Dva ľudské metabolity zachraňujú model Alzheimerovej choroby C. Elegans prostredníctvom odpovede cytosolického rozloženého proteínu Ⅲ

Obr. 6 RTqPCR ukazuje, že karnozín a kyselina kynurénová aktivujú cytozolickú nezbalenú proteínovú odpoveď zvýšením hladín transkriptov J proteínovdnj-12 adnj-19 v deň 5 červov GMC.GMC červy boli podané 15μM každý z karnozínu a kyseliny kynurénovej a ich hladiny mRNA boli monitorované pomocou RTqPCR.a Nezaznamenali sme žiadne známkyfifinemôže meniť hladiny mRNAhsf-1, hsp-90, ahsp-70. Význam liečby karnozínomfifivýrazne zvýšené hladiny transkriptov J-proteínov triedy A a B, DNJ-12, DNJ-13 a DNJ-19. Kyselina kynurénová však zvýšila iba hladiny J-proteínov triedy A, DNJ-12 a DNJ-19. Zmeny v hladinách transkriptov J-proteínov korelujú so zmenami hladiny proteínov a sú tiež podporované našimi knockdown experimentmi RNAi, kde DNJ-13 nevykazuje úlohu pri odstraňovaní agregátov A 42 agregátov (obr.8a, b). b Testovali sme aj akékoľvek zmeny v UPRER a UPRmt po podaní karnozínu a kyseliny kynurénovej, avšak nezistili sme žiadne príznakyfifinemôžu sa meniť značky,hsp-4ahsp-6, zodpovedajúce aktivácii týchto dráh, resp. Všetky údaje predstavujú štyri biologické replikáty dňa 5cistancheGMC. Os Y predstavuje stav/GEOMEAN, pričom stav sa vzťahuje na každý z nichhsf-1, daf-21, hsp-70, dnj-12, dnj-13, dnj-19, hsp-4,ahsp-6a GEOMEAN je geometrický priemer dvoch génov pre domácnosťrpb-2acdc-42pre normalizáciu. Vykonali sme štatistiku pomocou GraphPad Prism s použitím jednosmernej ANOVA s Tukeyovým párovým porovnaním stĺpcov proti neošetreným GMC (AD) červom pre každý stav liečený metabolitmi. Všetky chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu priemeru (SEM). Významp-hodnoty sú uvedené nad stĺpcovým grafom. ns označuje štatisticky nevýznamné.

Kliknutím sem získate ďalšie informácie o lieku Cistanche na liečbu Alzheimerovej choroby

zvýšené hladiny molekulárnych chaperónov sme použili RNA interferenciu (RNAi) na potlačenie špecifických génov a spýtali sme sa, či to zrušilo účinky karnozínu alebo kyseliny kynurénovej na agregáciu a toxicitu A42. Ak HSF-1 hrá úlohu pri odstraňovaní agregátov A 42, potom knockdown HSF-1 by ukázal zjavný agregát-pozitívny fenotyp so zvýšenou paralýzou červov. V skutočnosti to bol prípad, keď sme vykonali RNAi proti hsf-1 (pozri časť "Metódy") a ošetrili GMC červami vodou, karnozínom a kyselinou kynurénovou (obr. 7). V prázdnom vektore L4440 vidíme, že karnozín aj kyselina kynurénová čistia A 42 agregáty a zvyšujú celkovú kondíciu v porovnaní s červami RNAi, kde je hsf-1 zrazený pred liečbou týmito dvoma metabolitmi (obr. 7a) . U týchto knockdown červov GMC hsf{11}} vidíme vyšší počet agregátov A 42 (obr. 7b, c) spolu so znížením celkovej kondície (obr. 7a), aj keď sú doplnené o metabolity. Celkovo teda vidíme, že priaznivé účinky karnozínu a kyseliny kynurénovej sa výrazne znížili po znížení hsf-1 pomocou RNAi (obr. 7a). Všimnite si, že červy N2 divokého typu, liečené aj neliečené, nevykazovali žiadne zjavné rozdiely v celkovej paralýze na hsf-1 knockdown (obr. 7a radarový graf a stĺpcové grafy N2). Predchádzajúce štúdie ukázali, že úplný účinok RNAi môže trvať 48 hodín, kým sa vytvorí významný knockdown fenotyp 52, 53, takže v deň 5 sú naše výsledky v zhode. Ako ďalšia štúdia bude zaujímavé preskúmať vplyv týchto metabolitov na časový priebeh starnutia u zdravých červov. Ďalej sme jednotlivo odstránili gény daf-21 (HSP90), hsp-1 (HSP70), dnj-13, dnj-12, dnj-19 a hsp-110 pomocou RNAi na štúdium následných účinkov nacistanchemotility po liečbe kyselinou kynurénovou. DNAJ (HSP40) interaguje s HSP70 na podporu opätovného skladania a HSP110 na podporu disagregácie. s kyselinou kynurénovou (obr. 8a, b). Aj keď sme nepozorovali žiadne, preto sme v našej štúdii RNAi tiež považovali HSP110 za významné účinky v každom knockdown stave (obr. 8c) na 5. deň kontroly na celkové behaviorálne účinky a agregáciu A 42 v C. v dospelosti po liečbe kyselinou kynurénovou. bol elegán. Pozorovali sme zvýšené agregáty A42 v každom knock-signifikantnom zvýšení celkovej kondície v skupine s prázdnym vektorom L4440 s GMC, ktorá bola inak potlačená liečbou po liečbe kyselinou kynurénovou v porovnaní s neošetrenými červami GMC (AD). To ukazuje, že kyselina kynurénová skutočne odstraňuje agregáty A 42, čo je sprostredkované týmito chaperónmi, čo vedie k zlepšeniu motility červov exprimujúcich A 42-. Celkovo naše údaje z Western blotov, RTqPCR a RNAi naznačujú, že liečba kyselinou kynurénovou a karnozínom zvyšuje hladiny HSF-1 vcistanchemodel AD, čo má za následok transkripčnú upreguláciu, a teda zvýšené hladiny J-proteínov DNJ- 12 a DNJ-19. Zdá sa, že to spolupracuje s viacerými jadrovými chaperónmi, ako sú HSP70, HSP90 a HSP110, a aspoň to vyžaduje na ochranu pred agregáciou A 42 a súvisiacou toxicitou vcistanche(obr. 8c). Spoločne naše údaje ukazujú, ako dva metabolity spúšťajú cytosolickú rozloženú proteínovú odpoveď v acistanchemodel AD na odstránenie agregátov A42 a ich súvisiacej toxicity. Keďže hladiny týchto metabolitov môžu súvisieť s vekom alebo s chorobou, navrhujeme, aby metabolity boli induktormi ochranných bunkových reakcií kontroly kvality, ktoré chránia predagregácia proteínov spojená s ochorením(obr. 8c).

