Účinok znižovania kyseliny močovej a mechanizmu akteozidu a echinakoozidu extrahovaných z cistanche tubulosa
Mar 03, 2025
Abstrakt:Cieľom je preskúmať účinky znižujúceho kyselinu močovú a mechanizmy akteozidu (AS) a echinakoozidu (ECH) extrahovaných zCistanche tubulosa.
MetódyHyperurikémia (HUA) Model potkanov bol založený pomocou oxonátu draselného (1,5 g · kg -1 · d {{}}) kombinovaný s adenínom (100 mg · kg -1 · d {{}}). Potkany modelu HUA boli náhodne rozdelené do modelovej kontrolnej skupiny, alopurinolovej skupiny (30 mg · kg -1 · d {{{}), ako nízka a vysoká (50, 100 mg · kg {{}} · d {{13}) Dávky a {50, 50, 50, 50, 50, 100, 50, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 50, 50, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 100, 50, 50, 50, 50, 100, 50, 50, 100, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 100, 50, 100, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50 {}} {{13}) mg · kg -1 · d -1) dávkové skupiny. Normálna kontrolná skupina bola predtým stanovená. Po štyroch týždňoch podávania sa analyzátor biochemických krvi použil na detekciu močoviny SUA, CREA, adenozín deaminázy (ADA) a kyseliny močovej (UUA) v moči. Imunosorbentový test spojený s enzýmom sa použil na detekciu hladín xantínu oxidázy (XOD) v sére. Zhromaždilo sa tkanivo obličiek a odvážil sa a vypočítal koeficient obličiek. Farbenie hematoxylínu eozín (HE) sa použilo na pozorovanie patologických zmien obličiek. Imunohistochémia (IHC) a PCR v reálnom čase sa použili na detekciu hladín expresie proteínu a mRNA transportéra 1 (URAT1), glukózového transportéra 9 (GLUT9), organického aniónového transportéra 1 (OAT1) a organického aniónového transportéra 3 (OAT3) v renálnom tkanive. Výsledky AS a ECH by mohli zlepšiť funkciu obličiek u modelových potkanov HUA, znížiť hladiny kyseliny močovej v krvi, podporovať vylučovanie kyseliny močovej, downregulovať hladiny ADA a XOD v sére a zvýšiť expresiu proteínu a mRNA mRNA v renálnom tkanive, pri regulácii proteínu a mRNA expresie OAT1 a OAT3 v renálnom tkanive.
Závery Fenyletanoidné glykozidy As a ECH z cistanche tubulosa môžu mať účinky znižovania kyseliny močovej zlepšením funkcie obličiek u potkanov modelu HUA, znížením hladín ADA a XOD a reguláciou expresie URAT1, GLUT9, OAT1 a OAT3.
Kľúčové slová: cistanche tubulosa; akteozid; echinacozid; hyperurikémia; redukcia kyseliny močovej; mechanizmus
Extrakt z cistanche tubulosa so 16% Acteosidom
Hyperurikémia (HUA) je metabolické ochorenie spôsobené neusporiadaným metabolizmom purínu v ľudskom tele, čo vedie k zvýšeniu hladín kyseliny močovej krvi [1]. Zvyčajne sa diagnostikuje, keď hladiny kyseliny močovej močovej prekročenia 7. 0 mg · dl⁻⁻ (416. 0 μmol·l⁻⁻) u mužov a 6. {0 mg · dl⁻⁻ (357. Vývoj hyperurikémie je primárne spojený s faktormi, ako sú vysokorustné diéty, chronická konzumácia alkoholu, užívanie liekov a hypotyreóza. Nielenže zvyšuje riziko kardiovaskulárnych chorôb, cukrovky a hypertenzie [3-4], ale významne ovplyvňuje zdravie pacientov.
V súčasnosti klinická liečba hyperurikémie zahŕňa najmä lieky, ktoré inhibujú produkciu kyseliny močovej a podporujú vylučovanie kyseliny močovej. Tieto liečby však majú určité obmedzenia pre pacientov so zhoršenou funkciou pečene alebo obličiek [5-6]. Preto skúmanie účinných liekov s nízkymi vedľajšími účinkami má veľký význam pre prevenciu a liečbu hyperurikémie.
Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wight, bežne používaná v tradičnej čínskej medicíne ako bylina tónovanie obličiek, sa používa na liečbu stavov, ako je impotencia, neplodnosť, nedostatok podstaty a krvi, slabosť v dolnej časti chrbta a kolená, svalová slabosť a zápcha v dôsledku črevnej suchosti [7]. Štúdie to ukázaliCistanche tubulosamá neuroprotektívne [8], protizápalové [9], reguláciu metabolizmu kostí [10] a účinky zvyšujúce účinnosť pri chemoterapii u pacientov s rakovinou [11]. Medzi jeho rôzne aktívne zložky sú fenyletanoidné glykozidy najpohyblivejšie.
