Vylepšenie proteomiky mozgového tkaniva zhora nadol pomocou FAIMS, časť 3

Jedným z bezprostredných a zjavných pozorovaní je, že čím vyšší je percentil abundancie, tým vyššia je pravdepodobnosť identifikácie s TDP. Inými slovami, TDP väčšinou identifikuje vysoko hojné proteíny.

Ako starneme, mnohí ľudia zisťujú, že ich pamäť sa zhoršila. Ide o bežný jav, najmä potom, čo sme zažili dlhodobý psychický stres, nedostatok spánku a nevyvážené stravovanie.

Vedeli ste však, že jedným zo spôsobov, ako nám pomôcť zlepšiť pamäť, je zvýšiť príjem bielkovín vo vysokom množstve? Bohatý proteín je bohatý na aminokyseliny, ktoré dokážu syntetizovať molekulu nazývanú neurotransmiter v mozgu a tiež podporujú rast a aktivitu neurónov. Neuróny sú najzákladnejšie jednotky v mozgu a sú kľúčom k našim schopnostiam učenia a pamäti. Preto môže vysoký obsah bielkovín zlepšiť našu pamäť zlepšením funkcie neurónov.

Výskum tiež preukázal vzťah medzi bielkovinami a pamäťou. Jedna štúdia napríklad zistila, že v porovnaní s vysokoproteínovou diétou viedla nízkobielkovinová diéta k poklesu mozgových funkcií, vrátane pozornosti a pamäti.

Ak si teda chcete zlepšiť pamäť, môžete do svojho jedálnička zaradiť aj potraviny s vysokým obsahom bielkovín, ako napríklad kuracie mäso, ryby, hovädzie mäso, vajcia, tofu atď. a rozmanitosť vašej stravy a nemôžete jesť len jeden druh jedla.

Skrátka, veľké množstvo bielkovín môže pomôcť zlepšiť našu pamäť. Ak chcete mať lepšiu pamäť, môžete začať s diétou a snažiť sa jesť čo najviac potravín s vysokým obsahom bielkovín! To ukazuje, že musíme zlepšiť našu pamäť a Cistanche môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože môže tiež regulovať rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov, ktoré sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže Cistanche tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, aby mozog získal dostatočnú výživu a energiu, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Približne polovica génov identifikovaných zo súborov údajov zhora nadol (s alebo bez FAIMS) bola obsiahnutá v horných 20 % zásobníkov hojnosti na analýzu zdola nahor (obrázok 6A). Naopak, 71 génov bolo možné nájsť iba v súboroch údajov zhora nadol (zásobník „NA“) (obrázok 6A).

Zdá sa, že tieto gény predstavujú relatívne krátke proteíny (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Napríklad do zásobníka zhora nadol boli zahrnuté histónové proteíny, ako sú H3C1, H4C1, H1–4 a H2BC12. Ako sa dalo očakávať, zistili sme, že FAIMS by mohli zlepšiť identifikáciu v nižších percentiloch s množstvom v porovnaní s „žiadnymi FAIMS“, čím sa hĺbka zvýšila. pozorovateľného proteómu.

Stanovením pomeru FAIMS k "žiadne FAIMS" vo všetkých percentiloch je zjavné značné zvýšenie identifikácií pod 40. percentilom v rámci CV v rozsahu -40 až -50 (obrázok 6B).

Ak však vezmeme do úvahy absolútny počet génov, hlavným prínosom výhody FAIMS je rozšírenie spektra identifikácií naprieč všetkými percentilmi hojnosti.

Vzťah medzi FAIMS CV a prenosom proteoforiem

Pri FAIMS sme tiež zaznamenali trend medzi FAIMS CV a molekulovou hmotnosťou proteoformy (obrázok 7). Pri -50 CV je stredná hmotnosť proteoformy ~ 5 kDa a zvyšuje sa na ~ 15 kDa pri -20 CV.

Na základe týchto hmotnostných distribúcií (obrázok 7) sa CV menšie ako -50 V javia ako vhodné pre proteomické experimenty zhora nadol alebo v strede nadol, zatiaľ čo CV väčšie ako -50 V môžu byť prospešné pre peptidomické experimenty alebo experimenty zdola nahor.

Pozorovaný trend molekulovej hmotnosti pravdepodobne presahuje -20 CV; naše vyhľadávanie sme však obmedzili na -20 CV na základe poklesu identifikácie proteoformy a génov, čo viedlo k zníženiu pokrytia sekvencií proteómu na jeden cyklus.