Obr. 7 Karnozín a kyselina kynurénová chránia proti agregácii A42 a toxicite spôsobom závislým od HSF-1-. aRNAi knockdown hsf- ukazuje zníženú motilitu u GMC (AD) červov. L4440 je prázdny vektorový ovládací prvok. Pri liečbe karnozínom a kyselinou kynurénovou sa pozoruje významné zvýšenie motility vo fenotype L4440 v porovnaní s poklesom v skupinách hsf-1(RNAi). Kontrolné červy N2 nevykazujú žiadny významný účinok metabolitov karnozín (Car) a kyselina kynurénová (Kyn). Radarový graf zobrazuje celkovokondície porovnaním troch kvantitatívnych premenných: rýchlosť červa (mm/s), ohyby za minútu a živý pomer, ako je vidieť na jeho osi. Vložený stĺpcový graf ukazuje, že zníženie hsf-1 pomocou RNAi výrazne zhoršuje priaznivé účinky karnozínu a kyseliny kynurénovej. Štatistiky sa uskutočňovali s použitím jednosmernej ANOVA, Dunnettovho viacnásobného porovnávacieho testu s neošetreným A42 prázdnym vektorom. ****p< 0.0001; ***p< 0.001; **p< 0.01; *p< 0.05 (b). A corresponding decrease in NIAD-4 aggregates is observed in AD worms treated with carnosine and kynurenic acid (Scale bars, 80μm). For NIAD-4 staining, approximately 11–30 animals were analyzed per condition. All error bars represent SEM. Statistics were performed using one-way ANOVA Dunnett's multiple comparisons test against the untreated Aβ42 empty vector.****p< 0.0001; ***p< 0.001; **p< 0.01; *p< 0.05.cRepresentative images of Aβ42 plaques show a signifificant clearance of aggregates in worms treated with carnosine (Car) and kynurenic acid (Kyn).hsf-1 knockdown worms even when treated with carnosine and kynurenic acid did not clear aggregates. White arrows point to NIAD-4-stained Aβ42 aggregates, which appear orange-red in color. For comparison, an empty RNAi vector L4440 GMC worm head is shown.

Obr. 8 Kyselina kynurénová zabraňuje toxicite A42 v acistanchemodel AD prostredníctvom pôsobenia molekulárnych chaperónov. Pri ošetrení 10 μM kyselinou kynurénovou sa cytosolická rozložená proteínová odpoveď aktivuje HSF-1 a zahŕňa HSP-90, HSP-70, HSP-110, HSP40 J proteíny DNJ{ {6}} a DNJ-19, ale nie DNJ-13 (panely a–c). Celková zdatnosť (ohyby za minútu, rýchlosť a prežitie) v acistanchemodel AD (GMC červy) je narušený aj po ošetrení 10 μM kyseliny kynurénovej v hsf-1, daf-21, hsp-70, hsp{{4} }, dnj-12, dnj-13 a dnj{7}} v porovnaní s kontrolným L444{{30}} (c). Pozoruje sa zodpovedajúci nárast agregátov NIAD-4 (a a b). Nevidíme však žiadne agregáty pri odstraňovaní dnj{{10}}, J-proteínu triedy B, čo naznačuje, že nemusí hrať úlohu pri odstraňovaní agregátov A 42. Biele šípky ukazujú na agregáty A 42 zafarbené NIAD{13}}, ktoré majú oranžovočervenú farbu (stupnice, 80 μm). Pre testy motility, n=~260–1000 zvierat na stav, pre test farbenia NIAD-4 n=11–29 pre všetky stavy okrem knockdown hsp110, pre ktoré n=4 . Všetky chybové úsečky predstavujú SEM. a a c štatistiky boli uskutočnené s použitím jednosmernej ANOVA, Dunnettovho viacnásobného porovnávacieho testu proti kontrolnej skupine L4440 AD liečenej 10 uM kyselinou kynurénovou, ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05. d Schéma mechanizmu, ktorým metabolity odstraňujú proteínové agregáty sprostredkovaním reakcie tepelného šoku. Navrhujeme, aby metabolická dysregulácia tak mohla byť predchádzajúcim faktorom, ktorý prispieva k nerovnováhe v homeostáze proteínov.

neošetrené GMC (AD) červy. To ukazuje, že kyselina kynurénová skutočne odstraňuje agregáty A 42, čo je sprostredkované týmito chaperónmi, čo vedie k zlepšeniu motility červov exprimujúcich A 42-. Celkovo naše údaje z western blotov, RTqPCR a RNAi naznačujú, že liečba kyselinou kynurénovou a karnozínom zvyšuje hladiny HSF-1 v cistanche modeli AD, čo vedie k transkripčnej upregulácii, a tým k zvýšeným hladinám DNJ{{ 3}} a DNJ-19 J-proteíny. Zdá sa, že to spolupracuje s a prinajmenšom vyžaduje viacero jadrových chaperónov, ako sú HSP70, HSP90 a HSP110 na ochranu proti agregácii A42 a súvisiacej toxicite v cistanche (obr. 8c). Naše údaje spolu ukazujú, ako dva metabolity spúšťajú cytosolickú rozloženú proteínovú odpoveď v cistanche modeli AD na odstránenie agregátov A 42 a ich súvisiacej toxicity. Keďže hladiny týchto metabolitov môžu súvisieť s vekom alebo s chorobou, navrhujeme, aby metabolity mohli byť induktormi ochranných bunkových odpovedí kontroly kvality, ktoré chránia pred agregáciou proteínov spojenou s ochorením (obr. 8c).

Diskusia

Ukázali sme, ako môže byť sieť proteínovej homeostázy, ktorá zahŕňa niekoľko vzájomne závislých mechanizmov vrátane molekulárnych chaperónov, detoxikačných enzýmov a mechanizmov klírensu proteínov54, modulovaná endogénnymi metabolitmi. Uviedli sme knižnicu endogénnych metabolitov, ktoré možno ďalej skúmať z hľadiska pôsobenia na rôzne bunkové mechanizmy spojené s homeostázou proteínov, a charakterizovali sme dva metabolity, karnozín a kyselinu kynurénovú, pre ich úlohu pri odstraňovaní proteínových agregátov. Tieto dva metabolity sú schopné inhibovať agregáciu A 42 v modeli cistanche AD spustením cytosolickej rozbalenej proteínovej odpovede sprostredkovanej prostredníctvom HSF-1 a zvýšenými hladinami DNJ-12 a DNJ-19 J - bielkoviny. Očakávame, že ďalšie štúdie odhalia, ako tieto metabolity zvyšujú hladiny HSF-1 a tým regulujú jeho funkciu.

Navrhujeme model obnovy proteínovej homeostázy endogénnymi metabolitmi (obr. 8c), kde dva endogénne metabolity regulujú HSF-1 a downstream chaperóny na odstránenie agregátov A 42. Pokiaľ ide o odstraňovanie agregátov, je pravdepodobné, že (1) agregáty sú hromadne odstraňované autofágiou, keďže autofágia bola spojená s aktivitou HSF-1 Kumsta a spolupracovníkov55, alebo (2) zvýšené chaperóny podporujú obrat A 42 proteínu, čím sa potláča tvorba agregátov. Nemôže sa stať, že chaperóny len blokujú agregáciu, pretože nevidíme zodpovedajúce zvýšenie hladiny rozpustného A 42. Karnozín je dipeptid, ktorý sa prirodzene vyskytuje v mozgu, obličkách a kostrových svaloch rýb, vtákov a cicavcov56. Postmitotické dospelé bunky majú vyššie koncentrácie karnozínu ako aktívne sa deliace bunky, hoci dôvody nie sú jasné57,58; syntéza karnozínu je spojená len s konečnými štádiami dozrievania gliových buniek. Je tiež prítomný iba v post-mitotických neurónoch sietnice, keď energetický metabolizmus prechádza z glykolýzy na oxidačnú fosforyláciu56. Zaujímavé je, že karnozín má tiež priaznivý, ale bližšie nešpecifikovaný organizačný účinok na mitochondrie; jeho hladiny sa menia s ohľadom na energetický metabolizmus bunky pri starnutí56. Celkovo tieto štúdie naznačujú, že karnozín má priaznivé účinky na bunkovú aktivitu.

Vidíme, že pri ochorení je karnozín znížený (tabuľka 1) a naše štúdie naznačujú, že suplementácia zachraňuje fenotyp ochorenia AD. Jeho následný metabolizmus pri suplementácii je problémom podčiarknutým pre budúce štúdium. Objasnenie mechanizmu jeho účinku v kontexte čistenia proteínových agregátov je preto užitočné pri využívaní jeho terapeutického potenciálu. Kyselina kynurenová je metabolit tryptofánu, ktorý má protizápalové a imunosupresívne funkcie59,60 okrem toho, že pôsobí ako antagonista ovplyvňujúci všetky ionotropné glutamátové receptory vrátane NMDA, AMPA a kainitových receptorov61. Hoci sa predpokladá, že kyselina kynurénová je neuroprotektívna pri veľkej väčšine neurologických stavov, jej mechanizmy účinku neboli úplne objasnené. Uvádza sa, že hladiny kyseliny kynurénovej a pridružených metabolitov sú dysregulované u ľudí s poruchami spánku62, 63 a depresiou64, ktoré vykazujú zvýšenú aj zníženú reguláciu (tabuľka 1). Uvádza sa, že vzorce spánku/bdenia sú v AD65 narušené. Hoci depresia bola spájaná ako rizikový faktor pre rozvoj AD, celogenómová asociačná štúdia nenaznačila žiadne významné genetické prekrývanie medzi týmito dvoma chorobami66; zaujímavé je, že prekrývanie by sa skutočne dalo vysvetliť narušením homeostázy neurotransmiterov67. Ďalej sa uvádza, že vytrvalostné cvičenie zvyšuje plazmatické hladiny kyseliny kynurenovej68. Predtým sa kynurenínová dráha považovala za regulátor proteínovej toxicity súvisiacej s vekom69.

V modeli cistanche van der Goot a kol. ukazujú, že deplécia tryptofánu 2,3-dioxygenázy (na-2), prvého enzýmu v kynurenínovej dráhe degradácie tryptofánu, zvyšuje hladiny tryptofánu a potláča toxicitu proteínov náchylných na agregáciu; navyše ukazujú, že podávanie L-tryptofánu tiež potláča toxicitu69. V tejto štúdii ukazujeme záchranu fenotypu ochorenia AD suplementáciou kyseliny kynurénovej; je známe, že u cistanche a cicavcov sa kyselina kynurénová vytvára v priestorovo obmedzených vzorcoch v nervovom systéme, takže si myslíme, že endogénna modifikácia jej hladín, tkanivovo špecifickým spôsobom, ďalej poskytne pohľad na to, ako jej endogénne hladiny ovplyvňujú cieľové proteíny . Naše výsledky o jeho mechanizme účinku na čistenie proteínových agregátov vrhajú svetlo na systematické využívanie jeho terapeutického potenciálu. Celkovo naše výsledky zdôrazňujú potrebu podrobnejšieho skúmania účinku abnormálnej homeostázy metabolitov pri vývoji porúch nesprávneho skladania proteínov. Závery Výsledky, ktoré sme uviedli v tejto štúdii, podporujú názor, že homeostáza metabolitov a homeostáza proteínov sú úzko spojené a nevyhnutné pre celkovú bunkovú homeostázu. Najmä homeostáza metabolitov môže byť narušená spôsobom súvisiacim s vekom a môže byť spojená s chorobami nesprávneho poskladania proteínov. Vo všeobecnosti naše výsledky podporujú názor, že opätovné vyváženie bunkovej homeostázy prostredníctvom udržiavania homeostázy metabolitov môže ponúknuť preventívne prístupy pre neurodegeneratívne ochorenia.

Metódy

Identification of endogenous metabolites in the HMDB. We used 200 molecules as starting points, hereby referred to as seeds, from Calamini et al. 34 to calculate fragments using a method reported by Joshi et al. 35. We screened the HMDB using similarity and Tanimoto coefficients (>0.6) počiatočných semien. Získané zhody boli filtrované, ak spĺňali nasledujúce podmienky: endogénne, kvantifikované a detegované, detekované v CSF. Ďalej sme vypočítali, či boli upregulované alebo downregulované na základe normálnych vs. abnormálnych fyziologických koncentrácií uvádzaných v HMDB. Tento krok sa uskutočnil prieskumom literatúry, aby sa posúdila ich asociácia s ochorením, kde sme metabolity zoradili na základe asociačného skóre, ktoré sme operatívne definovali ako počet štúdií, v ktorých bol metabolit hlásený ako dysregulovaný pri AD. Za týmto účelom sme hľadali v PubMed "Alzheimerova choroba A metabolit", kde „metabolit“ sa vzťahuje na každý metabolit v doplnkových údajoch 1.

Expresia, purifikácia a príprava vzoriek peptidu A42 na kinetické experimenty.

Rekombinantný peptid A 42 (MDAEFRHDSGYEVHHQKLVF FAEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIA) bol exprimovaný v kmeni Escherichia coli BL21 Gold (DE3) (Stratagene, CA, USA) a purifikovaný, ako je opísané vyššie70. V stručnosti, v procese čistenia boli bunky E. coli sonikované a inklúzne telieska boli následne rozpustené v 8 M močovine. Na uskutočnenie iónovo-výmennej chromatografie sa potom použila dietyl-aminoetylcelulózová živica a zozbieraný proteín sa lyofilizoval. Tieto frakcie sa potom ďalej purifikovali pomocou kolóny Superdex 75 26/60 (GE health, IL, USA) a frakcie obsahujúce rekombinantný proteín sa spojili, zmrazili a znova lyofilizovali. Roztoky monomérneho proteínu sa pripravili rozpustením lyofilizovaného peptidu A 42 v 6 M GuHCl a purifikáciou v 20 mM tlmivom roztoku fosforečnanu sodného, ​​20}0 uM EDTA, pH 8,0 pomocou Superdex {{15} }/300 stĺpec (GE Healthcare) pri druhej rýchlosti 0,5 ml/min. ThT sa pridal z 2 mM zásobného roztoku, čím sa získala konečná koncentrácia 20 uM. Všetky vzorky proteínov sa získali z rovnakého jediného prípravku a potom sa pipetovali do skúmaviek Eppendorf s nízkou väzbou. Každá vzorka sa potom napipetovala do viacerých jamiek 96-jamkovej doštičky s čírym dnom a nízkou väzbou s priehľadným dnom (Corning 3881), 80 ul na jamku, v neprítomnosti a prítomnosti rôznych molárnych ekvivalentov karnozínu alebo kyseliny kynurénovej, čím sa získa konečná koncentrácia 1 % DMSO (v/v). Agregácia A42 (pri koncentrácii 2 uM70,71,72 sa iniciovala umiestnením 96-jamkovej platne do čítačky platní (Fluostar Omega alebo Fluostar Optima od BMG Labtech, Aylesbury, UK) pri 37 stupňoch v kľude ThT FL fluorescencia sa monitorovala trojmo na vzorku, merané pomocou spodnej optiky s 440 nm excitačným a 480 nm emisným filtrom. Potom sa získali kinetické stopy pre každú jamku a potom sa spracovali na frakciu fibrilárnej hmoty normalizáciou fluorescencie ThT FL hodnoty v danom čase t oproti počiatočnej hodnote fluorescencie ThT FL (ktorá sa berie ako 0) a konečnej hodnote fluorescencie ThT FL na konci reakcie (ktorá sa berie ako 1,0).

Cistancheexperimenty Médiá. Na rozmnožovanie cistanche boli použité štandardné podmienky73. Stručne povedané, zvieratá sa synchronizovali bielením chlórnanom, vyliahli sa cez noc v M9 (3 g/l KH2P04, 6 g/l Na2HP04, 5 g/l NaCl, 1 uM MgS04) pufri a následne sa kultivovali pri 20 stupňoch na rastovom médiu nematód (NGM ) (CaCl2 1 mM, MgSO4 1 mM, cholesterol 5 µg/ml, 250 µM KH2PO4 pH 6, agar 17 g/l, NaCl 3 g/l, kazeín 7,5 g/l) naočkované platne s kmeňom E. coli OP50. Nasýtené kultúry OP50 sa pestovali naočkovaním 50 ml média LB (tryptón 10 g/l, NaCl 10 g/l, kvasinkový extrakt 5 g/l) s OP50 a inkubáciou kultúry počas 16 hodín pri 37 °C. Doštičky NGM sa naočkovali baktériami pridaním 350 ul nasýteného OP50 na každú platňu a platne sa nechali 2 až 3 dni pri 20 stupňoch. Na 3. deň po synchronizácii sa zvieratá umiestnili na NGM platne obsahujúce 5-flfluór-2′deoxyuridín (FUDR) (75 uM), aby sa inhiboval rast potomstva, a teplota sa zvýšila na 24 stupňov . Kmene. Všetky kmene boli získané z Caenorhabditis Genetics Center v Minnesote, ktoré je podporované NIH P40 OD010440. Na tieto experimenty sa použili dva kmene. Kmeň dvIs100 [unc-54p::A-beta-1-42::unc-54 3′-UTR a mtl-2p::GFP exprimujúci ľudský kmeň A citlivý na teplotu ] (GMC101), v ktorom mtl-2p::GFP spôsobuje črevnú expresiu GFP a unc{56}}p::A-beta- 1-42 exprimuje ľudský peptid A 42 v plnej dĺžke vo svalových bunkách steny tela. Zvýšenie teploty nad 20 stupňov v štádiu L4 alebo v dospelosti spôsobuje paralýzu v dôsledku agregácie A 42 vo svale steny tela. Kmeň N2 sa použil pre červy divokého typu.

Doštičky potiahnuté metabolitom. Alikvóty NGM média boli autoklávované a naliate a naočkované 350 ul OP50 kultúry a kultivované cez noc. Po inkubácii počas až 3 dní pri teplote miestnosti sa pridali alikvóty L-karnozínu (karnozín) alebo kyseliny kynurénovej (alebo iných metabolitov) rozpustených vo vode v rôznych koncentráciách. NGM platne obsahujúce FUDR (75 uM, pokiaľ nie je uvedené inak) sa naočkovali 2,2 ml alikvótmi zlúčeniny rozpustenej vo vode vo vhodnej koncentrácii. Platne sa potom umiestnili do digestora s laminárnym prúdením pri teplote miestnosti, aby sa vysušili a červy sa preniesli na platne potiahnuté metabolitom v larválnom štádiu L4. Šesť metabolitov sa spočiatku skrínovalo v tekutom médiu41. Karnozín bol pripravený pri teplote miestnosti na zásobnú koncentráciu 5 mM. Kyselina kynurénová sa pripravila pri 5 mM a rozpustenie zlúčeniny sa uskutočnilo pri 100 stupňoch. Zásoby zlúčeniny sa až do použitia udržiavali pri -20 stupňoch a nikdy sa nerozmrazovali viac ako raz.

Automated motility assay. At different ages, animals were washed off the plates with M9 buffer and spread over an OP50 un-seeded 6 cm plate, after which their movements were recorded at 20 fps using a recently developed microscopic procedure for 60–90 s41,74. Approximately 100–600 animals were counted per condition at each indicated time point, unless otherwise specified for >600 (doplnkové údaje 2). Automatizovaný softvér na sledovanie motility zabraňuje podceňovaniu chýb spôsobených kolíziami a prekrývaním červov; zisťuje celkový počet červov a tiež poskytuje horný limit chýb tým, že berie do úvahy maximálny počet červov prítomných v jednom rámci súčasne (doplnkové údaje 2)41.

NIAD-4 farbenie a zobrazovanie. Roztok NIAD-4 bol pripravený rozpustením v 100% DMSO na 1 mg/ml. Pred inkubáciou červov sa vytvorilo riedenie 1/1000 v M9. Po skríningu pomocou platformy Wide-Field Nematode Tracking Platform sa asi 300 červov za podmienok zhromaždilo v médiu M9 a centrifugovalo sa pri 20 stupňoch pri 2000 ot./min. počas 2 minút na peletu. Potom sa do pelety pridal 1 ml zriedeného roztoku NIAD-4 v M9 a zmes sa jemne pretrepávala (80 otáčok za minútu) počas 6 hodín. Červy sa potom preniesli na nenaočkované NGM platne a inkubovali sa pri 20 stupňoch počas dvanástich hodín. Červy sa znova premyli z platní médiom M9, odstredili, premyli 10 ml M9 a resuspendovali v 2 ml M9. Po gravitačnej sedimentácii bolo 15 ul roztoku červov nanesených na 4 percentné agarózové vankúšiky. Na anestéziu zvierat boli pridané 4 ul 40 mM NaN3 a následne sklenené krycie sklíčko. Červy boli zobrazené pomocou Zeiss Axio Observer

Fluorescenčný mikroskop A1 FL (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Nemecko) s objektívom ×20 a filtrom 49004 ET-CY3/TRITC (Chroma Technology Corp, VT, USA). Použil sa expozičný čas 1000 ms. Nominálne zväčšenie bolo × 40 a snímky boli zachytené pomocou kamery Evolve 512 Delta EMCCD s vysokou kvantovou účinnosťou (Photometrics, Tucson, AZ, USA). Analyzovalo sa približne 11 až 30 zvierat na podmienky, pokiaľ nie je uvedené inak, a štatistika sa vykonala s použitím jednosmernej ANOVA proti neošetrenej skupine.

Všetky tu uvedené štatistiky boli uskutočnené pomocou GraphPad Prism. Kvantifikácia sa uskutočňovala pomocou ImageJ (NIH, MD, USA), aby sa určil priemer intenzity šedej v hlave každého zvieraťa. Filter „oheň“ sa v ImageJ použil na vizualizáciu agregátov zafarbených NIAD-4-. Celková intenzita (stredná hodnota šedej) hlavy červa sa vypočítala načrtnutím oblasti hlavy červa od nosa po hltan. Na 5. deň je maximálny priemer červov cez hlavu 80 µm. Potom sa vypočítalo priemerné (tri namerané hodnoty) pozadie rovnakej oblasti inde na obrázku a odpočítalo sa od celkovej strednej hodnoty šedej hlavy červa. Výsledná intenzita, po odčítaní pozadia, poskytuje odčítanie agregátov zafarbených NIAD-4, ktoré sa javia ako oranžovo-červené a sú označené šípkami na príslušných paneloch obrázkov. Western bloty. Približne 3000 červov za podmienok bolo lyzovaných v PBS.

K lyzátu sa pridal koktail inhibítorov proteázy (Sigma MS-SAFE Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail). Anti-tubulín (monoklonálna anti-alfa tubulínová protilátka produkovaná v myšiach, Sigma, T6074) sa použil na detekciu konštitutívne exprimovaného tubulínu na normalizáciu koncentrácií proteínov. Protilátka HSF1 bola získaná od Veena Prahlad (Iowa), HSP90 (králičia anti-DAF-21) od Patricie Van Oosten-Hawle (Leeds), HSP40 (anti-DNJ-12, DNJ-13 a DNJ-19, všetky chované na králikoch) od Janine Kirstein (Berlín), HSP70 od Johna Labbadia (UCL, Londýn).

Boli použité myšie a králičie sekundárne protilátky (konjugované sekundárne protilátky Alexa Fluor 488-). Všetky kvantifikácie sa uskutočňovali pomocou softvéru ImageJ na určenie intenzity proteínového pásu pomocou denzitometrie.{1}} Pre jednotlivé podmienky sa použili technické replikáty a štatistika sa vykonala pomocou dvojcestnej ANOVA proti neošetrenému divokému typu (N2) a ošetrenému A 42 ( GMC) červy, skupiny. Všetky štatistiky boli vykonané pomocou GraphPad Prism.

RNA interferencia. Baktérie nesúce prázdny vektor (L4440) alebo vektor obsahujúci hsf-1 dsRNA sa pestovali pri 37 stupňoch cez noc v LB obsahujúcom 100 ug/ml ampicilínu. Po raste cez noc sa kultúry indukovali s 5 mM IPTG a nechali sa rásť ďalšie 3 hodiny pri 37 stupňoch. RNAi kultúry sa nechali ochladiť na teplotu miestnosti a potom sa naočkovali na NGM platne obsahujúce 100 ug/ml ampicilínu a 1 mM IPTG. Bakteriálne trávniky sa potom nechali sušiť 4 dni na lavičke. Kontrolné, hsf{10}} a downstream chaperónové RNAi klony boli získané z Ahringerovej RNAi knižnice a pred použitím boli sekvenčne validované. Okrem toho sa v predchádzajúcich publikáciách ukázalo, že tieto klony znižujú svoje zamýšľané ciele48, 75, 76.

Extrakcie RNA, syntéza cDNA a RTqPCR. Približne o 700, 5. deň, boli dospelé červy resuspendované v 250 ul Trizolu a homogenizované trojitým vortexovaním počas 10 minúty nepretržite, s 20 minútovou prestávkou periódy na ľade medzi každým kolom vortexovania. Pridal sa chloroform (1/5 objemu) predtým, ako sa vzorky pretrepávali 15 s ručne, a potom sa centrifugovali pri 13,000×g počas 15 minút. Vodná fáza sa oddelila a zmiešala s rovnakým objemom 70 % etanolu. RNA sa potom purifikovala pomocou súpravy RNeasy podľa pokynov výrobcu. cDNA sa potom syntetizovala z 1 ug celkovej RNA s použitím iScript cDNA syntéznych činidiel (BioRad). RTqPCR sa uskutočnilo s použitím BioRad Advanced SYBR green master mix a BioRad CFX96 termocykléra s použitím primérov opísaných v tabuľke 2. Metóda štandardnej krivky sa použila na kvantifikáciu génovej expresie a relatívna expresia požadovaných génov bola normalizovaná na domáce gény rpb{{15} } a cdc{16}}. Štatistika a reprodukovateľnosť. Údaje prezentované ako priemer ± SEM boli testované na významnosť v jednosmernej ANOVA s použitím GraphPad Prism. Post-hoc porovnania sa uskutočňovali s použitím Dunnettových viacnásobných porovnaní (obr. 3, 5, 7 a 8) a Tukeyho párového porovnania (obr. 6). Pre kinetické profily agregácie na obr. 4 sú chybové úsečky znázornené z troch technických replikátov. Veľkosť vzorky: (a) testy motility n=100–600 červov, pokiaľ nie je uvedené inak (b) western bloty n=~3000 červov pre každý experimentálny replikát, (c) agregácia NIAD{29}} test n=11–30 zvierat na podmienky pre GMC a n=~10–12 zvierat na kontrolu (N2) a (d) qPCR n=4 biologických replikátov. Všetky skríningy, vrátane RNAi, sa uskutočňovali pomocou sledovača motility červov, ktorý oslepoval skupinovú identitu a potom sa porovnával. Významné výsledky boli označené podľa kritických p-hodnôt: ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05.

Referencie

1. De Strooper, B. & Karran, E. Bunková fázaAlzheimerova choroba. Cela 164, 603-615 (2016).

2. Knowles, TP, Vendruscolo, M. & Dobson, CM Amyloidný stav a jeho spojenie s chorobami nesprávneho poskladania proteínov. Nat. Mol. Cell Biol. 15, 384 – 396 (2014).

3. Selkoe, DJ & Hardy, J. The amyloid hypothesis ofAlzheimerova chorobavo veku 25 rokov. EMBO Mol. Med. 8, 595 – 608 (2016).

4. Hipp, MS, Park, SH & Hartl, FU Porucha proteostázy pri chorobách nesprávneho poskladania a agregácie proteínov. Trends Cell Biol. 24, 506 – 514 (2014).

5. Morimoto, RI & Cuervo, AM Proteostáza a proteóm starnutia v zdraví a chorobe. J. Gerontol. A 69 (Suppl. 1), S33 – S38 (2014).

6. Gomes, AP & Blenis, J. Nexus pre bunkovú homeostázu: súhra medzi metabolickými a signálnymi transdukčnými dráhami. Curr. Opin. Biotechnol. 34, 110 – 117 (2015). 7. Wilson, DF Regulácia bunkového metabolizmu: programovanie a udržiavanie metabolickej homeostázy. J. Appl. Physiol. (1985) 115, 1583 – 1588 (2013).

