mutantov (Garay et al., 2014). CLS sa vypočítajú z týchto kriviek prežitia mutantov ako zvýšenie prežitia v stacionárnej fáze v porovnaní s divokým typom.

V FBA sa mutácie v špecifických génoch simulujú obmedzením toku reakcií, ktoré sú s nimi spojené, pomocou booleovských pravidiel, ktoré spájajú každú chemickú reakciu s ORF, ktoré sa prekladajú pre enzým reakcie (metódy STAR). Pre každý z týchto mutantov sme vypočítali profil tolerancie mutantov (obrázok 4A) a použili sme súčet absolútnych hodnôt nerovnováhy, pri ktorých je rýchlosť rastu polovičná (v redukčnom aj oxidačnom režime) ako skalárne skóre tolerancie (STAR metódy).

Náš súbor mutantov bol však obmedzený niektorými obmedzeniami (metódy STAR). Predovšetkým sme neboli schopní rozlíšiť rozdiely v tolerancii pod 10 ppm od hodnoty divokého typu bez dosiahnutia obmedzujúcich výpočtových časov a mnohé mutanty vykazovali zanedbateľné rozdiely v dĺžke života a zanedbateľné rozdiely v tolerancii. Okrem toho sa všeobecne predpokladá, že FBA nie je schopný charakterizovať delécie so ziskom funkcie a celkom predvídateľne žiadne tolerancie mutantov neprevyšujú tolerancie divokého typu.

Okrem týchto obmedzení boli profily tolerancie in silico schopné vysvetliť -30 percent experimentálne nameranej variability životnosti (obrázok 4B, R2= 0.29, N=41, hodnota p{{5 }}.2x 10-) s veľkou významnosťou:10,000 randomizácie párov údajov viedli iba k 3 prípadom s väčším sklonom regresie (obrázok 4C).

Konvenčné živiny umožňujú toleranciu nerovnováhy NADH/NADH

Nakoniec sme skúmali, či špecifické dietetické metabolity boli obzvlášť určujúce v reakcii na redoxnú nerovnováhu. Na tento účel sme využili doplnkovú vlastnosť modelov FBA, ktorou je možnosť prístupu k využitiu konkrétneho metabolitu (definovaného ako rýchlosť spotreby v ustálenom stave, metódami STAR). Skúmali sme, ako sa táto rýchlosť menila so zvyšujúcimi sa hodnotami redukčnej a oxidačnej NADH/NAD plus nerovnováhy.

Použitie bolo skôr lineárne na oboch stranách profilu a pre väčšinu metabolitov. Tento meniaci sa vzor sme teda prispôsobili lineárnemu modelu a považovali sme (absolútny) sklon za skalárneho predstaviteľa relevantnosti zodpovedajúceho metabolitu pre tolerovanie redoxnej nerovnováhy (obrázok 5A). Medzi najlepšie reagujúce živiny iAZ900 sme si všimli metabolity v potrave, o ktorých je známe, že hrajú rozhodujúcu úlohu pri regulácii životnosti kvasiniek, ako je acetát (Burtner et al., 2009), ako aj mnohé, ktoré experimentálne predlžujú životnosť kvasiniek, červov, atď. alebo dokonca ľudské bunky (Madeo a kol., 2018; Mishur a kol., 2016) vrátane malátu, hydroxybutyrátu, spermidínu alebo oxaloacetátu (obrázky 5B-5D, tabuľka S1).

Niektoré živiny boli relevantnejšie pre toleranciu voči NADreduction, iné pre NADHoxidáciu a niekoľko pre oba tieto režimy. Najdôležitejšie metabolity v potrave pre redukčnú toleranciu boli v poradí acetát, beta-hydroxybutyrát (BHB), glutamát a glutamín (obrázok 5B), zatiaľ čo najdôležitejšie pre toleranciu oxidácie NADH boli acetát, NADP plus, putrescín a spermidín. (Obrázok 5D). Medzi tými, ktorí sa podieľali na tolerancii na oboch stranách profilu, bol najrelevantnejší v poradí acetát, glutamát, oxaloacetát a oxoglutarát (obrázok 5C).

Zvažovali sme metabolické modely v iných organizmoch, aby sme ďalej potvrdili, ktoré živiny sú determinantmi v reakcii na nerovnováhu (metódy S1, pozri tiež obrázok S2, ako sa menia toky hlavných dráh). Všetci títo hlavní prispievatelia sa zmenili, aj keď nie príliš, s alfa-ketokyselinami, redoxnými pármi, určitými vitamínmi a určitými aminokyselinami, ktoré sú významne potrebné na kontrolu porúch NADH/NADt u C.elegans a ľudskej rekonštrukcie. Najčastejšia reakcia na redoxnú nerovnováhu v týchto organizmoch sa týka metabolitov, ktoré sprostredkovávajú homeostázu pH, ako je acetát, hydrogénuhličitan, bifosfát, sodík, voda a iné. Podobne, význam glutamátu, glutamínu, aspartátu, treonínu, serínu a glycínu ich odlišuje od ostatných aminokyselín a väčšiny metabolitov. Stredne veľké oxidované kyseliny, ako je oxoglutarát, malát a oxalacetát, tiež zohrávajú úlohu v tolerancii konzistentne, rovnako ako biotín a niektoré foláty (úplný zoznam nájdete v tabuľke S1).

