Vplyv čínskej bylinnej medicíny Cistanche na skorý vývoj embrya a plodu
Mar 08, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*
[Abstrakt]Použite prasaembryáz oplodnenia in vitro na výskum a porovnanie. Účinok pridaniačínskyliekprísadCistanchea Astragalus k rozvojuskoré embryáv médiu NCSU{{0}} bolo preukázané. Experiment dokázal, že: (1) Objemový pomer 0,10 percentaCistanchea 0.10 percent Astragalus sa pridalo do kultivačného bujónu aCistanchepridaná skupina Počet blastocýst (15,76 percenta) bol významne vyšší ako v slepej skupine (9,26 percenta) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), čo naznačujeCistanchedeserticolamôže výrazne podporiťskoré embryonálnerozvoj. (2) Keď koncentrácia (V/V) zCistancheje {{0}}.05 percent a 0,10 percent , počet blastocyst (17,02 percent a 16,75 percent ) je výrazne vyšší ako v prázdnej skupine (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">čínskyliekCistanchev kultivačnom médiu v 2-bunkovom štádiu bola rýchlosť vývoja blastocyst (13,81 percenta) významne vyššia ako v 4-bunkovom štádiu (7,53 percenta) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
V dôsledku rozdielov vo vývojovom prostredí in vivo a in vitro,embryábudú poškodené voľnými radikálmi počas in vitro kultivácie raných prasiatembryá, spôsobujúce poruchy bunkového metabolizmu, prípadne poškodenie DNA, RNA a proteínov [1]. Aby sa ďalej zlepšila rýchlosť vývoja oplodnenia in vitro zmrazenou spermou, tento experiment skúmal pridanie určitej koncentrácieCistanchea Astragalus na zlepšenieembryovývojové prostredie in vitro.
1. Materiál a metódy
1.1 Podmienky kultivácie:
Dozrievanie oocytov ošípaných in vitro, oplodnenie in vitro a kultivácia skorých embryí in vitro sa uskutočňovali v inkubátore s 5 percentami CO2 a maximálnou nasýtenou vlhkosťou 39 stupňov.
1.2 Činidlá a kultivačné médium:
Bazálna tekutina na dozrievanie oocytov je NCSU{{0}}, tekutina na premývanie oocytov je tekutina PVA-TL-HEPES, tekutina na oplodnenie je Tris pufor (mTBM) obsahujúci 0,1 percenta BSA a kvapalina na premývanie spermií je Dubecco's s 0,1 percenta BSA. Fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (DPBS), tekutina na rozmrazovanie spermií je BTS, tekutina kumulu je 1 mg/ml hyaluronidáza PBS, tekutina na operáciu oocytov je NCSU pufrovaná HEPES-23 a tekutina zo základnej kultúry skorých embryí je doplnená 0 0,4 percenta BSA NCSU-23, pridajte (V/V) 0,05 percent ~0,15 percenta Cistanche podľa potreby, použite BTS na rozmrazovanie semena. Pred použitím predhrejte a nechajte ekvilibrovať viac ako 4 hodiny v inkubátore obsahujúcom 5 percent CO2 vzduchu a maximálnou nasýtenou vlhkosťou 39 stupňov [2].
1.3 Metóda varu čínskej medicíny Cistanche:
Roztok Cistanche: Vezmite 5 g a vložte do kadičky s objemom 100 ml, pridajte ultračistú vodu a ponorte ju do ultračistej vody, varte na vysokom ohni a nechajte vo vare 20 minút, potom zozbierajte polievka; zopakujte vyššie uvedený proces, odoberte 3-krát za sebou, konštantný objem do 100 ml, náhradný filter 0,22 μm. Roztok Astragalus: Vezmite 5 g a vložte do kadičky s objemom 100 ml, pridajte ultračistú vodu a ponorte, varte na silnom ohni a nechajte vo vare 20 minút, potom zachyťte liečivú polievku; zopakujte vyššie uvedený proces, odoberte 3-krát za sebou, nastavte objem na 100 ml, prefiltrujte 0,22 μm rezervu.
Čínska medicínaBylinné:Cistanche
1.4 Dozrievanie oocytov ošípaných in vitro:
Vaječníky prasníc boli odobraté z Pekingského potravinového bitúnku Pengcheng, umiestnené do 0.9 percent normálneho fyziologického roztoku obsahujúceho antibiotiká s teplotou približne 38 stupňov , prevezené späť do laboratória do 4 hodín a trikrát premyté normálnym fyziologickým roztokom. Použite 10 ml injekčnú striekačku s 12-ihlou na extrakciu oocytov s folikulmi s priemerom 2-6 mm na povrchu vaječníka. Premyte 3~4-krát v roztoku TL-HEPES a 3~4-krát v NCSU-23, ktorý bol ekvilibrovaný v inkubátore s oxidom uhličitým dlhšie ako 4 hodiny. Preneste 20~30 oocytov ako skupinu do 100 μl, pridajte 10 percent PFF, 10 IU/ml HCG, 10 IU/ml PMSG, 10 ng/ml kvapiek EGF NCSU-23 a kultivujte približne 22 hodín, zmeňte médium na kvapôčky NCSU{23}} s 10 percentami PFF, 10 ng/ml EGF a pokračujú v kultivácii počas 44 až 46 hodín[3].