8. Fontana, L. & Partridge, L. Podpora zdravia a dlhovekosti prostredníctvom stravy: od modelových organizmov po ľudí. Cela 161, 106–118 (2015).

9. Longo, VD & Mattson, MP Fasting: molekulárne mechanizmy a klinické aplikácie. Cell Metab. 19, 181 – 192 (2014).

10. Sinclair, DA Smerom k jednotnej teórii kalorického obmedzenia a regulácie dlhovekosti. Mech. Starnutie Dev. 126, 987-1002 (2005).

11. Burkewitz, K., Zhang, Y. & Mair, WB AMPK v súvislosti medzi energetikou a starnutím. Cell Metab. 20, 10 – 25 (2014).

12. Johnson, SC, Rabinovich, PS & Kaeberlein, M. mTOR je kľúčovým modulátorom starnutia a chorôb súvisiacich s vekom. Nature 493, 338–345 (2013).

13. Salminen, A. & Kaarniranta, K. AMP-aktivovaná proteínkináza (AMPK) riadi proces starnutia prostredníctvom integrovanej signálnej siete. Ageing Res. Rev. 11, 230–241 (2012).

14. Zoncu, R., Efeyan, A. & Sabatini, DM mTOR: od integrácie rastového signálu k rakovine, cukrovke a starnutiu. Nat. Mol. Cell Biol. 12, 21 – 35 (2011).

15. Burte, F. a kol. Narušená mitochondriálna dynamika a neurodegeneratívne poruchy. Nat. Neurol. 11, 11 – 24 (2015).

16. Bush, AI Metalobiológia Alzheimerovej choroby. Trendy Neurosci. 26, 207-214 (2003).

17. D'Amelio, M. & Rossini, PM Excitabilita mozgu a konektivita neurónových zostáv pri Alzheimerovej chorobe: od zvieracích modelov po ľudské nálezy. Prog. Neurobiol. 99, 42 – 60 (2012).

18. Freer, R. a kol. Podpis proteínovej homeostázy v zdravých mozgoch rekapituluje zraniteľnosť tkaniva voči Alzheimerovej chorobe. Sci. Adv. 2, 1600947 (2016).

19. Ishii, M. & Iadecola, C. Metabolické a nekognitívne prejavy Alzheimerovej choroby: hypotalamus ako vinník aj cieľ patológie. Cell Metab. 22, 761 – 776 (2015).

20. Knobloch, M. & Jessberger, S. Metabolizmus a neurogenéza. Curr. Opin. Neurobiol. 42, 45 – 52 (2017).

21. Labbadia, J. & Morimoto, RI Biológia proteostázy pri starnutí a chorobách. Annu. Biochem. 84, 435 – 464 (2015).

22. Lovell, MA & Markesbery, WR Oxidačné poškodenie DNA pri miernej kognitívnej poruche a neskoršom štádiu Alzheimerovej choroby. Nucleic Acids Res. 35, 7497-7504 (2007).

23. Menzies, FM, Fleming, A. & Rubinsztein, DC Ohrozená autofágia a neurodegeneratívne ochorenia. Nat. Neurosci. 16, 345 – 357 (2015).

24. Palop, JJ & Mucke, L. Neurónová dysfunkcia vyvolaná amyloidom beta pri Alzheimerovej chorobe: od synapsií k neurónovým sieťam. Nat. Neurosci. 13, 812-818 (2010).

25. Weissman, L. a kol. Chybná oprava excízie DNA bázy v mozgu od jedincov s Alzheimerovou chorobou a amnestickou miernou kognitívnou poruchou. Nucleic Acids Res. 35, 5545 – 5555 (2007).

26. Winner, B. & Winkler, J. Neurogenéza dospelých pri neurodegeneratívnych ochoreniach. Cold Spring Harb. Perspektíva. Biol. 7, a021287 (2015).

27. Wyss-Coray, T. Zápal pri Alzheimerovej chorobe: hnacia sila, okoloidúci alebo prospešná reakcia? Nat. Med. 12, 1005-1015 (2006).

28. Yao, J. a kol. Mitochondriálny bioenergetický deficit predchádza Alzheimerovej patológii u samičích myších modelov Alzheimerovej choroby. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 14670–14675 (2009).

29. Chiti, F. & Dobson, CM Nesprávne poskladanie proteínov, tvorba amyloidu a ľudské ochorenie: zhrnutie pokroku za posledné desaťročie. Annu. Biochem. 86, 27 – 68 (2017).

30. Benilova, I., Karran, E. & De, B. Strooper, toxický oligomér Abeta a Alzheimerova choroba: cisár, ktorý potrebuje šaty. Nat. Neurosci. 15, 349 – 357 (2012).

31. Gidalevitz, T., Prahlad, V. & Morimoto, RI Stres z nesprávneho poskladania proteínov: od jednotlivých buniek po mnohobunkové organizmy. Cold Spring Harb. Perspektíva. Biol. 3, a009704 (2011).

32. Walter, P. & Ron, D. Rozložená proteínová odpoveď: zo stresovej dráhy tohomeostatickej regulácie. Science 334, 1081–1086 (2011).

Požiadajte o viac:E-mail:{1}} Whatsapp plus 86 15292862950