DISKUSIA

Navrhujeme tu alternatívny prístup k pochopeniu širokých biologických dôsledkov zmien v redoxných pároch. Tento prístup je založený na metabolických modeloch in silico a zavádza pojem profilu tolerancie ako mieru, ktorá kvantifikuje bunkovú odolnosť voči týmto zmenám.

Obrázok 5. Homeostatické živiny v kvasinkách

(A) Príklad profilu využitia živiny s jej zodpovedajúcimi redukčnými (modrá) a oxidačnými (červená) lineárnymi regresiami charakterizovanými sklonmi m a m (v absolútnych hodnotách). Profil cytosolickej tolerancie sme zahrnuli do pozadia ako referenciu.

(B) Sklony lineárnej regresie (m,) 4 najvyšších homeostatických živín v redukčnom zmysle NADH/NAD plus perturbácia.

(C) lineárne regresné sklony top4 živín, ktoré sú homeostatické v oboch zmysloch perturbácie; Modrá: sklon redukčnej lineárnej regresie; Červená: Sklon oxidačnej lineárnej regresie.

(D) Sklony lineárnej regresie (m.) 4 najvyšších homeostatických živín v oxidačnom zmysle NADH/NAD plus perturbácia.

Metabolické úpravy, ktoré sú základom profilu, odhaľujú prítomnosť pseudohypoxického fenotypu spojeného s redukčnými režimami NADH. Tento fenotyp pripomína niektoré zdanlivo paradoxné energetické metabolizmus s nízkym výťažkom pozorované pri rakovinách (Warburgov efekt) a je tiež rozpoznaný v kvasinkových (Crabtreeov efekt) a bakteriálnych (prepadový metabolizmus) bunkách (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter a kol., 2016). V posledných rokoch bola predložená možnosť, že toto správanie by mohlo byť spôsobené obmedzeniami pri prideľovaní zdrojov, ktoré vznikajú pri pomerne vysokom raste alebo rýchlosti absorpcie glukózy (Basan a kol., 2015; Mori a kol., 2016). Pseudohypoxický fenotyp, ktorý pozorujeme, je však nezávislý od rýchlosti rastu a absorpcie glukózy a v skutočnosti sa vyskytuje súčasne s nízkou rýchlosťou rastu (metódy STAR). Ukázali sme, že jeho príčina spočíva v základnom kompromise ATP/NADH, čo je odôvodnenie, ktoré podporuje nedávna experimentálna štúdia (Maldo-nado a Lemasters, 2014).

Okrem toho naša analýza toku naznačuje, že udržiavanie ATP môže byť negatívne ovplyvnené redukčným NADH / NAD plus nerovnováhou. Predpokladá sa, že zvýšená NADH je korelátom so zníženou dostupnosťou ATP, pretože poškodenie oxidačnej fosforylácie môže viesť k zvýšeniu NADH/NAD plus aj k zníženiu ATP/ADP. Ukazujeme, že externe generované nerovnováhy NADH môžu byť príčinou zníženej dostupnosti energie prostredníctvom ortogonálnych metabolických mechanizmov, aj keď oxidatívna fosforylácia funguje na normálnych úrovniach. To je veľmi dôležité v kontexte výskumu starnutia, pretože znížená dostupnosť energie a pomery ATP/ADP sú zachovaným znakom starnutia buniek a patológií súvisiacich s vekom (Moreira a kol., 2003; Pall, 1990; Yaniv a kol., 2013 ) a môže podporiť akumuláciu toxického odpadu a stratu proteostázy (ďalší znak starnutia) znížením obratu bielkovín, a teda zvýšením polčasu proteínov (Anisimova et al., 2018).

Ďalej sa zameriavame na určenie platnosti nášho rámca ako prediktora dĺžky života a diétnych metabolitov vyrovnávajúcich redoxné nerovnováhy. Tolerancia predpokladá životnosť buniek s určitými obmedzeniami v dôsledku dostupného súboru údajov. Pri kontrole týchto obmedzení (Garay et al., 2014) sme zistili, že výsledné korelácie sú stále dostatočným dôkazom vzťahu medzi rozptylmi tolerancie a CLS.

