Variácie v génovej expresii medzi dvoma cirokovými dvojfarebnými líniami líšiacimi sa vrodenou imunitnou odpoveďou

Abstrakt:

Imunita (MTI) spustená molekulárnym vzorom spojeným s mikróbmi (MAMPs) je kľúčovou zložkou vrodenej imunitnej odpovede rastliny na rozpoznanie mikróbov. Väčšina našich súčasných poznatkov o MTI však pochádza z modelových rastlín (tj Arabidopsis thaliana) s porovnateľne menej práce vykonanej s použitím plodín. V tejto práci sme študovali oxidačný výbuch (ROS) spustený MAMP a transkripčnú odpoveď v dvoch genotypoch Sorghum bicolor, BTx623 a SC155-14E. SC155-14E je línia, ktorá vykazuje vysokú odolnosť voči antraknóze a línia BTx623 je citlivá na antraknózu. Naše výsledky odhalili jasnú variáciu v génovej expresii a ROS v reakcii na vyvolanie bičíka (flg22) alebo chitínu medzi týmito dvoma líniami. Zatiaľ čo transkripčná odpoveď na každý MAMP a v každej línii bola jedinečná, existoval značný stupeň prekrývania a boli sme schopní definovať základnú sadu génov spojených s transkripčnou odpoveďou MAMP z ciroku. Analýza obohatenia GO termínu a KEGG dráhy objavila viac DEG súvisiacich s imunitou a rezistenciou voči patogénom vo vzorkách SC155-14E ošetrených MAMP ako v BTx623 s rovnakou liečbou. Výsledky poskytujú základ pre budúce štúdie na skúmanie dráh vrodenej imunity v ciroku, vrátane úsilia o zvýšenie odolnosti voči chorobám.

Kliknutím kúpiteprodukt na zlepšenie imunity

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Kľúčové slová:

Cirok dvojfarebný; ROS; vrodená imunita; MAMPs; RNA-sekv; génová expresia

1. Úvod

Rastliny sú prirodzene vystavené rôznym stresom, vrátane mnohých bakteriálnych, hubových a vírusových patogénov [1]. Rastliny sa chránia pred patogénmi pomocou vopred vytvorených štruktúr a chemikálií a reakcií imunitného systému vyvolaných infekciou. Imunitný systém rastlín využíva dvojúrovňový systém vnímania s dvoma vzájomne prepojenými vrstvami receptorov.

Prvá vrstva je aktivovaná povrchovo lokalizovanými receptormi rozpoznávania vzorov (PRR), ktoré snímajú molekuly mimo bunky rozpoznávaním invázneho patogénu prostredníctvom detekcie konzervovaných štrukturálnych motívov, nazývaných molekulárne vzory spojené s mikróbmi (MAMPs), ktoré spúšťajú mierny, ale široká, obranná reakcia [2]. Flagelín, chitín, lipopolysacharidy, peptidoglykány (PGN) a elongačný faktor Tu sú príkladmi dobre preštudovaných MAMP [3–5]. Táto obranná odpoveď sa nazýva MAMPtrigged imunita (MTI) [6]. Druhá vrstva obrany známa ako efektorom spúšťaná imunita (ETI) sa vyskytuje v reakcii na špecifické efektorové proteíny odvodené od patogénov, ktoré rastlina rozpoznáva prostredníctvom pôsobenia proteínov rezistencie, čo vedie k silnej, ale vysoko špecifickej imunitnej odpovedi. ETI možno často rozpoznať indukciou lokalizovanej bunkovej smrti nazývanej hypersenzitívna odpoveď (HR) [7]. Systémy MTI aj ETI snímajú patogény a reagujú aktiváciou antimikrobiálnej obrany v infikovanej bunke a susedných bunkách [3,8]. Rastliny tiež nesú imunitné receptory, ktoré rozpoznávajú vysoko variabilné efektory patogénov, medzi ne patrí trieda proteínov NBS-LRR [9].

Okrem toho, systémová získaná rezistencia (SAR) je odpoveďou na rezistenciu „celej rastliny“, ku ktorej dochádza po skoršej lokalizovanej expozícii patogénu. SAR je spojená s indukciou širokého spektra génov (gény súvisiace s patogenézou) a aktivácia SAR si vyžaduje akumuláciu endogénnej kyseliny salicylovej (SA) [10].

Štúdie vykonané primárne s použitím Arabidopsis ukázali, že MTI môže spôsobiť rôzne reakcie vrátane zmien v produkcii reaktívnych foriem kyslíka (ROS), produkcie reaktívnych foriem dusíka, ako je oxid dusnatý (NO), ukladanie kalózy, hladiny vnútrobunkového vápnika, tok iónov cez plazmu. membrána, indukcia alebo represia expresie niekoľkých génov súvisiacich s obranou rastlín, zmeny v bunkovej stene rastlín, indukcia antimikrobiálnych zlúčenín a syntéza proteínov súvisiacich s patogenézou (PR) [3,11].

Hoci viaceré z týchto MTI reakcií možno považovať za všeobecné reakcie rastlín, ich rozsah môže byť špecifický pre rastlinný druh a dokonca aj pre kultivar [12–17]. Boli vyvinuté metódy na kvantifikáciu MTI reakcie rastlín. Tieto metódy zahŕňajú meranie produkcie ROS alebo NO, mitogénom aktivovanú fosforyláciu proteínkinázy, špecifickú génovú expresiu indukovanú MAMP, inhibíciu rastu semenáčikov, lignín a fenoly viazané na bunkovú stenu a rezistenciu voči bakteriálnym a hubovým patogénom indukovanú MAMP [18–20].

Sorghum bicolor (L.) Moench je kľúčová celosvetová obilnina, ktorá bola prispôsobená rôznym biotopom a vyšľachtená na rôzne účely [21]. Očakáva sa, že pestovanie ciroku sa celosvetovo výrazne zvýši ako jedna z hlavných plodín na výrobu potravín a biomasy [22].

S rastúcimi praktikami a geografickými oblasťami pestovania ciroku je nevyhnutné, aby sa zvýšil tlak chorôb. Cirok sa medzi ostatnými obilninami vyznačuje nezvyčajne širokým spektrom chorôb, ktoré sú jedným z najdôležitejších obmedzení jeho produkcie. Celosvetovo rozšírené hubové choroby sú najničivejšie choroby ciroku, ktoré majú za následok obrovské straty na úrode, čo sa týka množstva aj kvality zŕn [23]. Antraknóza je jednou z najzávažnejších hubových chorôb ovplyvňujúcich úrodu zrna ciroku a produkciu biomasy. Straty na úrode v dôsledku tohto patogénu môžu byť u citlivých kultivarov 50 až 70 percent [24,25]. Rastliny vyvinuli rôzne obranné stratégie na boj proti invázii patogénov. V ciroku tieto stratégie zahŕňajú aktiváciu PR proteínov [26], akumuláciu peroxidu vodíka [27] a biosyntézu flavonoidných fytoalexínov [28]. Na štúdium reakcií rezistencie ciroku, identifikáciu obranných zlúčenín a identifikáciu fyzických bariér proti antraknóze sa použili rôzne prístupy (prehľad pozri odkaz [29,30]). Štúdie génovej expresie sa široko používali na identifikáciu kandidátskych génov rezistencie v rastlinách na základe rozdielnej expresie medzi rezistentnými a citlivými kultivarmi alebo neočkovanými rastlinami a rastlinami naočkovanými patogénmi (napr. odkazy [31–37]). Wang a kol., [37] vykonali transkriptomickú analýzu na štúdium odpovede kultivaru ciroku BTx623 na C. subline-ola. Uviedli, že gény zapojené do metabolizmu fenylpropanoidov a biosyntézy sekundárnych metabolitov boli identifikované ako rozdielne exprimované v reakcii na infekciu patogénom v porovnaní s nenaočkovanými kontrolnými rastlinami.

