Tubuloside B z Cistanche Salsa zachraňuje neurónové bunky PC12 pred apoptózou a oxidačným stresom vyvolaným 1-metyl-4-fenylpyridínium iónmi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstrakt:

Neuroprotektívneúčinky tubulozidu B z cistanche, jeden z fenyletanoidov izolovaných z číňanovbylinný liek Cistanche salsana 1-metyl-4-fenylpyridínium iónom (MPP plus ) indukovaná apoptóza a oxidačný stres v neurónových bunkách PC12. Bunky PC12 ošetrené MPP - prešli apoptotickou smrťou, ako sa stanovilo testom MTF, prietokovou cytometriou a elektroforézou na DNA agarózovom géli; intracelulárna akumulácia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) sa merala farbením DCFH-DA laserovou skenovacou konfokálnou mikroskopiou (LSCM). Simultánna liečba tuhulozidom B výrazne zoslabila MPP＋-indukovanú cytotoxicitu, fragmentáciu DNA a intracelulárnu akumuláciu ROS. Tieto výsledky silne naznačujú, že tubulozid B zabraňuje apoptóze indukovanej MPP a oxidačnému stresu. Tubulozid B sa môže aplikovať ako anantiparkinsonovu chorobuagentov.

Úvod

Patologicky je sporadická Parkinsonova choroba (PD) typicky charakterizovaná stratou katecholaminergných neurónov, najmä dopaminergných neurónov substantia nigra pars compacta (SNc), a prítomnosťou charakteristických intraneurónov| inklúzie nazývané Lewyho telieska v postihnutých oblastiach mozgu. Napriek rôznym faktorom, ktoré sa podieľajú na patogenéze PD, mechanizmy zapojené do iniciácie a progresie PD zostávajú neisté. Aj keď príčina PD zostáva zodpovedaná, niekoľko línií dôkazov silne naznačuje zapojenie oxidačného stresu, čo nakoniec vedie k k smrti neurónov alebo apoptóze nadmernou tvorbou voľných radikálov [1•], [2], [3]. Skutočnosť, že nigrálny dopamínergný systém môže produkovať vysoké hladiny voľných radikálov a má relatívne nízke hladiny antioxidačného obranného systému, ďalej podporuje túto hypotézu. Štúdie in vivo aj in vitro preukázali neurotoxicitu sprostredkovanú oxidačným stresom MPP＋, aktívneho metabolitu l-metyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridínu (MPTP) na dopaminergných neurónoch [4 ], [5]. Zapojenie voľných radikálov nadmerne produkovaných oxidačným stresom ako bezprostrednej príčiny neurodegeneratívnych porúch, ako je PD, naznačuje kľúčovú úlohu antioxidantov. Tubulozid B (obr. l) bol jednou z fenyletanoidových zlúčenín izolovaných zo stoniekCistanche salsa. Predchádzajúce štúdie zistili, že mnohé fenyletanoidy vrátane tubulozidu B vykazovali silnú aktivitu zachytávania voľných radikálov [6], [7].

Vzhľadom na tieto zistenia sme v tejto štúdii skúmali účinok tubu]nzidu B na neurotoxicitu indukovanú MPP plus in vitro pomocou bunkovej línie feochromocytómu sympatického nervu PC12, ktorá sa v priebehu rokov úspešne používa na štúdium funkcie neurónov [8], [9].

antiparkinsonova choroba:cistanche

Materiály a metódy

Materiály

Tubulozid B zCistanche salsabol láskavo dodaný Dr. Li Lei (Department of Natural Products, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, Čína). Čistota zlúčeniny bola podľa HPLC analýzy viac ako 98 percent. Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), konské sérum a fetálne teľacie sérum boli zakúpené od GIBCO BRL, 1-metyl-fenylpyridínium ión (MPP plus ), poly-L-lyzín, 3- (4, 5 -dimetyltiazol-2 -yl)-2,5- difenyltetrazóliumbromid (MTT), propídiumjodid (PI), RNáza A, proteináza K a 2,7'-dichlórfluoresceín diacetát (DCFH-DA) boli zakúpené od Sigma.

Bunková kultúra

Bunky PCI2 sa udržiavali v DMEM doplnenom 1 0 percent konského séra, 5 percent fetálneho teľacieho séra, 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu. Bunky sa kultivovali vo zvlhčenom inkubátore prevzdušnenom 95 percentami vzduchu a 5 percentami CO2 pri 37 stupňoch. Všetky experimenty sa uskutočnili 24-48 h po nasadení buniek. Bunky sa rutinne zbierali trypsinizáciou 0,25 percenta, keď sa bunky priblížili k subkonfluentnému štádiu a naniesli sa do 25 cm kultivačných baniek rozdelených v pomere 1:8.