Na rozdiel od našich očakávaní, najvýraznejšou lekciou z našej analýzy metabolitov v strave je, že hlavná látka, ktorá riadi reakciu na nerovnováhu, sa zvlášť nespolieha na záchrannú sieť NADt. V skutočnosti sú top "homeostatické živiny" medziproduktmi cyklu TCA a iných častí centrálneho metabolizmu, ktorých pôsobenie je oveľa prenikavejšie ako pôsobenie prekurzorov NAD. Okrem toho, význam reakcií, ktoré redukovali alebo oxidovali NAD(H), pričom pôsobia ako mostíky medzi redoxným párom a hlavnými metabolickými dráhami, je oveľa lepší ako význam enzýmov obmedzujúcich záchranu NADt (ako je nikotínamidmononukleotid adenyltransferáza).

Napríklad skóre oxalacetátu a oxoglutarátu v kvasinkovom modeli medzi štyrmi najlepšími najúčinnejšími metabolitmi, ktoré sú základom tolerancie v redukčných aj oxidačných podmienkach, čo je konzistentná vlastnosť, ktorá potvrdzuje predchádzajúce experimentálne výsledky (Chin a kol., 2014; Williams a kol., 2009) . Medzi ďalšie významné metabolity patrí hydroxybutyrát, o ktorom sa trvalo ukazuje, že predlžuje životnosť, reguluje NAD a sprostredkúva odpoveď na hladovanie (Edwards et al., 2014; Newman a Verdin, 2014) a spermidín, ktorý patrí do skupiny polyamínov a je známe, že zohrávajú úlohu v procesoch súvisiacich s vekom, autofágii a ochrane DNA (Eisenberg et al., 2009; Minois et al. 2011: Pietrocola et al. 2015).

Použili sme C.elegans a ľudské modely na posilnenie predchádzajúceho hodnotenia, pričom sme odhalili širší obraz, ktorý sa sústreďuje okolo pH homeostázy, redoxných párov a cyklu TCA. To naznačuje, že spôsoby, ktorými pH (Burtner a kol., 2009) a nerovnováha NADH (Ayer a kol., 2014) určujú starnutie buniek, sú hlboko prepojené. Okrem pH sú najrozšírenejšími a najdôležitejšími živinami na reguláciu NADH/NAD plus nerovnováha alfa-ketokyseliny oxaloacetát a oxoglutarát, ich aminované formy a ďalšie metabolity súvisiace s mitochondriami, ako je malát, pyruvát a fumarát, tj hlavné centrum kontrola redoxnej rovnováhy je cyklus TCA.

Mechanizmy, ktorými aminokyseliny a medziprodukty cyklu TCA ovplyvňujú predĺženie života kvasiniek a C. elegans, zostávajú dodnes nejasné. Metabolity ako malát, oxaloacetát, fumarát, valín, serín alebo treonín môžu skutočne predĺžiť životnosť organizmov, ale procesy vedúce k týmto účinkom sú diskutované a zložité (Edwards et al., 2013, 2015). Naše výsledky naznačujú, že spoločné vysvetlenie všetkých týchto javov pre dlhovekosť spočíva v účinku živín na schopnosť buniek tolerovať poruchy v pomere NADH/NAD plus.

Dalo by sa však tvrdiť, že niektoré z uvažovaných metabolitov sa zdajú byť samozrejmé, pretože sa napokon podieľajú na reakciách, ktoré vzájomne premieňajú NADH a NAD plus. Otázkou potom je, prečo sa v našich výsledkoch neobjavia ďalšie metabolity, ktoré tiež vyzerajú a priori ako samozrejmé. Odpoveď spočíva v mechanizmoch, ktoré zaisťujú realistické predpovede v FBA. Aby bola živina „homeostatická“ proti redoxnej nerovnováhe, musí nielen zvýšiť produkciu NADH alebo NADt, ale musí stáť v strede dráhy alebo modulu s vysokým výťažkom ATP/NADH a/alebo kapacitou poskytovať zložky biomasy.

Nakoniec sú pozoruhodné ešte dva poznatky z našich výsledkov. Na jednej strane naznačujú, že v reakcii na redoxné nerovnováhy sú metabolické siete pripravené vo zvýšenej miere produkovať a/alebo konzumovať niektoré metabolity, ktoré signalizačné siete interpretujú ako brániace potrebe autofágie, antioxidačných a hormetických reakcií, ako aj mnohých prebytočných metabolitov. Zistilo sa, že suplementácia zvyšuje životnosť a/alebo inak napodobňuje účinky kalorickej reštrikcie (CR) spôsobom závislým od signálnych dráh, ktoré sa podieľajú na predĺžení životnosti sprostredkovanej CR. To posilňuje predchádzajúce dôkazy spájajúce CR a rovnováhu NADH/NADH ako súčasť toho istého procesu predlžovania životnosti a podpory zdravia (Lin et al., 2004).