Tieto experimenty sa však uskutočnili so sadenicami náchylného kultivaru BTx623. Ďalšie transkriptomické štúdie na porovnanie odpovede génovej expresie na patogén v citlivých a rezistentných kultivaroch ciroku by boli cenné. Preto je dôležité porozumieť genetickej architektúre, ktorá riadi odolnosť voči bazálnej chorobe ciroku, a jej spojenie s kvantitatívnou rezistenciou voči chorobám.

Ako počiatočný krok v tomto smere sme nedávno skrínovali súbor rôznych zárodočných plaziem ciroku na variácie v ich odpovedi na flg22 a elicitáciu chitínu, ako aj na rezistenciu voči hubovým chorobám [38]. V tomto prípade bol MTI kvantifikovaný meraním produkcie ROS po elicitácii MAMP. Medzi výsledky tejto skoršej štúdie bola identifikácia genotypov ciroku, ktoré vykazovali buď silnú alebo slabú odpoveď na elicitáciu MAMP.

Vysokovýkonné sekvenovanie novej generácie a štúdium transkriptómov môžu pomôcť objasniť reakcie na hubové infekcie v rastlinách a zvýšiť pochopenie reakcií hostiteľa. Analýzy transkriptómov boli široko používané na štúdium reakcií rastlín na plesňovú infekciu v mnohých rastlinných druhoch vrátane obilnín (napr. odkazy [31–37]).

Publikované údaje o porovnávacej transkriptómovej analýze obilnín sa však primárne zamerali na reakciu na rôzne patogény. V ciroku sa niekoľko publikácií zameralo na porovnanie transkriptómov rastlín ošetrených rôznymi patogénmi vrátane antraknózy [35,37]. Niektoré predchádzajúce publikácie naznačili, že neexistuje žiadna významná korelácia medzi odpoveďou na MAMP a plesňovým ochorením. Napríklad Zhang a kol. [17] uviedli silnú koreláciu medzi odpoveďou na dve MAMPs flg22 a chitín v mapovacej populácii kukurice, ale žiadnu korešpondenciu s odpoveďou na plesňové ochorenie. Kimball a kol. [38] tiež uviedli nízku koreláciu medzi skóre reakcie ROS vyvolanej flg{5}} a skóre odolnosti voči škvrnitosti cieľových listov v dvoch populáciách RIL ciroku vrátane populácie BTx623/SC155-14E. Preto sme vzhľadom na nedostatok údajov považovali za dôležité transkripčne profilovať odpoveď ciroku na liečbu MAMP.

V tejto aktuálnej správe rozširujeme našu skoršiu analýzu meraním globálnej transkripčnej odpovede na elicitáciu MAMP. Použili sme analýzu sekvenovania RNA na báze Illumina na prieskum transkripčných zmien v reakcii na liečbu flg22 alebo chitínom v genotypoch ciroku BTx623 a SC155-14E, ktoré sme predtým charakterizovali ako slabé a silné MTI respondéry. BTx623 je referenčná línia genómu Sorghum bicolor [22] a SC155-14E je línia vykazujúca zvýšenú rezistenciu voči antraknóze [39]. Patil a kol. [39] uviedli, že SC155-14E vykazoval vysokú úroveň stabilnej rezistencie (takmer bez ochorenia) voči antraknóze vo všetkých testovaných prostrediach, zatiaľ čo BTx623 je náchylný na toto plesňové ochorenie. Naša analýza RNA-seq identifikovala 5252 a 8085 diferencovane exprimovaných génov (DEG) v BTx623 liečených flg22 a chitínom, v uvedenom poradí, a 3849 a 5786 ° v SC155-14E liečených flg22 a chitínom, v tomto poradí, v porovnaní s neošetrenými falošnými kontrolami týchto dvoch genotypov.

Okrem toho porovnanie stupňov vybraných pomocou dvoch rôznych bioinformatických potrubí ukázalo veľmi podobné výsledky. Profily expresie odlišne exprimovaných génov, analýza obohatenia génovej ontológie (GO) a analýza obohatenia KEGG dráhy ukázali jasnú genotypovú variáciu v génovej expresii súvisiacej s MTI. Termín GO a výsledky obohatenia dráhy KEGG odhalili viac DEG súvisiacich s imunitou a rezistenciou voči patogénom (PR gény, génová odpoveď na chitín, génová odpoveď na kyselinu salicylovú, génová odpoveď na stres atď.) prezentovaných v SC liečených MAMP{{4} } Vzorky E v porovnaní s BTx623 ošetreným MAMP. Výsledky poskytujú základ pre identifikáciu rôznych zložiek MTI reakcie ciroku.

2. Výsledky a diskusia

2.1. Variácia oxidačného vzplanutia v rôznych listoch ciroku

Naša predchádzajúca analýza MTI odpovede rôznych genotypov ciroku odhalila významné variácie v oxidatívnom vzplanutí vyvolanom MAMP medzi genotypmi BTx623 a SC155-14E [38]. Navyše, SC155-14E je línia vykazujúca vysokú antraknózovú rezistenciu, zatiaľ čo línia BTx623 je citlivá na antraknózu [39]. Z týchto dôvodov boli tieto dva genotypy vybrané na porovnanie pomocou RNA-seq.

Pri vykonávaní predchádzajúcich meraní ROS sme našli významné odchýlky dokonca aj v rámci tej istej rastliny, čo nás viedlo k pozornejšiemu skúmaniu zdroja tejto variácie. Konkrétne sme testovali produkciu ROS s použitím troch sád listov, od spodku po vrch pätnásť dní starých rastlín BTx623 a SC155-14E. Listy boli označené ako #1, #2 a #3, zdola nahor, ako je znázornené na obrázku 1A. Výsledky testu ROS (obrázok 1B) odhalili, že: (1) úroveň produkcie ROS bola nižšia v starších listoch (list č. 1), zatiaľ čo najvyššie úrovne produkcie ROS v reakcii na flg22 alebo chitín boli z najmladších listov ( list #3). (2) MAMP-ošetrené aj neošetrené BTx623 2 a najmladšie listy (list č. 2) produkovali porovnateľne nízke úrovne produkcie ROS.