Analýza životaschopnosti buniek

Životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou modifikovaného MTT testu, ako je opísané vyššie [10]. Stručne povedané, bunky PC12 sa naočkovali na 96-jamkové platne v hustote 1 x 104 buniek na jamku. Kultúry rástli 48 hodín a potom sa médium zmenilo na médium obsahujúce rôzne koncentrácie tubulnsidu B alebo MPP＋. Po inkubácii po dobu až 48 hodín a 72 hodín sa do 96-jamkových doštičiek pridal MTr roztok (5 mg/ml v DMEM) a bunky sa nechali inkubovať 4 hodiny pri 37 °C. Po odstránení média sa bunky a kryštály farbiva solubilizovali pridaním 200 ul DMSO a absorpcia sa merala pri 570 nm (540 nm ako referencia) s modelom 550 čítačky mikrodoštičiek (Bio-Rad). Životaschopnosť buniek bola tiež analyzovaná použitím metódy vylučovania trypánovej modrej. Bunky boli zozbierané, jemne peletované a zafarbené 0,6 percentným roztokom trypánovej modrej počas 3 dažďov. Percento nezafarbených buniek bolo následne hodnotené v desiatich náhodne vybraných mikroskopických poliach. Ako pozitívny liek sa použilo 100 ng／ml epidermálneho rastového faktora (EGF).

Detekcia apoptózy prietokovou cytometriou

Apoptotické bunky boli detegované prietokovou cytometriou s použitím propidium jodidu (PI) [11••]. Stručne, približne 1 x 1{7}}6 buniek inkubovaných s testovanými látkami sa zozbieralo centrifugáciou a raz sa premylo PBS. Bunky boli fixované 70 percentným etanolom počas 24 hodín pri - 20 stupňoch a raz premyté PBS. Bunky sa potom resuspendovali v 300 ul PBS obsahujúcom 0,5 mg/ml RNázy a 0,5 mg/ml PI. Po ďalšej inkubácii počas 30 minút v tme sa uskutočnila prietoková cytometria s FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Nemecko).

Použili sme Mooreov protokol [12], ktorý izoloval iba fragmentovanú DNA a experimenty sa normalizovali použitím rovnakého počtu kultúr z každej testovacej skupiny. Stručne povedané, 3 × 1{20}}6 neurónov z každej z ošetrených vzoriek sa premylo v Hankovom vyváženom soľnom roztoku (1000g počas 10 minút) a pelety vytvorené na dne skúmavky sa homogenizovali s 1 ml lyzačného pufra (10 mM Tris pri pH 7,4, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100) počas 20 minút na ľade. Po centrifugácii pri 11,000 g počas 20 dažďov pri 4 stupňoch boli supernatanty obsahujúce fragmentovanú DNA odstránené a štiepené 20 mg/ml RNázy A pri 37 stupňoch počas 1 hodiny a 0,1 mg/ml proteinázy K pri 56 stupňoch na ďalšiu 1 h. Fragmentovaná DNA sa extrahovala pomocou fenolu a chloroformu a centrifugovala pri 10,000g počas 1 dažďa pri 4 °C. Vodná fáza sa preniesla do novej Eppendorfovej skúmavky, zmiešala sa s 2 objemami ľadovo studeného etanolu a potom umiestnené pri-20 stupni aspoň na 1 hodinu, aby sa vyzrážala DNA. Po centrifugácii pri 15,000g počas 20 minút pri 4 stupňoch sa supernatanty odstránili a pelety DNA sa raz premyli 80 percentným etanolom (15 000 g počas 15 minút pri 4 stupňoch), vysušili na vzduchu a rozpustili v 20 μl TE pufor pri pH 7,6. Celá vzorka sa potom podrobila elektroforéze na 1,5 percentnom agarózovom géli počas 1 hodiny pri 85 V. Gél sa skúmal a fotografoval pomocou systému dokumentácie gélu Ultra Violet Products (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Meranie intracelulárnej tvorby ROS

Tvorba intracelulárnych peroxidov bola detegovaná konfokálnym skenovacím laserovým mikroskopom s použitím nefluorescenčnej zlúčeniny, 2"7"-dichlórfluoresceín diacetátu (DCFH-DA) [13], ktorý je v bunkách esterifikovaný endogénnymi esterázami na ionizovanú voľnú kyselinu, 2 ;7"-dichlórfluoresceín. 2",7-dichlórfluórescín je možné oxidovať na fluorescenčný 2"7"-dichlórfluoresceín (DCF) hydroantioxidantmi. Bunky sa inkubovali s 10 uM DCFH-DA počas 30 minút pri 37 stupňoch. Kultúry sa dvakrát premyli Hankovým vyváženým soľným roztokom a zobrazili sa v rovnakom médiu. Zobrazovanie sa uskutočňovalo pomocou konfokálneho skenovacieho laserového mikroskopu, DCF bol excitovaný pri 488 nm a emisným filtrom bol 510 nm bariérový filter. Na poskytnutie platného porovnania boli pre všetky pozorovania použité rovnaké parametre akvizície. Nastavila sa optimálna vertikálna poloha v strede buniek a potom sa pole rýchlo skenovalo. Pretože osvetlenie pri excitačnej vlnovej dĺžke 488 nm spôsobilo zvýšenú fluorescenciu v dôsledku oxidácie tohto farbiva, každé pole bolo vystavené svetlu presne na rovnaký čas. Východiskové hodnoty z nestimulovaných buniek sa použili ako kontrolné hodnoty na porovnanie s bunkami ošetrenými MPP v prítomnosti alebo neprítomnosti tubulozidu B. Po skenovaní sa priemerná relatívna intenzita fluorescencie v telách 15-20 neurónových buniek na pole mikroskopu kvantifikovala v štyroch oddelené kultúry podľa podmienok liečby.

cistanche

Štatistická analýza

Všetky získané hodnoty boli vyjadrené ako priemer ± SD. Štatistická významnosť rozdielov medzi skupinami bola stanovená Studentovým t-testom; Vypočítané hodnoty p menšie ako 0,05 sa považovali za štatisticky významné.

Výsledky

Ako je znázornené na obr. 2, MPP plus vyvolalo na dávke závislé zníženie životaschopnosti buniek PCI2. Na rozdiel od toho, EGF, dobre známy neurotrofický faktor, produkoval významnú ochranu životaschopnosti buniek pri 100 ng/ml MPP＋-indukované cytotoxické účinky boli tiež oslabené v prítomnosti tubulozidu B (5, 10, 50 alebo 100 ug-ml-1 ), aj keď s menšou účinnosťou ako referenčný liek (obr. 3). Tubulozid B v týchto koncentráciách vykazoval cytoprotektívne účinky v závislosti od dávky a samotná zlúčenina nespôsobovala žiadnu zjavnú cytotoxicitu (údaje nie sú uvedené). Gélová elektroforéza extraktu DNA z buniek PCI 2 ošetrených 200 uM MPP plus počas 48 hodín ukázala rebríček DNA. klasickým znakom apoptózy, tubulozid B, v dávkach 10 a 100 μg·ml-1vytvorená tvorba rebríka DNA (obr. 4) Obr. 5 ukazuje typické histogramy prietokovej cytometrickej analýzy apoptotickej bunkovej smrti indukovanej MPP＋ v bunkách PC12 v prítomnosti alebo neprítomnosti tubulozidu B. Kvantifikácia profilu bunkového cyklu pomocou PI odhalila počet buniek so subdiploidnými charakteristikami (oblasť M1), ktoré indikujú fragmentáciu apoptickej DNA. V neošetrených bunkách bola apoptotická subdiploidná frakcia minimálna až do 5．94％ z celkového počtu 10 000 buniek (obr. 5 A). Po 48 hodinách expozície MPP＋ sa percento apoptózy zvýšilo na 43．02;j;(obr.．5 B)！. Keď sa tubulozid B pridal do bunkovej kultúry, inhiboval MPP – indukovanú apoptózu spôsobom závislým od dávky. Pri koncentrácii 10 ug·ml-1 nebola ochrana tubulozidom B štatisticky významná, ale pri 50 a 1 00ug·ml-1 45％a 63％pokles． bolo pozorované, čo viedlo k zvýšeniu percenta prežívajúcich buniek (obr. 5D, E).

Akumulácia intracelulárnych ROS môže byť detekovaná použitím DCFH-DA．PC12 bunky ošetrené 200 uM MPP＋ počas 48 hodín vykazovali intenzívnu fluorescenciu vo vnútri bunky po farbení DCFH-DA farbivom (obr. 6). Simultánna liečba tubulozidom B (v dávkach 10 a 100 ug.ml.) inhibovala produkciu ROS indukovanú MPP＋一 (znížené percento bolo 24．52％a 55．63％ v tomto poradí).

Diskusia

Patogenéza PD zahŕňa silný oxidačný stres, znížené hladiny antioxidantov a mitochondriálne defekty. o všetkých je známe, že indukujú apoptózu v niekoľkých bunkových systémoch. Najmä sa ukázalo, že voľné radikály spúšťajú aktívnu bunkovú smrť v neurónoch[14]. MPTP spôsobuje ireverzibilný a závažný syndróm podobný parkinsonizmu, ktorý spôsobuje selektívnu degeneráciu nigrostriatálnych dopamínergných neurónov u ľudí. Tento neurotoxín sa použil na vytvorenie zvieracích modelov PD[15].MPTP sa premieňa monoaminooxidázou B na MPP＋, ktorý sa hromadí v mitochondriách. kde inhibuje mitochondriálny komplex I a tieto mitochondriálne dni. funkcia spôsobuje apoptózu[16]. Preto sa MPP plus 一indukovaná neurotoxicita v dopaminergných neurónoch vo veľkej miere využíva ako etiologický model PD na skríning neuroprotektívnych látok.

V tejto štúdii sme preukázali, že bunková smrť indukovaná MPP plus prostredníctvom oxidačného stresu v bunkách PC12 bola znížená tubulozidom B. Ďalej sme preukázali, že tubulozid B tiež chránil spôsobom závislým od dávky proti rebríku DNA vyvolanému MPP plus a apoptóza, ako sa meria pomocou DNA gélovej elektroforézy a prietokovej cytometrickej analýzy. Okrem toho súčasná liečba vyššími koncentráciami tubulozidu B inhibovala produkciu ROS indukovanú MPP. Tubulozid B teda preukázal multifunkčné neuroprotektívne účinky. Na pôsobení tubulozidu B sa môže podieľať niekoľko mechanizmov, oddelene alebo v spojení. Antioxidačný účinok je možným mechanizmom neuroprotekcie sprostredkovanej tubulozidom B. Xiong Q zistil, že tubulozid B vykazuje silnú aktivitu zachytávania voľných radikálov na 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylovom radikále a xantín]xantínoxidázou generovaný superoxidový aniónový radikál [6].

Nedávno sa uvádza, že niektoré fenyletanoidy majú vlastnosti zachytávajúce voľné radikály a chránia toxické zranenia vyvolané oxidačným stresom. ROS produkované MPP plus, ako je peroxid vodíka, superoxidový anión a hydroxylový radikál, ľahko poškodzujú biologické molekuly, čo môže v konečnom dôsledku viesť k apoptickej alebo nekrotickej bunkovej smrti. Tubulozid B teda môže mať priame zachytávacie účinky proti ROS. Aj keď naše údaje nestanovujú presné miesto, na ktorom tubulozid B pôsobí na potlačenie akumulácie ROS, naznačujú, že neuroprotektívny mechanizmus zahŕňa stimuláciu dráh antioxidantov. Štúdia molekulárnej štruktúry tubulozidu B tiež naznačuje, že má silnú schopnosť zachytávať voľné radikály (osobná komunikácia).

Relevantné môžu byť aj iné mechanizmy. Napríklad tubulozid B môže mať schopnosť pôsobiť proti toxicite MPP＋ inhibíciou otvárania pórov prechodu mitochondriálnej permeability a dysfunkcie. Okrem toho by sa malo zvážiť, či má tubulozid B priamy rast podporujúci účinok na neurónové bunky. Presný mechanizmus neuroprotektívneho účinku tubulozidu B zostáva nejasný. Na objasnenie úplného obrazu jeho neuroprotektívneho účinku sú potrebné ďalšie štúdie.

Tubulozid B z extraktu Cistanche salsa má evidentné ochranné účinky na apoptózu indukovanú MPP plus a oxidačný stres. Jeho neuroprotektívne účinky proti MPP ＋ toxicita môžu byť dôležité a naznačujú, že môže mať terapeutický potenciál pri prevencii a liečbe PD.

liečba PD: cistanche

Referencie

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Inhibícia oxidu dusnatého fenyletanoidmi v aktivovaných makrofágoch. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Vytvorenie noradrenergnej klonálnej línie buniek adrenálneho feochromocytómu, ktoré reagujú na nervový rastový faktor. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Voľné radikály a peroxidácia lipidov nesprostredkujú -amyloidom indukovanú smrť neurónových buniek. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Kinetická charakterizácia toxicity oxidu dusnatého pre bunky PC12: účinok polčasu uvoľňovania NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:{5}}

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Rýchla a jednoduchá metóda na meranie apoptózy tymocytov farbením propidium jodidom a prietokovou cytometriou. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Intracelulárna infekcia Leishmania do nova inhibuje apoptózu makrofágov. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, poslanec Mattson. Základný FGF tlmí oxidačný stres vyvolaný amyloidným peptidom, mitochondriálnu dysfunkciu a poškodenie aktivity Na＋-K＋-ATPázy v hipokampálnych neurónoch. Výskum mozgu 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Mitochondriálne poškodenie ako skorá udalosť v procese apoptózy indukovanej depléciou glutatiónu v neurónových bunkách: význam pre Parkinsonovu chorobu. Biochem Pharmaco 11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Chronický parkinsonizmus u ľudí spôsobený produktom syntézy analógov meperidínu. Science 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Štúdie o toxicite 1-me etyl-4-fenylpyridíniového iónu (MPP ＋) proti mitochondriám mozgu myši. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110