1.5 Kapacita spermií a oplodnenie in vitro:
Pripravte roztok mTBM bez kofeínu a BSA a nechajte ho ekvilibrovať 48 hodín v inkubátore s 5 percentami CO2 a maximálnou nasýtenou vlhkosťou 39 stupňov, pričom upravte hodnotu pH v rozsahu 7,2~7,8; pridajte kofeín a BSA 44 hodín pred použitím a pokračujte v ekvilibrácii. Sperma sa testovala na kvalitu a 10 ml sa centrifugovalo pri 900 ot./min počas 3 minút, pridalo sa 10 ml roztoku DPBS obsahujúceho 0,1 percenta BSA na suspenziu a centrifugovalo sa pri 900 °C r/min počas 3 minút [3]; po suspendovaní 1 ml roztoku TBM sa naklonil o 60 stupňov. Ošetrenie na získavanie energie proti prúdu sa vykonáva v inkubátore s 5 percentami CO2 vzduchu a maximálnou nasýtenou vlhkosťou 39 stupňov počas 1 hodiny[3~5]. Bunkový komplex oocyt-kumulus, ktorý dozrieva na 44-46, sa umiestni do oocytového premývacieho roztoku obsahujúceho 0,1 percenta hyaluronidázy a kumulické bunky sa odstránia pipetovaním a potom sa oocyty exponujú. Umyte 3-krát vo vyváženom TBM a nakoniec vložte každý 10-15 kúsok do skupiny 50 μl TBM a počkajte na spermie [6, 7]. Vstreknite 50 μl upstream spermy z kapacity do kvapôčky oocytov obsahujúcich TBM a vykonajte oplodnenie počas 6 hodín v inkubátore s 5 percentami CO2 a maximálnou nasýtenou vlhkosťou 39 stupňov.
1.6 Včasný vývoj a detekcia oplodnených vajíčok:
Po 6 hodinách oplodnenia boli oocyty ošetrené NCSU-23 pufrovaným operačnou tekutinou HEPES alebo NCSU- 23 s 0,4% BSA v tekutine z kultúry embryí. 23 3-krát opláchnite, zmeňte médium na vyváženú kvapôčku 0,4 percenta BSA NCSU-23 a inkubujte viac ako 8 dní. Na 2. deň skontrolujte mieru štiepenia hypotetických oplodnených vajíčok, na 6. deň skontrolujte mieru moruly (plus počet blastocýst) a na 8. deň skontrolujte počet blastocyst [8]. Všetky boli vyšetrené a zaznamenané pod telesným zrkadlom.
1.7 Experimentálny dizajn:
1.7.1 Vplyv zložiek tradičnej čínskej medicíny Cistanche na skorý vývoj embrya.
Wuzhishanská prasa[8] Po kapacitácii, oplodnení in vitro, je oplodnenie dokončené a po štiepení sa embryá vymieňajú, až kým nie sú pridané na 0,1 percenta (V/V). Cistanche, 0,1 % astragalus a NCSU-23 (0,4 % BSA) bez dôležitých prísad (prázdna skupina) boli kultivované, aby sa pozoroval vývoj oplodnených vajíčok a skorých embryí a posúdiť účinky dvoch zložiek tradičnej čínskej medicíny na vplyv skorého vývoja embryí in vitro.
1.7.2 Vplyv koncentrácie Cistanche na skorý vývoj embryí.
Sperma ošípaných Wuzhishan je kapacitné a podlieha oplodneniu in vitro. Po dokončení oplodnenia sa tekutina zmení na {{0}} percent (prázdna skupina), 0.05 percent , 0,1 percenta a 0,1 percenta, resp. V 15 percentách Cistanche NCSU-23 (0,4 percenta BSA) pozorujte vývoj oplodnených vajíčok a posúďte vplyv rôznych koncentrácií zložky čínskej medicíny Cistanche na skorý vývoj embryí in vitro.