Naopak, 2. najmladšie listy SC155-14E ošetrené MAMP produkovali významne (na úrovni 0.01) vyššie úrovne produkcie ROS ako neošetrené falošné, ako aj ošetrené alebo falošné BTx{ {5}} najmladšie listy. (3) Oxidačný výbuch vyvolaný aplikáciami flg22 alebo chitínu bol zistený v listových diskoch z najmladších listov (list #3) oboch genotypov, hoci, ako už bolo pozorované, hladiny produkcie ROS boli vyššie v SC ošetrených MAMP 155-14E vzhľadom na BTx623. Časový priebeh produkcie ROS spustenej flg22-a chitínom spúšťanej v SC155-142. najmladšom liste odhalil, že produkcia ROS spustená chitínom nastala skôr ako produkcia ROS spustená flg{17}} (obrázok 1C ). Podobné výsledky uviedli Zhang a kol. [17] kde sa produkcia ROS spustená chitínom objavila skôr ako produkcia ROS spustená flg{21}} v semenákoch kukurice ošetrených flg22 a chitínom. Bolo publikované [40], že produkcia ROS v reakcii na flg22 vykazovala najvyššiu produkciu ROS okolo 12 minút a bola najnižšia po 30 minútach u Arabidopsis. Výsledky nášho testu ROS v ciroku ukázali najvyššiu produkciu ROS okolo 13 minút a najnižšiu 30 minút po ošetrení flg22, čo je veľmi podobné výsledkom v Arabidopsis. Keďže naším cieľom bolo nájsť optimálne podmienky na porovnanie MTI odpovede dvoch genotypov, vybrali sme 2. najmladšie listy 15-deň starých rastlín na extrakciu RNA a následnú transkriptomickú analýzu. Rozdiely medzi listami jednotlivých rastlín ciroku sú pripomienkou, že výsledky sa môžu medzi experimentmi líšiť v závislosti od zdroja, načasovania a iných vlastností daného experimentu, a preto je potrebné pozorne kontrolovať experimentálne parametre.

Oxidačný výbuch, rýchla, prechodná produkcia reaktívnych foriem kyslíka (ROS), je jedným z prvých pozorovateľných aspektov obrannej reakcie rastlín [41]. Vzhľadom na to, že vzplanutie ROS je okamžitá odpoveď, očakáva sa o niečo neskoršia transkripčná odpoveď génov súvisiacich s MTI. Vzorky sme odobrali 60 minút po ošetrení MAMP na analýzu RNA-Seq.

2.2. Rozdielne vyjadrené gény (DEG) BTx623 a SC155-14E v reakcii na liečbu MAMP

Na vyhodnotenie úrovne expresie anotovaných génov kódujúcich proteín Sorghum bicolor pre každú vzorku sa vypočítal počet čistých čítaní RNA-seq, ktoré sa mapovali na každý gén, a potom sa normalizoval na FPKM (fragmenty na kb model exónu na milión mapovaných fragmentov). Skúmali sa zmeny expresie každého génu v listových diskoch BTx623 a SC155-14E ošetrených MAMP v porovnaní s falošným (vodným) ošetrením. Celkové exprimované gény boli podobné pri všetkých ošetreniach oboch genotypov: 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 a 27 175 génov exprimovaných v falošne BTx623, flg22-ošetrených flg22-3, BTkx-62{2, BTchitinx62{2 {22}}E, SC22-ošetrené flg{24}}E a SC155-14E liečené chitínom. Na mapovanie čítania v oboch líniách sme použili referenčný genóm BTx623, pretože špecifická referencia pre SC155-14E nie je k dispozícii. Počty exprimovaných génov získané z BTx623 a SC{{30}}E so všetkými vyššie uvedenými podmienkami odhalili, že obe línie zdieľali podobný počet exprimovaných génov. Celková miera mapovania čítania vzoriek SC155- 14E mock (3 replikáty), SC155-14E ošetrených flg22 (3 replikáty), SC155-14E ošetrených chitínom (3 replikáty) BTx623 falošne (3 replikáty), BTx623 ošetrené flg22 (3 replikáty), BTx623 ošetrené chitínom (3 replikáty) boli: 93,6 percenta, 93,9 percenta, 93,9 percenta, 93,8 percenta, 93,9 percenta, 93,593 percenta , 93,1 percent , 96,9 percent , 97.0 percent , 97.0 percent , 97,2 percent , 96,8 percent , 97.0 percent , 96,9 percent , 97.0 percent, 97,0 percent, resp. Tieto výsledky naznačujú, že rôzne účinky liečby MAMP na transkriptómy BTx623 a SC155-14E neboli spôsobené rozdielmi v genómovej sekvencii medzi týmito dvoma genotypmi

Graf génovej expresie PCA poskytuje pohľad na asociáciu medzi vzorkami. Aby sme preskúmali podobnosť našich vzoriek, vykonali sme analýzu PCA. Vzorový graf na PC1 a PC2 (obrázok 2) ukázal, že štyri experimentálne podmienky (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_chitín a SC{ {10}}E_chitín) boli široko oddelené. Na rozdiel od toho, tri biologické replikáty každej cirokovej línie a každého ošetrenia MAMP, ako aj falošné ošetrenie, boli tesne zhlukované, čo naznačuje dobrú reprodukovateľnosť medzi biologickými replikáciami (obrázok 2).

Grafy sopiek na obrázku 3 ukazujú génovú expresiu v dvoch cirokových líniách ošetrených flg22 alebo chitínom. Sopečný graf je typ bodového grafu, ktorý ukazuje štatistickú významnosť (p-hodnota) oproti veľkosti zmeny (násobná zmena). Umožňuje rýchlu vizuálnu identifikáciu génov s rozsiahlymi zmenami, ktoré sú tiež štatisticky významné. Môžu to byť biologicky najvýznamnejšie gény. Na obrázku 3 sú gény s −log10 (p-hodnota) rovnou alebo väčšou ako 3 považované za stupne. Červené farebné bodky predstavujú stupne a čierne farebné bodky predstavujú iné ako stupne. V každom grafe sú gény s log2 (násobok{10}}zmeny) väčšou ako 0 up-regulované gény, inak down-regulované gény. Najviac up-regulované gény sú smerom doprava, najviac down-regulované gény sú smerom doľava a štatisticky najvýznamnejšie gény sú navrchu.

Rozdielne exprimované gény (DEG) boli vybrané z každého ošetrenia podľa ich významnosti expresie (p-hodnota 0.001). Treba poznamenať, že na výber stupňov v tomto prehľade sme použili p-hodnotu 0.001 ako náš prah, ale nie FDR (q-hodnoty). Na tejto úrovni boli významné aj FDR (hodnoty q) (tabuľky S2–S5). Pri hodnote p 0,001 boli FDR 0,0039, 0,0051, 0,0025 a 0,0035 pre BTx623 s liečbou flg22, SC155-14E s liečbou flg22, BTx623 s liečbou a SC{{chitinom s liečbou flg22 26}}E s liečbou chitínom, resp. Hodnoty p a q génov BTx623 a SC155-14E vo všetkých podmienkach sú uvedené v tabuľkách S2–S5. Analýzou vzorcov expresie týchto génov v listoch BTx623 a SC155-14E ošetrených MAMP sme pozorovali veľký počet génov (14–30 percent z celkového počtu exprimovaných génov), ktoré vykazovali veľké rozdiely po flg22 alebo chitíne. ošetrenie v oboch cirokových líniách. Počet celkových DEG BTx623 (8085) ošetrených chitínom bol veľmi blízky počtu uvedenému v predchádzajúcej transkriptómovej štúdii u BTx623 infikovaného antraknózovým patogénom C. subline-ola (8078) [37]. Počty DEG boli vyššie v listoch BTx623 ošetrených flg22 (19 percent) alebo chitínom (30 percent) v porovnaní s SC155-14E (14 percent, respektíve 21 percent).