Acteosid (AS) a echinacozid (ECH), dva fenyletanoidové glykozidy s vysokým obsahom vCistanche tubulosa, vykazuje silnú biologickú aktivitu a má významný potenciál pre vývoj a aplikáciu. V dôsledku toho bola naša výskumná skupina vybraná AS a ECH pre ďalšie štúdium. Prostredníctvom sieťovej farmakológie predpovedí a predbežných experimentov u myší sme zistili, že fenyletanoidové glykozidové extrakty zCistanche tubulosaMôže mať určitý účinok na zníženie kyseliny močovej. Cesty a mechanizmy týchto účinkov však zostávajú nejasné.
Použitím mechanizmov produkcie kyseliny močovej a jej primárnych vylučovacích dráh ako zamerania na výskum sme teda skúmali účinky fenyletanoidných glykozidových extraktov AS a ECH. Cieľom tejto štúdie je objasniť dráhy a mechanizmy, prostredníctvom ktorých AS a ECH vyvíjajú svoje účinky na zníženie kyseliny močovej kyseliny.
1 materiály
1.1 Experimentálne zvieratá
Sedemdesiat mužských potkanov Sprague-Dawley (SD) SPF (SD) s hmotnosťou 150-180 g bolo zakúpených v experimentálnych zvieracích centrách Animal of Xinjiang Medical University. Číslo licencie na výrobu zvierat: scxk (xin) 2023-0001. Tento experiment bol schválený Výborom pre etiku zvierat vo výskumnom inštitúte Autonómnej oblasti Uygur Medicine Research Institute s číslom schválenia etiky zvierat: IACUC- (ZHUN) -2024-009.
1,2 drogy a reagencie
Fenyletanoidové glykozidové extrakty (AS a ECH)odCistanche tubulosa (purity >98%, overené vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou) sa extrahovalo, vyčistilo a pripravilo sa kľúčovým laboratórnym laboratóriám Uygur Formulation Science, Autonómny región Xinjiang Uygur Medicine Research Institute. Čísla šarží: 20220617 (AS) a 20220526 (ECH).
Tablety alopurinol, dávkové číslo: 62208726, vyrobené Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Oxonát draselnéhoaadenine, dávkové čísla: I2130050 a C2202255, zakúpené od Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Crea (kreatinín), UA (kyselina močová), močovina a ADA (adenozín deamináza), dávkové čísla: 141123010, 141223004, 141323008 a 043624005, zakúpené od Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.
XOD (xantín oxidáza) súprava aktivity, dávkové číslo: Y10001219, zakúpené od Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.
Protilátky (URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3), dávkové čísla: 3i5723 0, 92F0296/4, 0F33081/2I44618, zakúpené od Affinity Biosciences.
HRP-značený kozí anti-králičie IgG, dávkové číslo: 245440113, zakúpené od ZSGB-BIO.
Roztok farbenia hematoxylínu, dávkové číslo: 24135741h, zakúpené od Peking Lanjieke Technology Co., Ltd.
Súprava na chromogénne činidlá DAB, Číslo šarže: 240010512, zakúpené od ZSGB-BIO.
Depc (dietyl pyrokarbonát), katalógové číslo: D 60029-500 ml, zakúpené od Amresco (USA).
M5 hiclear DL2000 DNA marker, Katalógové číslo: MF025, zakúpené od spoločnosti Peking Genomics Biotechnology Co., Ltd.
TRIZOL ™ Reagent, Katalógové číslo: 15596026, zakúpené od spoločnosti Thermo Fisher Scientific (USA).
5x MasterMix all-in-one RTaEvagreen Express 2 × qPCR MasterMix-Low Rox, Katalógové čísla: G492 a G891, obidve zakúpené od spoločnosti Applied Biological Materials Inc. (ABM).
2 metódy
2.1 Zriadenie a zoskupovanie modelu
Sedemdesiat mužských potkanov Sprague-Dawley (SD) bolo aklimatizovaných a rozdelených do dvoch skupín: normálna kontrolná skupina (1 0 potkany) a kontrolná skupina modelov (60 potkanov). Normálna kontrolná skupina bola podaná 0,5% CMC-NA prostredníctvom gavage. Model kontrolnej skupine sa podával oxonát draselný (1,5 g · kg⁻⁻) kombinovaný s adenínom (100 mg · kg⁻⁻) v dávke 10 ml · kg⁻⁻, raz denne počas 14 po sebe nasledujúcich dní. Model sa považoval za úspešne stanovený, keď sa hladiny močoviny, CREA a SUA významne zvýšili, merané biochemickým analyzátorom.
Potkany s hyperurikémovým modelom boli ďalej rozdelené do nasledujúcich skupín na základe SUA, močoviny a úrovne CREA: Model Control Group, Alopurinol Group (3 {{{{{{{{{} Mg · kg⁻⁻), nízka dávka ako skupina (50 mg · kg⁻), and Skupina ECH s vysokou dávkou (100 mg · kg⁻⁻), s 10 potkanmi v každej skupine. Na udržanie stabilnej hyperurikémie sa všetky skupiny s výnimkou normálnej kontrolnej skupiny podávali oxonát draselný (500 mg · kg⁻⁻) kombinovaného s adenínom (100 mg · kg⁻⁻) cez ranu, po ktorej nasledovalo podávanie príslušných liekov v každej liečbe v popoludňajších hodinách. Normálna kontrolná skupina dostala ráno 0,5% roztok CMC-NA a popoludní pitná voda v dávke 10 ml · kg⁻⁻, raz denne počas 14 po sebe nasledujúcich dní. Potom bolo zastavené podávanie modelovacích látok a príslušné lieky sa neustále podávali denne ďalších 14 dní.