1.7.3 Vplyv obdobia pridania Cistanche na skorý vývoj embrya.
Sperma ošípaných Wuzhishan je kapacitné a podlieha oplodneniu in vitro. Po skončení oplodnenia sa oplodnené vajíčko rozdelí do {{0}}bunkového štádia a oplodnené vajíčko sa rozdelí do 4-bunkového štádia, pričom tekutina sa vymieňa a pridáva oddelene. 0.1 percenta Cistanche NCSU-23 (0,4 percenta BSA), pozorujte vývoj oplodnených vajíčok a posúďte vplyv pridania cistanche na skorý vývoj embryí in vitro v rôznych štádiách.
1.8 Štatistická analýza:
Použite SPSS13.0 test chí-kvadrát (χ2) a jednosmernú analýzu rozptylu.
2. Výsledok analýzy
2. 1 Vplyv zložiek tradičnej čínskej medicíny na skorý embryonálny vývoj
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). Frekvencia blastocýst v týchto dvoch skupinách bola vyššia ako v slepej skupine a miera blastocyst v skupine Cistanche bola odlišná od slepej skupiny. Významné (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 Vplyv koncentrácie zložky čínskej medicíny Cistanche na skorý embryonálny vývoj
Ako je uvedené v tabuľke 2, pridanie Cistanche v objemovej koncentrácii 0.05 percent až 0,10 percent v tekutine z kultivácie embryí má lepší podporný účinok na embryá na oplodnenie in vitro WZSP. a rýchlosť vývoja blastocyst sa výrazne líši od rýchlosti v slepej skupine (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 Vplyv pridania obdobia čínskej medicíny zložky Cistanche na skorý embryonálny vývoj
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). Bol tu však významný rozdiel v porovnaní s pridaním 4 buniek (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Diskusia
V porovnaní s normálnym vývojomembryáin vivo, vývojové prostredie IVF oplodnenéembryáje výrazne odlišná. Počas procesuembryorastom a delením vzniká veľké množstvo č., voľných radikálov a niektorých toxických látok, čo je nepriaznivé pre rast embryí. Normálne sa vyvíjajúce embryá v tele dokážu tieto nepriaznivé faktory eliminovať prostredníctvom metabolizmu vnútorného prostredia; tieto nepriaznivé faktory sa budú vždy akumulovať v rastovom prostredí embryí pri oplodnení in vitro. TradičnéčínskyliekprísadaCistanchemôže mať funkciu zníženia žiadnej koncentrácie a eliminácie určitých voľných radikálov, aby sa ďalej zlepšila rýchlosť vývoja oplodnenia in vitro zmrazeným spermou. Experiment skúmal pridanie určitej koncentrácieCistanchea Astragalus. Výsledky potvrdili, že Astragalus nemal žiadny účinný účinok na zlepšenie kultivačného prostredia in vitro. Správna koncentráciaCistanchemá určitý podporný účinok naskoré embryovývoj, ale pri koncentrácii zCistancheprekračuje určitú koncentráciu, pôsobí aj inhibične naembryorozvoj.
Ďalej sme skúmali rôzne účinkyCistanche, tradičnýčínskyliekkomponent v rôznych fázach a experiment zistil, žeskoré embryámajú vyššiu mieru vývoja v neskoršom štádiu, keďcistanchesa pridá vo fáze 2-bunky. Možnou príčinou je vonkajšie prostredie receptora. Oxid dusnatý (NO) je signálna molekula a cytotoxický faktor so širokým spektrom biologických aktivít. Účinok NO naskoré embryovývoj by sa mal sledovať až doskoré embryonálnevývojové štádium, ktoré môže byť spôsobené jednou z príčin 2-bunkového bloku (2-bunkového bloku) v kultúre embryí cicavcov, a in vitro blok ošípaných sa vyskytuje v 4-bunkovom štádiu [ 9]. Pridanie tradičnéhočínskyliekzložky môžu do určitej miery eliminovať voľné radikály NO a zmierniť nepriaznivé faktoryembryorast [10].
Cistanche
Referencie
[1] Comport M. Tri modely bunkovej zúrivosti vyvolanej voľnými radikálmi[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72(1/2):1- 56.
[2] Pan Dengke. Štúdia o faktoroch ovplyvňujúcich vývoj klonovaných somatických buniek ošípanýchembryá[D]. Peking: Čínska poľnohospodárska univerzita, 2005.
[3] Zhang Yunhai. Výskum výroby klonovaných ošípanýchembryápomocou technológie prenosu jadra somatických buniek [D]. Peking: Čínska poľnohospodárska univerzita, 2005.
[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun a kol. Účinky pridania hovädzieho séra a bravčovej folikulárnej tekutiny počas dozrievania na jadrové dozrievanie oocytov ošípaných askoré embryonálnevývoj po oplodnení in vitro [J]. Heilongjiang Chov zvierat a veterinárna medicína, 2002, (8):1- 3.