Hoci vyšší počet DEG v BTx623 ošetrenom MAMP v porovnaní s SC155-14E bol opačný ako odpoveď ROS týchto dvoch genotypov, nie je to možno prekvapujúce, pretože odpoveď ROS a odpoveď génovej expresie na liečbu MAMP sa vyskytuje pri rôzne časy, sú do značnej miery nezávislé a sú sprostredkované rôznymi mechanizmami [42,43]. Termín GO a obohatenie dráhy KEGG odhalili viac DEG súvisiacich s imunitou a rezistenciou patogénov prezentovaných vo vzorkách SC155-14E ošetrených MAMP. Okrem toho skutočnosť, že počty DEG boli vyššie vo vzorkách ošetrených chitínom v porovnaní so vzorkami ošetrenými flg22, dobre zodpovedala testom odozvy ROS (obrázok 1B), kde sme videli silnejšiu reakciu ROS na ošetrenie chitínom.

Aby sme zistili, do akej miery sú gény a biologické procesy zdieľané medzi ošetrením flg22 a chitínom v BTx623 a SC155-14E, podrobnejšie sme porovnali ich stupne. Vennove diagramy na obrázku 4A znázorňujú prekrytie v stupňoch v celkovom súbore génov regulovaných smerom nahor a nadol pri hodnote p 0,001. Z celkového počtu 10 535°, základná sada 2272 génov reagovala na ošetrenie flg22 aj chitínom v oboch cirokových líniách. Podobne z celkového počtu 5 410 up-regulovaných génov bola hlavná sada 1 778 génov up-regulovaných v oboch genotypoch, zatiaľ čo z celkového počtu 5 125 down-regulovaných génov bola hlavná sada 474 down-regulovaných v oboch. genotypy.

Údaje o sekvenciách RNA, ktoré sú tu uvedené, boli analyzované pomocou bioinformatického potrubia s nástrojmi Bowtie{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 a Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) s predvolenými parametrami (potrubie č. 1). Na ďalšie potvrdenie výsledkov testu sme na vykonanie analýzy použili ďalšie potrubie (potrubie #2) s HiSat2, HTSeq a edgeR. HiSat2 je ďalším vývojom TopHat2. Porovnali sme stupne každého stavu (tj dva genotypy ošetrené flg22 alebo chitínom, všetky, hore alebo dole regulované stupne) vybrané pomocou oboch potrubí. Výsledky (obrázok 5) ukázali, že čísla DEG zvolené pomocou oboch potrubí boli veľmi blízko.

Celkové stupne zvolené s potrubím č. 1 vs. potrubím č. 2 boli BTx623_flg22: 5241 vs. 5413; SC155-14E_flg22: 3849 vs. 3476; BTx623_chitín: 8085 vs. 8320; SC155-14E_chitin: 5786 vs. 5383. Upregulované stupne vybrané s potrubím č. 1 vs. potrubím č. 2 boli BTx623_flg22: 3074 vs. 3076; SC155-14E_flg22: 2591 vs. 2483; BTx623_chitín: 4156 vs. 4583; SC155-14E_chitin: 3486 vs. 3346. Znížené stupne vybrané s potrubím #1 vs. potrubím #2 boli BTx623_flg22: 2152 vs. 2237; SC155-14E_flg22: 1257 vs. 993; BTx623_chitín: 3919 vs. 3757; SC155-14E_chitin: 2296 vs. 2037. Okrem toho výsledky na obrázku 5 tiež odhalili, že vysoké percento stupňov vybraných pomocou dvoch potrubí sa za všetkých podmienok prekrývalo. Percento prekrývajúcich sa čísel DEG/čísla DEG vybraných pomocou potrubia #1 bolo 79,6 percenta a 73,7 percenta. 80,8 percent a 74,4 percent celkových stupňov BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitín a SC155-14E{{73} }chitín; 83 percent , 80,6 percenta , 85,3 percenta a 81,1 percenta upregulovaných stupňov BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitín a SC{{ 88}}E_chitín; 75,1 percenta, 59,5 percenta, 75,8 percenta a 67,4 percenta znížených stupňov BTx623_flg22, SC{101}}E_flg22, BTx{104}chitín a SC{{{ 105}}E_chitín, resp. Tieto porovnávacie výsledky teda dokázali, že prezentované RNA seq dáta sú správne bez ohľadu na to, ktorá z týchto dvoch metód sa na analýzu použije.

Tepelná mapa zoskupených profilov expresie stupňov BTx623 a SC155-14E ošetrených flg22 alebo chitínom pre tri biologické replikáty je znázornená na obrázku 6. Hodnoty génovej expresie boli normalizované ako z-skóre. Keď sa hodnota zvýši, farba sa zmení z fialovej na červenú, čo naznačuje expresiu génu od nízkej po vysokú. Táto tepelná mapa jasne ukazuje rozdielnu reguláciu génov v BTx623 a SC155-14E v reakcii na liečbu flg22 alebo chitínom. Okrem toho výsledky tiež ukazujú, že tepelné mapy troch biologických replikátov v každom stave boli veľmi blízke, čo naznačuje dobrú reprodukovateľnosť medzi biologickými replikátmi.

Okrem toho párové porovnania (obrázok 7A) medzi up- a down-regulovanými DEG z liečby flg22 a chitínom ukázali, že medzi BTx623 a SC155-14E existuje veľké prekrývanie. Spomedzi 3074 flg22-indukovaných génov v BTx623 bolo 83,8 percent indukovaných aj v BTx623 ako odpoveď na liečbu chitínom, zatiaľ čo z 2591 flg22-indukovaných génov v SC155-14E, {{ 16}},6 percent odpovedalo aj na SC155-14E. Možno to nie je prekvapujúce, pretože predchádzajúce práce v Arabidopsis thaliana ukázali významné prekrývanie v génoch reagujúcich na rôzne odlišné MAMP, ktoré definujú všeobecné dráhy MTI [44–46].

Okrem toho Zhang a kol. [17] tiež uviedli významnú koreláciu medzi flg22 a chitínovou odpoveďou v kukurici. Menšie prekrývanie sa pozorovalo medzi listovými diskami BTx623 a SC155-14E ošetrenými rovnakým MAMP (obrázok 7A). 64,3 percent flg22-indukovaných génov v BTx623 bolo indukovaných v flg22-liečených SC155-14E a 68,3 percent chitínom indukovaných génov v BTx623 bolo indukovaných v chitínom liečených SC155-14 E. Podobne z 2152 génov down-regulovaných po ošetrení flg22 BTx623 bolo vysoké percento (75,9 percent) down-regulovaných aj chitínom v BTx623. Z 1257 génov downregulovaných flg22 v SC155-14E, 70,8 percent bolo downregulovaných aj chitínom v SC155-14E. Avšak iba 29 percent flg22 downregulovaných génov v BTx623 bolo downregulovaných aj v flg22-liečených SC155-14E a 45 percent chitínom downregulovaných génov v BTx623 bolo downregulovaných v SC155-14E ošetrenom chitínom (obrázok 7A). Preto, aj keď došlo k významnej konvergencii v dráhach MTI k flg22 a chitínu v dvoch porovnávaných genotypoch, údaje tiež naznačujú zaujímavú zložitosť toho, ako tieto dva genotypy reagujú na rôzne MAMP.