2.2 Zber vzoriek
Po konečnej dávke sa potkany postili cez noc (voda nebola obmedzená). Moč z každej skupiny sa zbieral na testovanie kyseliny močovej. Po pôstu sa merala telesná hmotnosť a vzorky krvi sa odobrali v anestézii. Sérum bolo oddelené odstredením a uložené na budúce použitie. Zhromaždili sa a odvážili tkanivá obličiek. Jedna oblička bola fixovaná v 4% roztoku paraformaldehydu, zatiaľ čo druhá bola zamrznutá v kvapalnom dusíku na ďalšiu analýzu.
2.3 Meranie kyseliny močovej v moči potkanov
Vzorky moču z každej skupiny boli odstredené (3, 000 r · min⁻, 10 minút, odstredivka polomer 14 cm) a zhromaždil sa supernatant. Vzorky moču sa zriedili 1: 9 so fyziologickým roztokom a analyzovali sa na obsah kyseliny močovej pomocou biochemického analyzátora.
2.4 Meranie ADA, močoviny, CREA a SUA v sére potkanov
Vzorky krvi z každej skupiny boli odstredené (3, 000 r · min⁻, 10 minút, odstredivka 14 cm) a odobralo sa sérum. Hladiny ADA, močoviny, CREA a SUA v sére sa merali pomocou biochemického analyzátora.
2,5 Meranie XOD v sére potkanov
Zmeny hladín XOD v sére potkanov sa merali pomocou enzymatického testu podľa pokynov výrobcu. Zaznamenala sa počiatočná absorbancia (A₁) a konečná absorbancia (A₂) pri 290 nm a vypočítala sa AA (ΔA=a₂ - a₁). AA sa nahradil do vzorca:
XOD (nmol⁻⁻ · min⁻ · ml⁻⁻)=[ΔA × reakčný systém celkový objem ÷ (koeficient molárneho vyhynutia kyseliny močovej × Optická dráha) × 10⁹] ÷ Vzorový objem {{{{}} × ΔA,
Na výpočet množstva kyseliny močovej katalyzovanej za minútu na mililiter séra.
2,6 Meranie koeficientu obličiek
Zhromaždili sa tkanivá obličiek, premyli sa soľným roztokom a prebytočná voda sa odstránila. Hmotnosť orgánov bola presne zmeraná a koeficient obličiek bol vypočítaný nasledovne:
Koeficient obličiek=Hmotnosť obličiek (mg) / telesná hmotnosť (G).
2.7 Histopatologické pozorovanie tkaniva obličiek zafarbením
Tkanivá obličiek fixované v 4% paraformaldehydovom roztoku sa dehydratovali s odstupňovanými koncentráciami etanolu, vyčistené xylénom, zabudované do parafínu a rozdelené do plátkov 4- μM. Rezy boli deparafinizované xylénom, hydratované odstupňovaným etanolom, zafarbené hematoxylínom a eozínom (HE) a utesnené neutrálnou ďasnou. Morfologické zmeny v tkanive obličiek boli pozorované pod svetlom mikroskopu a obrázky boli zachytené pri 400 -násobnom zväčšení.
2.8 Detekcia expresie proteínu URAT1, GLUT9, OAT1 a OAT3 v tkanive obličiek IHC
Tkanivá obličiek fixované v 4% roztoku paraformaldehydu boli dehydratované s odstupňovanými koncentráciami etanolu, vyčistených xylénom, vložené do parafínu a rozdelené. Uskutočnilo sa blokovanie antigénu a blokovanie kozieho séra. Primárne protilátky (URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3) sa pridali pri riedení 1: 200 a inkubovali sa cez noc pri 4 stupni. Nasledujúci deň boli rezy premyté PBS, sušené na vzduchu a inkubované s biotínovou kozou anti-králičou IgG pri 37 stupňoch počas 30 minút. Rezy sa premyli PBS a inkubovali sa s chromogénnym činidlom DAB po dobu 10 minút, nasledovalo opláchnutie PBS, farbenie hematoxylínu počas 3 minút, diferenciáciu s roztokom etanolu kyseliny hydrochlorovej, čloholtiny uhličitanu litium, dehydratácia s gradientom etanolom s gradientom etanolom, odstraňovaním xylénu a tesnením neutrálnym GUM.
Pre každého potkana boli vybrané dva náhodné 4 0 0 × polia obličkových sekcií. Analyzovalo sa pozitívne farbenie (hnedo-žltá) a integrovaná optická hustota (IOD) každého poľa sa merala pomocou Image-Pro Plus 6.0 na štatistickú analýzu.