Na druhej strane naša štúdia ukazuje, že v reakcii na zmenené pomery metabolizmus vo zvýšenej miere využíva aj určité látky, ktoré môžu bunku chemicky poškodiť, ako je acetát, putrescín alebo acetaldehyd; ako aj niektoré, ktoré môžu podporovať tumorigenézu prostredníctvom metabolických prepojení, ako je glutamín, sukcinát a fumarát (Sciacovell et al., 2016). To by potom mohlo čiastočne vysvetliť patologické stavy spojené s oxidačno-redukčnou nerovnováhou a makroskopické procesy, na ktorých sa podieľa, ako sú degeneratívne a onkologické ochorenia: ak sa redoxná nerovnováha musí vyrovnávať látkami, ktoré sú toxické, potom sú tieto látky pravdepodobne mechanizmami patológií, ktoré -vyskytujú sa s redoxnou nerovnováhou.

Uvedomujeme si, že náš prístup k redoxnej nerovnováhe možno chápať ako nezvyčajnú variáciu štúdie robustnosti metabolickej siete a že môže obviňovať určité výhrady, ktoré ponechávajú veľa priestoru na zlepšenie. Pokiaľ ide o robustnosť, štúdie používajúce FBA ju tradične definovali ako zmenu cieľového riešenia (zvyčajne rast) v reakcii na rôzne zníženia rýchlosti reakcie, napr. (Edwards a Palsson, 2000), a nie na konkrétnu poruchu (redoxná nerovnováha ) v metabolitoch ako my. S ohľadom na obmedzenia našej analýzy môžu byť spojené s vnútornými obmedzeniami samotnej FBA, ako je absencia regulačných génov. Spoľahlivosť našich výsledkov v konečnom dôsledku závisí od prediktívnej sily metabolických rekonštrukcií: súčasné kvasinkové modely sú prediktívne a pokročilé, ale nie sú dokonalé (Heavner a Price, 2015), a napriek tomu sú oveľa lepšie ako väčšina z nich. k dispozícii presné mnohobunkové rekonštrukcie. Napriek všetkým týmto obavám existuje množstvo dôkazov, ktoré zaručujú zvyšujúcu sa vernosť metabolických modelov prirodzenému správaniu.

V súčasnosti má prevládajúci výskum tendenciu ignorovať potenciálne negatívne dôsledky neselektívneho znižovania pomeru NADH/NADH. Je to čiastočne kvôli sľubným výhodám vyplývajúcim z miernych znížení dosiahnutých experimentálne, medzi ktoré patrí redukcia neoplastických fenotypov, dĺžka života a predĺženie zdravotného stavu. Objavujú sa však dôkazy, ktoré odporúčajú mimoriadnu opatrnosť, pokiaľ ide o tieto pozitívne výsledky (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), ako aj solídny, experimentálne udržiavaný teoretický rámec, ktorý predpovedá negatívne dôsledky znižovania pomerov NADH/NADH nad rámec prah (Aon et al., 2010). Naše profily tolerancie nerovnováhy NADH/NADt sa starajú o tento vznikajúci obraz, pretože mierne oxidačné odchýlky môžu byť prospešné, ale vyššie sú rovnako škodlivé ako opačný extrém.

Konkrétnejšie, naše profily tolerancie naznačujú, že okrem spôsobenia chemických alebo fyziologických problémov sa musia nízke aj vysoké pomery NADH/NADH stretnúť s čisto metabolickými nevýhodami, vrátane zníženej dostupnosti energie a/alebo biosyntetického výstupu. Okrem toho, a ako sme zdôraznili, obmedzené experimentálne pozorovania, ktoré sú k dispozícii pri niektorých otázkach, ktoré riešime, pripomínajú výsledky, ktoré tu uvádzame.

Obmedzenia štúdie

Tu prezentované výsledky by sa zlepšili, keby sa použité modely ďalej spresňovali. Naša práca tiež trpí vnútornými obmedzeniami FBA ako techniky. Napríklad dynamické informácie nie sú dosiahnuté, pretože aktuálne dostupné verzie analýzy dynamického toku sú príliš obmedzené. Podobne nedostatok implicitných energetických obmedzení v rovnováhe tokov znižuje jej predikciu pre vysoké miery rastu. Táto slabosť motivovala pridanie techník, ako je CAFBA, ako sme uvažovali v rukopise. Nakoniec by bol zaujímavý prístup k regulačným informáciám, ktoré sa dajú jednoducho ovládať a zapnúť alebo vypnúť. V súčasnosti neexistujú žiadne štandardizované prístupy k implementácii génovej regulácie v FBA. Aplikácia skóre reakčnej aktivity na obmedzujúce hranice je v tomto ohľade sľubná.

Tento článok je prevzatý z iScience 24, 102697, 23. júla 2021