2.3. Analýza funkčného obohatenia génov porovnávajúca odozvu MTI BTx623 a SC155-14E

Na určenie funkčných kategórií génov regulovaných v reakcii buď na flg22 alebo chitín a na rozdielnu odpoveď dvoch testovaných cirokových línií sme použili platformu PlantRegMap [47,48] na vykonanie analýzy obohatenia génovej sady založenej na zistených DEG v biologickom kategórii procesu. Obrázok 8A a B ukazuje najvyššie GO termíny génov obohatených biologickými procesmi s up-regulovanými DEG a down-regulovanými DEG z BTx623 aj SC155-14E. Úplný zoznam stupňov je uvedený v tabuľkách S6–S13. Mnohé z týchto génov sú spojené s procesmi vrátane stresovej reakcie, obranných reakcií rastlín, reakcie na stimul, reakcie na biotický stimul, reakcie na baktériu, reakcie na iný organizmus, bunkovej komunikácie, metabolického procesu fosforu a fosforylácie proteínov.

Výsledky na obrázku 8A a B ukazujú jasné rozdiely v expresii génov normálne spojených s vrodenou imunitou medzi dvoma genotypmi ciroku. V týchto obohatených podmienkach GO sa v každej podmienke našli jedinečné stupne s prekrývaním. Napríklad obranná odpoveď GO termínu (GO 0006952): 91 a 84 up-regulovaných DEG boli obohatené o BTx623 alebo SC155-14E ošetrené flg22, v danom poradí. V rámci týchto stupňov bolo 24 stupňov jedinečných v BTx623 a 15 stupňov bolo nájdených iba v SC155-14}E a ostatné boli prítomné v oboch genotypoch ciroku. Podobne 102 a 93 upregulovaných DEG bolo obohatených o BTx623 alebo SC155-14E ošetrené chitínom, v danom poradí. V rámci týchto stupňov bolo 20 stupňov jedinečných v BTx623 a 14 stupňov bolo jedinečných v SC155-14}E a ostatné boli prezentované v oboch genotypoch ciroku.

V termíne GO „reakcia na chitín (GO: 0010200)“ sme pozorovali 18 upregulovaných DEG z celkového počtu 779 génov v tejto kategórii obohatených o vzorky SC155-14E ošetrené chitínom (obrázok 8 ), zatiaľ čo vo vzorkách BTx623 ošetrených chitínom nebol obohatený žiadny gén. Okrem toho 16 upregulovaných stupňov bolo obohatených vo vzorkách SC155-14E ošetrených flg22-a 12 upregulovaných stupňov bolo obohatených vo vzorkách BTx623 ošetrených flg{15}}(obrázok 8). Porovnanie zoznamov DEG výrazu GO „reakcia na chitín“ v flg22 a chitínom ošetrených BTX623 a SC155-14E (tabuľka S9) odhalilo, že DEGs obohatené o flg22 alebo chitínom ošetrené SC155- 14 E boli rovnaké okrem toho, že chitín indukoval o dva stupne viac ako flg22. Naproti tomu všetkých 12 stupňov obohatených o BTX623 ošetrené flg{28}} sa líšilo od stupňov indukovaných MAMP v SC155-14E. Tieto DEGs indukované MAMP môžu prispievať k rezistencii antraknózy v SC155-14E, pretože chitín je typická molekula MAMP z bunkových stien húb, ktorá vyvoláva imunitné reakcie rastlín. Stringlis a kol. [49] tiež uviedli, že súbor up-regulovaných DEG bol obohatený o termín GO o "reakciu na chitín" z chitínu, flg22 a rastlín Arabidopsis ošetrených rhizobaktériou Pseudomonas simiae WCS417. Matic a spol. [33] uviedli, že 21° bolo obohatených v GO termíne „reakcia na chitín“ z analýzy RNA-seq listov ryže rezistentného kultivaru, ale nie z citlivého kultivaru po infekcii hubovým patogénom Fusarium fujikuroi.

Gény PR (Pathogenesis-related) sa podieľajú na imunitnej odpovedi rastlín [50] a majú antifungálnu aktivitu proti mnohým fytopatogénnym hubám [51]. PR-10 proteíny sú malé, primárne kyslé, intracelulárne proteíny s antifungálnymi vlastnosťami, ktoré sú spojené s obrannými odpoveďami u rastlinných druhov vrátane ciroku [52]. Členovia génovej rodiny PR-10 boli indukovaní útokmi patogénov v širokej škále rastlinných druhov [53]. V ciroku Lo a kol. [26] uviedli, že expresia PR-10 bola indukovaná ako súčasť aktívnej obrany hostiteľa ciroku proti listovým hubovým patogénom C. heterostrophus a C. sublineolum. Katie a spol. [54] uviedli, že niekoľko kultivarov ciroku preukázalo významnú indukciu normalizovaných relatívnych množstiev PR-10 po inokulácii spórami húb C. lunata a F. capsicum v terénnych testoch. V skleníkových podmienkach pluchy naočkovaných rastlín vykazovali indukciu PR-10 mRNA a odpoveď bola väčšia u dvoch testovaných rezistentných kultivarov v porovnaní s dvoma citlivými kultivarmi.

Naše výsledky ukázali, že medzi identifikovanými DEG sa našli štyri PR-10 gény (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). V SC155-14E boli všetky štyri PR-10 stupne upregulované pôsobením flg22 alebo chitínom, naproti tomu v BTx623 sa SORBI{13}}G401000 nenašiel v DEGs a SORBI{{15} } G401300 (up-regulovaný) bol prezentovaný iba v BTx623 s liečbou chitínom, ale nie s liečbou flg22. To naznačuje, že expresia PR génov by sa mohla použiť v reakcii na vyššie hladiny produktu ROS po liečbe MAMPs a rezistenciu proti antraknóze u SC155-14E.

Kyselina salicylová (SA) je rastlinný imunitný signál nevyhnutný pre lokálnu obrannú reakciu a systémovú získanú rezistenciu. Hrá dôležitú úlohu v odolnosti a obrane rastlín proti útokom patogénov [55]. V ciroku Tugizimana et al. [56] uviedli kvantitatívne zmeny v hladinách kyseliny jazmónovej, konjugátov kyseliny salicylovej a kyseliny abscisovej v ciroku infikovanom C. subline-ola. C. subline-ola je pôvodcom antraknózy. Genotypy ciroku so zvýšenými hladinami aminokyselín (tryptofán a tyrozín), kyseliny jazmónovej a salicylových konjugátov a zeatínu boli odolnejšie voči antraknóze. V tejto štúdii bol GO termín „reakcia na kyselinu salicylovú“ (GO:0009751) vrátane 19 up-regulovaných DEG špecificky obohatený iba o SC155-14}E ošetrené chitínom (tabuľka S9). Preto by salicylová signálna dráha mohla hrať dôležitú úlohu v reakcii na vyššie hladiny produkcie ROS po liečbe MAMP a rezistenciu voči antraknóze u SC155-14E.

Okrem toho 169 up-regulovaných DEG bolo obohatených v GO termínovej reakcii na stres výlučne v SC155-14}E liečených chitínom (tabuľka S9). Ďalšie výrazy GO nachádzajúce sa výlučne v SC155-14E liečenom MAMP, ale nie v BTx623 s rovnakou liečbou, sú sekundárne metabolické procesy (GO:0019748), proces biosyntézy fosfatidylcholínu (GO:0006656) a proces biosyntézy lipidov ( GO:0008610).