Mali by sme poznamenať, že predchádzajúca práca používajúca FAIMSfound +40 CV ako ideálne napätie na prenos ťažkého reťazca NIST mAb (~51 kDa) a -20 CV bolo najlepšie pre zodpovedajúci ľahký reťazec (~23 kDa), čo podporuje myšlienku že trend, ktorý pozorujeme, presahuje do pozitívnych FAIMS CV.45

Je zaujímavé, že hoci mnohé spektrá identifikujúce jedinú proteoformu boli obmedzené na to, že sa našli v rozsahu 10 V (3599 z 5165), bolo pozorovaných sedem proteoforiem v celom rozsahu CV od -50 do -20. Pravdepodobne to možno pripísať ich vysokému zastúpeniu vo vzorke, najmä v prípade ubikvitínu (UBB), bázického proteínu myelínu a proteínu viažuceho acylCoA.

Je však tiež pravdepodobné, že rôzne stavy nabitia týchto proteoforiem prijímajú niekoľko konformácií v plynnej fáze v závislosti od ich izomerizácie protónov, čo ovplyvňuje ich pohyblivosť.42

Týchto sedem proteoforiem nám umožnilo preskúmať, ako sa obálka stavu náboja diferencovane prenáša prostredníctvom modulácie CV. Ako proxy pre distribúciu stavu nabitia v každom CV sme použili stredný stav nabitia založený na zhodách proteoformného spektra (PrSM) identifikovaných v každom CV a sledovali sme, ako sa táto hodnota zmenila ako funkcia CV od -50 CV.

Skenovanie MS1 na obrázku S3 ukazuje, ako stredný stav nabitia PrSM sleduje distribúciu stavu nabitia UBB. Z týchto siedmich proteoforiem štyri sledovali inverzný vzťah, pričom stredný pozorovaný stav náboja sa zvyšoval so znížením CV (obrázok 8).

Stojí za zmienku, že tento trend bol vo všeobecnosti pozorovaný pri peptidoch a malých proteínoch.56, 62–64 Prekvapivo tri proteoformy vykazovali opačný vzťah, kde klesajúca CV znížila pozorované stredné stavy náboja (obrázok 8).

Zbežné preskúmanie strednej hmotnosti prekurzora medzi týmito dvoma skupinami naznačuje, že väčšie prekurzory s väčšou pravdepodobnosťou uprednostňujú stavy s vyšším nábojom, keď sa CV znižuje.

Aby sme tieto vzťahy ďalej potvrdili, rozšírili sme túto analýzu tak, aby zahŕňala proteoformy, ktoré boli identifikované v skromnejšom, ale stále širokom rozsahu 20–30 CV (n=256 proteoforiem). V tomto prípade proteoformy, ktorých stredný náboj sa posunul o viac ako jeden náboj celý rozsah CV bol rozdelený do dvoch rôznych skupín v závislosti od smeru tohto posunu.

Tie, ktoré posunuli menej ako jeden náboj, sa považovali za „neutrálne“ vzhľadom na zmenu CV. Podobne ako v predchádzajúcich výsledkoch bolo u väčších prekurzorov podstatne pravdepodobnejšie, že budú spojené s inverzným vzťahom medzi pozorovanými stavmi náboja a CV (tabuľka S2).

S klesajúcim CV sa zdá, že väčšina proteoforiem sa prenáša pri nižších stavoch nabitia (n=177) v porovnaní s tými, ktoré uprednostňujú stavy s vyšším nabitím (n=39). Zvyšní (n=40) boli považovaní za „neutrálnych“ vzhľadom na zmeny v CV.

Proteoformy viazané v neutrálnej skupine demonštrovali priemernú hmotnosť prekurzora medzi inverznými a priamymi skupinami, čo opäť naznačuje, že hmotnosť proteoformy je vnútorne spojená s týmto správaním.

Ďalšie parametre založené na primárnej sekvencii, ako napríklad zloženie bázických/kyslých aminokyselín a alifatický index, však významne nekorelovali (tabuľka S2).

