Cvičenie na bežeckom páse zabraňuje poklesu priestorového učenia a pamäte u myší s 3×Tg-AD zlepšením štrukturálnej synaptickej plasticity hippocampu a prefrontálneho kortexu, časť 2
Jul 23, 2024
2.5. Western Blot
Myši boli anestetizované inhaláciou izofluránu a dekapitované. Tkanivá hipokampu alebo prefrontálneho kortexu boli lyzované v studenom lyzovacom pufri RIPA (Thermo ScientificPierce, Waltham, MA, USA) doplnenom kokteilom inhibítorov proteázy a fosfatázy (Roche, Indianapolis, IN, USA).
Lýzne pufry umožňujú výskumníkom v biologických laboratóriách lepšie kontrolovať experimentálne podmienky, a tým lepšie študovať rast a zmeny buniek, čo hrá dôležitú úlohu v akademickom a lekárskom výskume.
Okrem toho, že lyzačné pufry sú užitočné pre výskum, môžu mať tiež pozitívny vplyv na zlepšenie ľudskej pamäte. Podľa najnovších výskumov môžu chemické zložky bohaté na lyzačné pufry pomôcť podporiť rast a vývoj nervových buniek, a tým zlepšiť pamäť mozgu.
Štúdia zistila, že určité zložky v lyzačných pufroch môžu podporovať prenos signálu medzi určitými nervovými bunkami, čím zlepšujú schopnosti mozgu učenia a pamäte. Okrem toho môžu tieto zložky stimulovať rast nervových buniek a pomôcť mozgu lepšie sa prispôsobiť novému prostrediu a novému učeniu. Výsledkom týchto účinkov je, že ľudia môžu lepšie uchopiť nové poznatky a dlhšie si ich zapamätať.
Samozrejme, samotné lyzačné pufre nedokážu magicky vyriešiť všetky problémy s pamäťou. Vedci ešte musia vykonať ďalší výskum, ako tieto zistenia využiť na zlepšenie ľudskej pamäte. Pozitívny význam tohto objavu je však už teraz veľmi jasný: lyzačné pufry môžu poskytnúť dobrý štart na zlepšenie ľudskej pamäte a poskytnúť viac možností pre budúcu vedeckovýskumnú prácu. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinok Cistanche pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.
Kliknite na položku Poznať spôsoby zlepšenia pamäte
Celkový proteín sa meral pomocou testu BCA (Thermo Scientific Pierce, USA). Vzorky sa zahrievali na 100 °C počas 15 minút. Pre Westernblot boli rovnaké množstvá proteínu nanesené (20 ug/jamka) na 12 % gél. Po elektroforéze a prenose na PVDF membrány (Millipore, IPVH00010, Burlington, MA, USA) sa inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s blokovacím pufrom (5 % BSA pufor).
Membrány PVDF sa inkubovali cez noc s primárnou protilátkou (GAPDH, 1:10,000,Abcam, Boston, MA, USA; PSD95, 1:500, Abcam, USA; Syn, 1:500, Abcam, USA) .
Potom boli trikrát premyté TBST pufrom v 5-minútových intervaloch a inkubované počas 1 hodiny s kozou anti-králičou alebo HRP-konjugovanou kozou anti-myšou sekundárnou protilátkou (1:15, 000, Proteintech Group, Rosemont , IL, USA), nasledované premytím TBST v 5 minútových intervaloch.
Hladiny proteínov sa detegovali pomocou chemiluminiscenčných činidiel (ThermoScientific Pierce, Waltham, MA, USA) a pásy sa merali pomocou softvéru Image J.
2.6. Elektrónová mikroskopia
Myši boli hlboko anestetizované chloralhydrátom a transkardiálne perfundované PBS, po čom nasledoval 4% paraformaldehydový a 2,5% roztok glutaraldehydu v 0.1 Mfosfátovom pufri počas 20 minút.
Mozog sa vybral a cez noc ponoril do rovnakého fixačného prostriedku. Hipokampus a prefrontálny kortex boli zafarbené 1% oxidom osmičelým a potom dehydratované v odstupňovanej sérii acetónu.
Tkanivá boli narezané na ultratenké rezy, zafarbené octanom uranylom a citrátom olovnatým a skúmané elektrónovým mikroskopom Hitachi H{0}}. Fotografie náhodných pozícií z týchto vzoriek boli urobené pri 30 × 000 zväčšení (22 µm2).