Okrem toho 169 up-regulovaných DEG bolo obohatených v GO termínovej reakcii na stres výlučne v SC155-14}E liečených chitínom (tabuľka S9). Ďalšie výrazy GO nachádzajúce sa výlučne v SC155-14E liečenom MAMP, ale nie v BTx623 s rovnakou liečbou, sú sekundárne metabolické procesy (GO:0019748), proces biosyntézy fosfatidylcholínu (GO:0006656) a proces biosyntézy lipidov ( GO:0008610).

Preskúmali sme tiež zloženie génov, ktoré sú koregulované medzi dvoma genotypmi po ošetrení flg22 alebo chitínom, ako aj základné súbory DEG vo všetkých ošetreniach a dva genotypy analýzou obohatenia GO (obrázky 4B a 7B). Úplný zoznam stupňov je uvedený v tabuľkách S14 a S15. Obrázok 4B ukazuje obohatené podmienky GO základných súborov celkových, up- a down-regulovaných DEG v BTx623 a SC{10}}E so všetkými liečbami. Termíny GO súvisiace s odpoveďou MAMP a obranou rastlín (napr. väzba chitínu, obranná odpoveď, aktivita proteínkinázy, fosforylácia proteínov, aktivita proteín serín/treonínkinázy) boli významne obohatené o up-regulované DEG, zatiaľ čo termíny GO biosyntetického procesu sekundárneho metabolitu, viazanie iónov železa, aktivita oxidoreduktázy bola obohatená iba o down-regulované stupne. Tento výsledok bol podobný výsledkom v Arabidopsis, kde GO termíny súvisiace s odpoveďou na elicitory (flg22 peptidy z P. simile WCS417 a P. aeruginosa PAO1, chitín a bakteriálne bunky P. simile WCS417) boli najvýznamnejšie obohatené o up-regulované základná sada stupňov [49].

Obrázok 7B ukazuje významne obohatené GO termíny koregulovaných (tj up- alebo down-regulovaných v oboch genotypoch) súborov DEG medzi BTx623 a SC155-14}E po liečbe flg22 alebo chitínom. Výsledky odhalili, že termíny GO súvisiace s odpoveďou MAMP a obranou rastlín (napr. obranná odpoveď, aktivita proteínkinázy, fosforylácia proteínov, aktivita proteín serín/treonínkinázy) boli obohatené iba o flg22 alebo chitín upregulované DEG v oboch genotypoch, zatiaľ čo termíny GO proces biosyntézy sekundárneho metabolitu, väzba hemu, väzba iónov železa, oxidoreduktázová aktivita jedného atómu kyslíka a proces biosyntézy fosfatidylcholínu boli obohatené výlučne o down-regulované sady stupňov.

2.4. Analýza obohatenia dráhy KEGG MTI odozvy BTx623 a SC155-14E

Obrázok 9 ukazuje analýzu obohatenia KEGG dráhy upregulovaných DEG nájdených vo vzorkách BTx623 a SC155-14E ošetrených MAMP pomocou online nástroja DAVID [57]. Úplný zoznam stupňov je uvedený v tabuľkách S16–S20. Výsledky identifikujú tie špecifické top KEGG dráhy obohatené v dôsledku aktivácie MTI v dvoch genotypoch ciroku. V KEGG dráhe "interakcia rastlina-patogén" sme pozorovali, že 24 upregulovaných DEG bolo obohatených vo vzorkách SC155-14E ošetrených chitínom, zatiaľ čo žiadny z DEG nebol obohatený vo vzorkách BTx623 ošetrených chitínom. Silnejšia chitínová odpoveď genotypu SC155-14E koreluje s väčšou rezistenciou tohto genotypu voči antraknóze hubového ochorenia [39]. Okrem toho obohatenie KEGG dráhy odhalilo 28 génov zapojených do biosyntézy fenylpropanoidov v SC155-14}E ošetrených flg22. Cesta biosyntézy fenylpropanoidov začína fenylalanínom, ktorý sa môže premeniť na aromatické zlúčeniny, ako sú flavonoidy, benzenoidy, kumarín, hydroxycinnamáty a lignín [58,59]. Mnohé fenylpropanoidy a flavonoidy sa podieľali na reakcii rezistencie na ochorenie [28,60]. Produkcia fytoalexínov je hlavnou obrannou odpoveďou proti antraknózovému patogénu C. subline-ola [28] v ciroku. 3- deoxyantokyanidíny sú nezvyčajnou skupinou flavonoidov, ktoré sú v ciroku známe ako fytoalexíny. Fytoalexíny sú malé molekuly s antimikrobiálnou aktivitou produkované po infekcii patogénom [61]. Wang a kol. [37] tiež zistili, že biosyntéza fenylpropanoidov s termínom KEGG bola významne obohatená o stupne stupňov rastlín infikovaných C. subline-ola v ich transkriptomickej štúdii ciroku. Mali by sme poznamenať, že výsledky obohatenia dráhy KEGG (obrázok 9) tiež ukázali vyššiu odozvu BTx623 po liečbe MAMP v niektorých dráhach, ktoré môžu hrať úlohu v interakciách rastlina-patogén (napr. v dráhach biosyntézy fenylalanínu a tryptofánu, biosyntézy antibiotík).

Okrem toho výsledky analýzy obohatenia dráhy KEGG down-regulovaných stupňov odhalili, že desať down-regulovaných stupňov bolo označených ako „proteíny fotosyntézy-antény“ a 84 stupňov bolo označených ako participujúce na „biosyntéze sekundárnych metabolitov“, ktoré boli obohatené o flg22. BTx623. Takéto štúdie génovej expresie však môžu identifikovať gény odlišne exprimované v reakcii na liečbu MAMP alebo infekciu patogénom, ale nemusí to nevyhnutne preukázať, že tieto gény sú kritické pre rezistenciu voči špecifickému patogénu. Na pochopenie príčinných vzťahov medzi rezistenciou voči hubám a aktiváciou týchto KEGG dráh v oboch genotypoch by teda bol potrebný ďalší výskum, ako sa ukázalo analýzou RNA-Seq.

Vykonali sme tiež analýzu obohatenia KEGG dráhy pre základné súbory DEG za všetkých podmienok (obrázok 4C), ako aj koregulované DEG medzi dvoma genotypmi po ošetrení flg22 alebo chitínom (obrázok 7C). Výsledky odhalili, že šesť významných dráh, vrátane dráhy interakcie rastlina-patogén, bolo obohatených iba o up-regulované základné sady DEG, ale nie o down-regulované základné sady DEG. Podobne, sedem a tri dráhy, vrátane dráhy interakcie rastlina-patogén, boli významne obohatené o chitínom upregulované DEG a flg22 upregulované DEG v BTx623 a SC{12}}E, v danom poradí. Naopak, iba biogenéza ribozómov v eukaryotickej dráhe bola obohatená o DEG regulované chitínom v oboch genotypoch.