Hoci proteíny zavádzané do plynnej fázy sú pravdepodobne denaturované, faktory typicky spojené s natívnymi proteínmi, ako je dipólový moment alebo kolízna prierez, môžu mať lepšiu predikčnú hodnotu voči tomuto javu.64–66 Naše výsledky ukazujú, ako možno CV použiť na filtráciu proteínov rôznych hmotnosti a ako môže byť stavová obálka proteínu rozdielne prenášaná aj prostredníctvom FAIMS.

Užitočnosť proteínových fragmentov v experimentoch TDP

Prekvapivo, významný počet proteoforiem, ktoré sme identifikovali, boli fragmenty väčších proteínov. Zistili sme, že iba 25 % unikátnych identifikovaných proteoforiem pokrývalo viac ako polovicu proteínovej sekvencie, z ktorej boli odvodené.

Týchto 25 % malo priemernú hmotnosť 11,4 kDa v porovnaní so zvyšnými 75 %, ktoré mali priemernú hmotnosť 5,7 kDa. K tomuto pozorovaniu môže prispieť niekoľko faktorov, z ktorých niektoré sú nezávislé od FAIMS.

Napríklad tieto fragmenty samotné môžu byť produkty proteolytického štiepenia produkované za normálnych homeostatických podmienok ako súčasť bunkového "degradomu"67 alebo napriek rôznym opatreniam zavedeným počas post-mortem intervalu a manipulácie so vzorkou.

Tkanivo centrálneho nervového systému je bohatým zdrojom signálnych peptidov známych ako "neuropeptidy", ktoré sú tiež bežne odvodené od oveľa väčších prekurzorových proteínov.68

Krížovým odkazom na naše identifikácie proteoforiem so zavedenou databázou neuropeptidov (NeuroPedia)69 sme dokázali identifikovať niekoľko takýchto neuropeptidov vrátane vazostatínu-1, sekretoneurínu, cholecystokinín-58 desnonopeptidu a neuropeptidu y a mnohých nekanonických sekvenčných variantov odvodené od známych génov produkujúcich neuropeptidy.

Okrem biologických faktorov môžu pozorovanie proteínových fragmentov ovplyvniť aj určité parametre prístroja. Napríklad nízke napätie „fragmentácie“ v zdroji (medzi 10 a 20 V) sa môže typicky použiť na odstránenie aduktov a desolvatáciu proteínových iónov, zatiaľ čo vyššie napätia môžu byť disociácia vyvolaná zdrojom.

Náchylnosť amidových väzieb na disociáciu sa však môže značne líšiť a so zvyšujúcou sa veľkosťou proteínu sa zvyšuje aj pravdepodobnosť, že proteín bude obsahovať labilné amidové väzby, ako je Xaa-Pro. mechanizmus, a to aj pri nízkych zdrojových napätiach, rozhodli sme sa vyhnúť použitiu zdrojového napätia, aby sme znížili možnosť zavedenia fragmentových iónov do prístroja.

Je tiež možné, že proteíny sú náchylné na fragmentáciu, keď prechádzajú cez elektrické polia vytvorené v FAIMS. Neočakávalo by sa však, že tieto fragmenty budú mať rovnakú mobilitu ako rodičovský ión, s výhradou, že to pravdepodobne závisí aj od veľkosti fragmentu vzhľadom na prekurzorový ión.

Nakoniec stojí za to poukázať na niekoľko faktorov, ktoré môžu ovplyvniť pozorovanie menších proteoforiem (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Toto šírenie signálu možno do značnej miery pripísať obálke stavu nabitia a izotopovým distribúciám každého stavu nabitia. Špecifické pre naše experimentálne nastavenie bolo použitie filtra s veľkosťou 3K MWCO ako konečného filtračného kroku v našej príprave vzoriek, ktorý bol v tomto prípade vybraný tak, aby sa zabezpečilo, že menšie amyloidné beta proteoformy by mohli byť účinne zachytené, ak by boli prítomné.

Všeobecné inštrumentálne faktory môžu tiež vytvoriť smerovanie k malým proteoformám, vrátane ladenia kvadrupólu, elektrodynamického zachytávania a zrážok so zvyškovými molekulami plynu v bunke Orbitrap, ktoré vedú k rýchlejšiemu rozpadu prechodného javu pre väčšie molekuly.75 Bez ohľadu na tieto odchýlky alebo presný pôvod fragmentov, stále môžu poskytnúť pohľad na proteóm.

Tieto fragmenty sú obzvlášť užitočné v kontexte neurodegeneratívnych ochorení, kde sú poruchy proteostázy bežne spojené s patológiou.76,77

V skutočnosti sa často zistilo, že fragmenty tau sú neurotoxické a zohrávajú úlohu v progresii tauopatií, ako je AD. , pozorujeme značné sekvenčné pokrytie.

Príkladom toho je skúmanie fragmentov poskytujúcich pokrytie pre ~50 kDa tubulinalfa-1B reťazec (TUBA1B) a ~70kDa synapsín-1 (SYN1), ako je znázornené na obrázku 9A, B, oba veľké proteíny, ktoré by inak bolo ťažké pozorovať v ich plnej dĺžke v TDP komplexnej vzorky.

Identifikácia proteoforiem s významom pre neurodegeneratívne ochorenie

Využitie FAIMS s našou analýzou zhora nadol umožnilo identifikáciu niekoľkých jedinečných zostrihových variantov Swiss-Prot a záznamov TrEMBL, s 267 jedinečnými zostrihovými variantmi a 96 záznamami TrEMBL (tabuľka S3).

Pozorujeme najmä, že viaceré PrSM jednoznačne identifikujú alternatívnu izoformu ORF (A{{0}}A0D9SF30) pre adhéznu molekulu nervových buniek1 (NCAM1). Pozorovali sme tiež proteoformy odvodené od génov, ktoré majú známe úlohy pri niekoľkých neurodegeneratívnych ochoreniach, najmä -synukleín a PARK7.

V oboch týchto prípadoch prevládajúce proteoformy obsahujú sekvenciu plnej dĺžky. Je zaujímavé, že sa zistilo, že väčšina -synukleínu, synukleínu a (v menšej miere) -synukleínu PrSM obsahuje ~177 Da neznámy hmotnostný posun v blízkosti C-konca (synukleinspektrum plnej dĺžky s neznámou modifikáciou, ako je znázornené na obrázku S4A) .

Tento posun hmotnosti bol predtým pozorovaný pri prehľadávaní v otvorených databázach a vo všeobecnosti sa nachádza na Asp alebo Gluresidues.78 Potenciálne vysvetlenie, ktoré sa veľmi zhoduje s priemernou a monoizotopovou hmotnosťou modifikácie, pozostáva z jedného kyslíka s tromi atómami železa, ako aj zo straty siedmich atómov vodíka ( založené na Unimod prístupe č. 1971).

Porovnanie izotopových píkov ay{0}} fragmentového iónu zo -synukleínu (obrázok S4B) so simulovaným spektrom obsahujúcim vyššie uvedené prvky, o ktorých sa predpokladá, že patria k neznámej modifikácii (obrázok S4C), demonštruje podobnosť medzi týmito dvoma izotopovými distribúciami, s mnohými izotopovými píkmi, ktoré sú navzájom zarovnané v rozmedzí 2 ppm.

Malo by sa tiež zdôrazniť, že najľavejšie izotopové píky sú jedinečné pre prirodzene sa vyskytujúce izotopy železa a neprítomnosť týchto píkov je ľahko zrejmá, keď je spektrum simulované bez obsahu troch atómov železa (obrázok S4D), čo silne naznačuje, že táto neznáma modifikácia je veľmi pravdepodobne zložená. navrhovaných prvkov.

Predchádzajúce štúdie tiež opísali vysokú afinitu -synukleínu k rôznym kovovým iónom a oblasť, ktorú pozorujeme, že obsahuje túto modifikáciu, sa prekrýva so zvyškami, o ktorých je známe, že sa podieľajú na väzbe – konkrétne motív 119DPDNEA124 (obrázok S5).79–81

Naše údaje tiež naznačujú, že C-terminálne oblasti -synukleínu a -synukleínu majú podobnú úlohu vo väzbe kovov, pretože viaceré spektrá s rovnakým neznámym hmotnostným posunom sa zhodovali s podobnými sekvenciami v rámci týchto proteínov.

Čo sa týka mitochondriálneho proteínu PARK7, zaznamenali sme ~116.0 Da hmotnostný posun na jeho jedinom aktívnom mieste Cys zvyšku, C106 (obrázok S6). Jedno potenciálne vysvetlenie s podobnou delta massis sukcinyláciou, modifikáciou, ktorá sa pripisuje mitochondriálnemu stresu a formám v dôsledku Michaelovho pridania fumarátu na Cys tiolovú skupinu.82

For more information:1950477648nn@gmail.com