Synapsie s okrúhlymi vezikulami, asymetrickými synapsiami a jedným veľkým synaptickým kontaktom sa považovali za excitačné synapsie, zatiaľ čo presynaptické terminály s pleomorfnými sploštenými vezikulami a symetrickými synapsiami sa považovali za inhibičné synapsie [48].
Analyzovali sme počet predpokladaných excitačných synapsií (22 µm2/každé obrazové pole, obrázok 2) v hipokampe a prefrontálnom kortexe každej myši a potom sme spriemerovali počet synapsií šiestich obrazových polí z rovnakej skupiny (6 obrazových polí od 4 myší v každej skupine).
Dĺžka synaptickej aktívnej zóny, šírka synaptickej štrbiny, zakrivenie synaptického rozhrania a hrúbka postsynaptickej hustoty z 12 až 15 náhodne vybraných synapsií boli kvantifikované a porovnané zo 4 myší na skupinu (obrázok 3).
Dĺžka aktívnej zóny a hrúbka postsynaptickej hustoty boli merané podľa Güldnera [49]. Synaptická štrbina bola definovaná ako najjasnejšia oblasť medzi pre- a postsynaptickými membránami [50].
Synaptické zakrivenie bolo určené pomocou vzorca: R=a/2 + b2/8a, kde b je čiara spájajúca dva konce postsynaptického zhrubnutia a a je kolmá vzdialenosť od postsynaptickej membrány k b [51 52] (pozri obrázok 3A).
Obrázok 2. Cvičenie na bežeckom páse zvyšuje počet synapsií hipokampu a prefrontálneho kortexu u 3×Tg-AD myší. (A) Reprezentatívne zobrazovanie hipokampu a prefrontálneho kortexu pomocou elektrónového mikroskopu u myší bez Tg kontroly, cvičenia bez Tg, kontroly 3 × Tg-AD a 3 × Tg-AD.
Modré šípky označujú synapsie. Červený rámček predstavuje zväčšenú synapsiu. Rozšírený pohľad na synapsie v prefrontálnom kortexe s vysokým zväčšením je zobrazený v červenom štvorcovom poli v spodnej časti. (B, C) Počty synapsií hipokampu (B) a prefrontálneho kortexu (C) boli významne znížené v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (*** p < 0 .001,n=6 sekcií obrázka) a tento pokles bol zablokovaný predbežným cvičením na bežiacom páse v hippocampe (B) aj prefrontálnom kortexe (C) (*** p < 0,001, n {{ 9}} sekcií obrázkov).
Predliečba cvičením na bežeckom páse zvýšila počet synapsií hipokampu (B) a prefrontálneho kortexu (C) u myší bez Tg (** p < 0,01, n=6 sekcií snímky). Každý súbor údajov sa získal od 4 myší.
Obrázok 3. Cvičenie na bežiacom páse zlepšuje synaptické štrukturálne parametre hipokampu a prefrontálneho kortexu u myší s 3×Tg-AD. (A) Reprezentatívne meranie synaptických štrukturálnych parametrov.
Na určenie synaptického zakrivenia sa použil vzorec R=a/2 + b2/8a, kde b je čiara spájajúca dva konce postsynaptického zhrubnutia a a je kolmá vzdialenosť od postsynaptickej membrány k b.
(B, C) Dĺžka synaptickej aktívnej zóny hipokampu (B) a prefrontálneho kortexu (C) bola významne znížená v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (*** p < {{ 3}}.001, n=12–15 synapsií) a tento pokles bol zablokovaný predliečením cvičením na bežiacom páse v hipokampe aj prefrontálnom kortexe (*** p < { {18}}.001, n=12–15). (D, E) Šírka synaptickej štrbiny hipokampu (D) a prefrontálneho kortexu (E) bola významne zvýšená v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (*** p < {{ 30}}.001, n=12–15 synapsií) a tento nárast bol zablokovaný predbežným cvičením na bežiacom páse v hipokampe (D;** * p < 0.001, n=12–15 synapsií) a prefrontálny kortex (E; ** p < 0,01, n=12–15). (F, G) Synaptické zakrivenie hipokampu (F; *** p < 0,001, n=12 – 15) a prefrontálneho kortexu (G; ** p < 0,01, n=12 – 15 ) bol signifikantne znížený v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg a tento pokles bol blokovaný predliečením cvičením na bežiacom páse v hipokampe (F; ** p < 0,01, n=12– 15) a prefrontálny kortex (G; *** p < 0,001, n=12–15). (H, I) Hrúbka postsynaptickej hustoty hipokampu (H) a prefrontálneho kortexu (I) bola významne znížená v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (*** p < 0,001, n {{ 50}}–15) a tento pokles bol blokovaný predliečením cvičením na bežeckom páse v hipokampe (H; ** p < 0,01, n=12 – 15) aj prefrontálnom kortexe (I; *** p < 0,001, n=12 – 15).
Každý súbor údajov pozostával z 12 a 15 synapsií od 4 myší v každej skupine.
2.7. Štatistiky
Analýza údajov bola slepá voči genotypom a histórii liečby myší. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. Súbory údajov boli porovnané s dvojcestnou ANOVA, po ktorej nasledovala Tukeyova post hoc analýza. Post-hoc analýzy sa uskutočňovali iba vtedy, keď ANOVA priniesla významný hlavný účinok alebo významnú interakciu medzi týmito dvoma faktormi. Výsledky sa považovali za významné pri p < 0,05.
3. Výsledky
3.1. Cvičenie na bežiacom páse zabránilo poklesu priestorového učenia a pamäte u myší 3×Tg-AD
Najprv sme sa snažili zistiť, či šesťmesačné myši 3×Tg-AD vykazovali priestorové učenie a poruchu pamäti a či predliečba cvičením na bežeckom páse zabránila poklesu priestorového učenia a pamäte u šesťmesačných myší 3×Tg-AD.
Kontrolné myši bez Tg a myši s 3xTg-AD dostávali 12 týždňov cvičenia na bežeckom páse alebo kontrolnú liečbu bez cvičenia so začiatkom vo veku troch mesiacov (2 x 2 faktoriálny dizajn: genotyp vs. cvičenie).
Po 12-týždňovom tréningu bol na skúmanie priestorového učenia a pamäte myší použitý osemramenný test v radiálnom bludisku. Merala sa pracovná pamäť (schopnosť zapamätať si relatívne krátku dobu) aj referenčná pamäť (pamäť na informácie, ktoré sú v priebehu času konštantné) (rozdiel medzi pracovnou a referenčnou pamäťou je opísaný v časti 2, obrázok 1A).
Dvojcestná ANOVA ukázala, že genotyp a cvičenie na bežeckom páse malo významný vplyv na percento chýb pracovnej pamäte na 5. deň (genotyp: F1,39=8.6, p=0.006; cvičenie na bežeckom páse: F1,{{ 8}},5, p=0,024; interakcia genotypu a cvičenia na bežeckom páse: F1,39=4,2, p=0,047) a deň 6 (genotyp:F1 ,39=6.1, p=0.019; cvičenie na bežeckom páse: F1,39=6.4, p=0.016; }}.6, p=0.039; obrázok 1B) relácie akvizície.
Tukeyho post hoc testy ukázali, že percento chýb pracovnej pamäte sa významne zvýšilo v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (obaja deň 5 a deň 6: p < 0,01; obrázok 1B ).
Zvýšeniu percenta chýb pracovnej pamäte zabránili predliečenia cvičením na bežiacom páse (5. aj 6. deň: p < 0,01; obrázok 1B). Dvojcestná ANOVA však zistila, že genotyp a cvičenie na bežeckom páse nemali žiadne významné účinky na percento chýb referenčnej pamäte (napr. 10. deň, genotyp: F1,39=0.2, p=0.6; bežiaci pás cvičenie: F1,39=0.04, p=0.8; genotyp × interakcia cvičenia na bežeckom páse: F1,39=0.873,p=0.4; všetkých 10 dní akvizičnej relácie.
Tieto výsledky spolu naznačujú, že šesťmesačné myši 3×Tg-AD vykazovali zhoršenú priestorovú pracovnú pamäť, ale nie referenčnú pamäť, a cvičenie na bežeckom páse zabraňuje poklesu priestorovej pracovnej pamäte u myší 3×Tg-AD.
3.2. Cvičenie na bežeckom páse zvýšilo počet synapsií a zlepšilo synaptické štrukturálne parametre hippocampu a prefrontálneho kortexu u myší 3×Tg-AD
Aby sme zistili, či je redukcia priestorového učenia a pamäte vyvolaná cvičením na bežeckom páse spojená so štrukturálnou synaptickou plasticitou, kvantifikovali sme čísla synapsií a synaptické štrukturálne parametre hipokampu a prefrontálneho kortexu, ktoré sú rozhodujúce pre prenos informácií súvisiacich s učením a pamäťou (obrázok 2A).
Dvojcestná ANOVA odhalila, že genotyp a cvičenie na bežeckom páse mali významný vplyv na počet synapsií v hipokampe (genotyp: F1,23=59.3, p < 0.0{{9} }1 cvičenie na bežeckom páse: F1,23=51.{{20}}, p < 0.001; p=0,027; obrázok 2B) a prefrontálny kortex (genotyp: F1,23=48,6, p < 0,001; cvičenie na trenažéri: F1,23=59,8, p < 0,001; genotyp × interakcia cvičenia na bežeckom páse: F1,23=8.5,p=0.009; Obrázok 2C). Tukeyho post hoc testy ukázali, že počet synapsií hipokampu a prefrontálnej kôry bol významne znížený v kontrolnej skupine s 3xTg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (p < 0,001; obrázok 2B, C).
Cvičenie na bežeckom páse pred liečbou blokovalo zníženie počtu synapsií v hipokampe aj prefrontálnom kortexe u myší 3×Tg-AD (p < 0 0,001; obrázok 2B, C).
Cvičenie na bežeckom páse medzitým zvýšilo počet synapsií v hipokampe a prefrontálnom kortexe u myší bez Tg (p < 0 0,01; obrázok 2B, C).
Na ďalšie posúdenie účinnosti synaptickej transmisie sme merali a analyzovali ultraštrukturálne parametre pomocou elektrónovej mikroskopie (EM), vrátane dĺžky synaptickej aktívnej zóny, šírky synaptickej štrbiny, synaptického zakrivenia a hrúbky postsynaptickej hustoty v hippocampus a prefrontálny kortex (obrázok 3A).
Predchádzajúce štúdie odhalili, že väčšia synaptická aktívna zóna je účinnejšia pri vzrušujúcich postsynaptických neurónoch a skrátenie aktívnej zóny môže odrážať stav zhoršenej účinnosti synaptického prenosu [36].
Obojsmerná ANOVA ukázala, že genotyp a cvičenie na bežeckom páse malo významný vplyv na dĺžku synaptickej zóny v hipokampe (genotyp: F1,53=10.6, p=0.0{{{101} 20}}2; cvičenie na bežeckom páse:F1,53=5.0, p=0.03; {14}}.004; obrázok 3B) a prefrontálny kortex (genotyp: F1,56=17.4, p < 0,001; cvičenie na bežeckom páse: F1,56=5.0, p=0. 03;genotyp × interakcia cvičenia na bežeckom páse: F1,56=6.8, p=0.012; Obrázok 3C);
Tukeyho posthoc testy ukázali, že dĺžka synaptickej aktívnej zóny hipokampu a prefrontálneho kortexu bola významne znížená v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (p < 0,001; obrázok 3B, C).
Predbežná liečba cvičením na bežiacom páse predĺžila dĺžku synaptickej aktívnej zóny v hipokampe (p < 0,001; obrázok 3B) a prefrontálnom kortexe (p=0,001; obrázok 3C) u myší 3×Tg-AD Synaptická štrbina je ~20 nm úzky priestor medzi axónovým zakončením presynaptického neurónu a membránou postsynaptického neurónu.
Optimálne skrátenie synaptickej štrbiny môže mať adaptívnu funkciu optimalizácie synaptickej sily zvýšením efektívnej koncentrácie uvoľnených neurotransmiterov a znížením efektívnej štrbinovej rezistencie [37,38].
Obojsmerná ANOVA ukázala, že genotyp a cvičenie na bežeckom páse mali významné účinky na šírku synaptickej štrbiny v hipokampe (genotyp:F1,55=21.5, p < 0.0{ {24}}1; cvičenie na bežiacom páse: F1,55=15.1, p < 0,001; a prefrontálny kortex (genotyp:F1,53=10.6, p=0.002; cvičenie na bežeckom páse: F1,53=5.0, p=0.03; genotyp × bežiaci pás interakcia cvičenia: F1,53=9.2, p=0.004; obrázok 3E);
Tukeyho post hoc testy ukázali, že šírka synaptickej štrbiny hipokampu a prefrontálneho kortexu bola významne zvýšená v kontrolnej skupine 3×Tg-AD v porovnaní s kontrolnou skupinou bez Tg (p < 0,001; obrázok 3D, E).
Predbežné ošetrenie cvičením na bežiacom páse znížilo šírku synaptickej štrbiny v hipokampe (p < 0,001; obrázok 3D) a prefrontálnom kortexe (p=0,001; obrázok 3E) u myší 3×Tg-AD.
For more information:1950477648nn@gmail.com