2.5. Validácia údajov RNA-Seq pomocou kvantitatívnej RT-PCR vybraných génov

Na potvrdenie údajov o profilovaní génovej expresie získaných pomocou RNA-seq sme vykonali analýzu qRT-PCR na vyhodnotenie expresie deviatich vybraných kandidátskych génov. Týchto deväť génov bolo vybraných na základe expresie pozorovanej pomocou RNA-seq v troch kategóriách: (a) exprimované podobne v BTx623 a SC{4}}E s flg22 alebo chitínom; (b) exprimovaný len v SC155-14E liečených MAMPs, ale s extrémne nízkou expresiou v liečených BTx623 a (c) exprimovaný 2–21-krát vyššie v SC155-14E liečených MAMPs v porovnaní s BTx623 . Výsledky analýzy qRT-PCR (tabuľka 1) odhalili úplnú zhodu s hladinami expresie stanovenými analýzou RNA-seq pre každý z deviatich hodnotených génov. Tieto výsledky nám dávajú istotu, že merania vykonané pomocou RNA-seq odrážajú transkripčnú odpoveď cirokových línií na liečbu MAMP

2.6. Závery

V tejto štúdii sme najskôr našli optimálne podmienky na porovnanie MTI odpovede dvoch genotypov testovaním produkcie ROS pomocou troch sád listov a vybrali sme druhé najmladšie listy pätnásťdňových rastlín na extrakciu RNA a následnú transkriptomickú analýzu. Časový priebeh produkcie ROS spustenej flg22-a chitínom spustenej v cirokovej línii SC155-14E (obrázok 1C) odhalil, že produkcia ROS spustená chitínom nastala skôr ako produkcia vyvolaná liečbou flg22. Získali sme profily expresie plesňového ochorenia antraknózou rezistentného Sorghum bicolor genotypu SC155-14E s vysokou odpoveďou na liečbu MAMPs na produkciu ROS a citlivým genotypom BTx623 s nízkou odpoveďou na produkt ROS na liečbu MAMP počas skorých štádií odpoveďou vrodenej imunity.

Výsledky demonštrujú jasnú variáciu génovej expresie v cirokových genotypoch BTx623 a SC155-14E v reakcii na liečbu MAMP. Zatiaľ čo odpovede na dva MAMP vykazovali značné prekrytie v rámci každého riadku (86.6–70,8 percenta ), boli odlišné. Určité, aj keď nižšie prekrytie (68,3–29 percent) bolo tiež pozorované medzi odpoveďami dvoch línií na rovnaký MAMP. Značný počet stupňov, 2272 z 10 535 stupňov, bol identifikovaný vo všetkých štyroch podmienkach a predbežne definujú jadro MAMP odozvy. Tento zoznam génov by mal byť užitočný pre tie laboratóriá, ktoré chcú profilovať odpoveď génovej expresie na liečbu MAMP. Analýza RNA-seq identifikovala veľké súbory rozdielne exprimovaných génov v BTx623 a SC{14}}E ošetrených flg22 alebo chitínom v porovnaní s neošetrenými falošnými kontrolami týchto dvoch línií. Okrem toho porovnanie stupňov vybraných pomocou dvoch rôznych bioinformatických potrubí ukázalo veľmi podobné výsledky. Podrobná analýza profilu expresie týchto DEG, analýza obohatenia GO a analýza KEGG dráhy odhalili jasnú variáciu v odpovedi génovej expresie týchto dvoch genotypov. Termín GO a obohatenie dráhy KEGG objavili viac DEG súvisiacich s imunitou a rezistenciou patogénov (PR gény, génová odpoveď na chitín, génová odpoveď na kyselinu salicylovú, odpoveď na stres, biosyntéza fenylpropanoidu atď.) v SC liečených MAMP{{18} }E vzorky v porovnaní s BTx623 s rovnakým ošetrením. Tieto informácie poskytujú dôležité základné informácie o tom, ako vrodený imunitný systém tejto kľúčovej plodiny reaguje na elicitáciu MAMP. Vzhľadom na všeobecný nedostatok informácií o vrodenej imunitnej odpovedi plodín v porovnaní s modelom Arabidopsis, zoznamy génov a opísané metódy poskytujú zdroj na ďalšie skúmanie reakcie ciroku na patogény a mali by uľahčiť úsilie o konečné zlepšenie odolnosti voči chorobám v túto dôležitú plodinu na výrobu potravín a biomasy.

3. Materiály a metódy

3.1. Rastlinné materiály

V tejto štúdii boli použité dve línie ciroku poskytnuté Dr. Williamom Rooneym (Texas A&M University, College Station, USA) a Dr. Stephenom Kresovichom (Clemson University, Clemson, USA). BTx623 je štandardná ciroková línia s dostupnou sekvenciou celého genómu [22] a SC155-14E je línia vyvinutá pre rezistenciu na antraknózu [39].

3.2. ROS testy

Semená ciroku BTx623 a SC155-14E boli povrchovo sterilizované (70 percent etanolu počas 1 minúty a potom 10 percent bielidla počas 10 minút, opláchnuté autoklávovanou ddH2O) a zasadené do autoklávovanej kvetináčovej zmesi Sunshine a vyklíčené v rastových komorách ( 16 h/8 h svetlo/tma, 28/26 ◦C, vlhkosť 60–70 percent). Na pokusy boli použité pätnásťdňové rastliny.

V tejto štúdii sa použili dva MAMP, flg22 (Genscript katalóg č. RP19986) a chitín z krabieho panciera (Sigma-Aldrich, katalógové č. C3641). Flg22 je peptid odvodený od bičíkového N-konca rastlinných patogénnych baktérií a je dobre známe, že vyvoláva špecifickú vrodenú imunitnú odpoveď v rastlinách [62]. Chitín je typická molekula MAMP odvodená z bunkových stien húb, ktorá vyvoláva imunitné reakcie rastlín [3]. ROS testy boli uskutočnené podľa Kimball et al. [38]. Na posúdenie variácie v odozve MAMP v rámci jednotlivých genotypov, ako aj polohy listov, boli všetky tri úplne expandované listy rastlín každého genotypu hodnotené individuálne. Listy od spodu po vrch pätnásťdňových rastlín ciroku každého genotypu boli označené ako list #1, #2 a #3. Na odber vzoriek na meranie produkcie ROS sme použili iba strednú časť listu. Ihneď po ošetrení sa chemiluminiscenčný signál každej vzorky zaznamenával počas 30 minút pomocou Photek CCD kamery (Photek Ltd., East Sussex UK). Osem jamiek pozostávalo z falošného ošetrenia (bez MAMP) a osem jamiek pozostávalo z ošetrenia (s MAMP). V každom prípade sa pre každé ošetrenie porovnávali tri biologické replikáty s celkovo 8 vzorkami.

3.3. Vzorová liečba pomocou MAMP

Na pokusy boli použité pätnásťdňové rastliny. Ošetrenie MAMP sa uskutočnilo tak, ako je opísané vo Valdes-Lopez et al. [12] s malými úpravami. V stručnosti, druhý list (z vrchu, tj druhý najmladší list) z piatich rastlín pre každú cirokovú líniu sa oddelil a potom sa vákuovo infiltroval autoklávovanou ddH20 počas 2 minút. Z vodou infiltrovaných listov každého genotypu sa odrezalo asi päťdesiat listových kotúčikov s priemerom 1 cm a spojili sa. Štyridsaťpäť listových diskov z každého genotypu sa prenieslo do troch rôznych Petriho misiek (15 listových diskov v každej Petriho miske) a potom plávali cez noc pri teplote miestnosti na autoklávovanej ddH20 s platňami pokrytými hliníkovou fóliou. Nasledujúci deň bola voda odstránená zo všetkých Petriho misiek a nahradená 10 ml ddH20 (napodobenina), 10 ml 1 uM flg22 alebo 10 ml 20 mg/ml roztoku chitínu. Po 60-minútovom ošetrení boli falošne a MAMP ošetrené plátky listov zozbierané do rôznych skúmaviek a okamžite zmrazené v tekutom dusíku. Vzorky plátkov listov (pre 101 quencované "ies ied-11272) imunita BTx623 a SC155-14E s falošným, flg22 alebo chitínovým ošetrením, tri biologické replikáty) boli uskladnené pri -80 ◦C na extrakciu RNA. Všetky postupy opísané vyššie sa uskutočňovali v tmavých podmienkach, aby sa eliminoval akýkoľvek možný efekt fotosyntézy.

3.4. Extrakcia RNA, sekvenovanie a konštrukcia knižnice

Extrakcia RNA sa uskutočnila pomocou súpravy Direct-zol RNA Miniprep Plus od spoločnosti Zymoresearch (katalógové číslo R2071) podľa pokynov výrobcu

Vysokovýkonné sekvenovanie sa uskutočnilo na University of Missouri DNA Core Facility. Osemnásť knižníc sa vytvorilo podľa protokolu výrobcu s činidlami dodanými v súprave na prípravu vzorky mRNA TruSeq od Illumina. Koncentrácia vzorky bola stanovená fluorometrom Qubit (Invitrogen) s použitím testovacej súpravy Qubit HS RNA a integrita RNA bola skontrolovaná pomocou automatizovaného systému elektroforézy Fragment Analyzer. V stručnosti, mRNA obsahujúca poly-A sa purifikovala z celkovej RNA (1 ug), RNA sa fragmentovala, z fragmentovanej RNA sa vytvorila dvojvláknová cDNA a adaptéry obsahujúce index sa ligovali na konce. Amplifikované cDNA konštrukty sa purifikovali pridaním guľôčok Axyprep Mag PCR Clean-up. Finálny konštrukt každej purifikovanej knižnice sa vyhodnotil pomocou systému automatizovanej elektroforézy Fragment Analyzer, kvantifikoval sa pomocou fluorometra Qubit pomocou testovacej súpravy Qubit HS dsDNA a zriedil sa podľa štandardného sekvenčného protokolu Illumina pre sekvenovanie na NextSeq 500. Dĺžka sekvenovania bola jednoduchá čítať na 75 bázach.

3.5. Mapovanie a spracovanie čítaní RNA-Seq

Sekvenčné údaje predstavovali šesť rôznych stavov: BTx623 s falošnou, flg22 alebo chitínovou liečbou a SC155-14E s falošnou, flg22 alebo chitínovou liečbou. Každý stav bol reprezentovaný tromi biologickými replikátmi, výsledkom čoho bolo celkovo 18 vzoriek. Najprv boli 30 konce čítania „orezané“ pre adaptéry Illumina, pre nejednoznačné nukleotidy (N) a (kvôli technológii NextSeq) pre umelé poly-G (reprezentované ako G{100}) pomocou cutadapt verzia 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, prístupná 21. augusta 2019) pre čítania, ktorých 30 koncov sa prekrýva s adaptérom minimálne na 3 bázach s 90-percentnou identitou. Ak po tomto orezaní čítanie obsahovalo menej ako desať báz, bolo vyradené (spolu s jeho spárovaným čítaním, ak je to vhodné). Skóre kvality pre RNA seq dáta po orezaní sa skúmalo pomocou FASTQC (verzia 0.11.9) [63]. Pre všetky pozície v čítaní je stredné skóre kvality okolo 34, čo naznačuje, že základná presnosť volania je vyššia ako 99,9 percenta. Hodnoty pre každú vzorku boli zarovnané s referenčným genómom (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) s Tophat 2.1.1. Výsledné porovnávacie súbory boli poskytnuté spoločnosti Cufflinks 2.2.1 na zostavenie prepisov pre každú vzorku. Verzia anotácie použitá v tomto výskume bola Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Vzorky z rovnakého stavu boli zlúčené pomocou Cuffmerge. Účelom bolo poskytnúť jednotný základ na výpočet expresie génu a transkriptu v každom stave.

3.6. Bioinformatická analýza údajov RNA-Seq

Údaje RNA seq boli analyzované pomocou bioinformatických nástrojov Bowtie{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 a Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) s predvolenými parametrami. S týmito nástrojmi sme použili rovnaké potrubie, ako je opísané v Trapnell et al. [64]. Na ďalšie potvrdenie výsledkov testu sme na vykonanie analýzy použili ďalší kanál s HiSat2 (verzia 2.1.{15}}), HTSeq (verzia 0.12.4) a edgeR (verzia 3.26.8). HiSat2 je ďalším vývojom TopHat2. Najprv sme použili HiSat2 na zarovnanie pomocou referenčného genómu Sorghum. Potom sme použili HTSeq, aby sme spočítali, koľko čítaní bolo mapovaných na každý gén. Na to sme potrebovali súbory bam vygenerované z predchádzajúceho kroku a anotáciu genómu (súbor gif). Všimnite si, že referenčný genóm a anotačné súbory sú rovnaké, ako sme použili v pôvodnom potrubí. Nakoniec sme použili balík R edgeR na určenie rozdielne exprimovaných génov v každom stave

3.7. Identifikácia rozdielne vyjadrených génov
Zlúčená zostava sa podávala do Cuffdiffa, ktorý vypočítava hladiny expresie a testuje štatistickú významnosť pozorovaných zmien medzi dvoma stavmi. Porovnali sme podmienky medzi falošným verzus flg22 a simulovaným verzus chitínom pre BTx623, respektíve SC155-14E. Rozdielne exprimované gény boli extrahované pomocou 0.001 prahových hodnôt p-hodnoty. Grafy sopky boli vytvorené pomocou balíka R (ggplot2 V3.3.0), aby sa ukázal význam zmeny génovej expresie v podmienkach BTx623 liečených flg22 alebo chitínom a SC155- 14}E liečených flg22 alebo chitínom, v danom poradí. Génové bodky s -log10 (p-hodnota) rovnou alebo väčšou ako tri boli považované za DEG. V každom grafe boli génové bodky s log2 (násobok_zmeny) väčšou ako nula gény s reguláciou smerom nahor, v opačnom prípade gény s reguláciou nadol.

3.8. PCA pozemok

Na preskúmanie vzťahu medzi hodnotami génovej expresie troch biologických replikátov každej línie ciroku a každého ošetrenia MAMP sa pomocou balíkov R (ggfortify V{{0}}}.4.10, ggplot2 V3) vytvorili grafy analýzy hlavných komponentov (PCA). .3.0). Každá bodka predstavuje stav po mapovaní z pôvodného priestoru znakov (génová expresia) do prvých dvoch hlavných komponentov. Bodky patriace do rovnakého stavu majú tendenciu sa zhlukovať

3.9. Tepelná mapa stupňov

1 Division of Plant Science and Technology and Biochemistry, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Katedra elektrotechniky a informatiky, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Plant Science Research Unit, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu