Aký je rozdiel medzi divoko pestovanou cistanche a umelo pestovanou cistanche pri aktivite na posilnenie imunity

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Abstrakt:

Cieľ:Porovnať účinky na posilnenie imunity divo rastúcich cistanche a umelo pestovaných polysacharidov cistanche z cistanche (ďalej len WCDPS a CCDPS).

Metódy:Rôzne dávky (nízke, stredné a vysoké) WCDPS a CCDPS a ovalbumínu (OVA) boli subkutánne imunizované pomocou ICR myší, OVA-špecifická protilátka IgG a podtypy protilátok IgGl a IgG2a boli detegované pomocou ELISA a metódou MTT. Aktivita proliferácie lymfocytov špecifická pre OVA, prietoková cytometria na detekciu úrovne expresie CD4 plus T buniek a CD8 plus T buniek.

Výsledky:WCDPS aj CCDPS môžu významne zvýšiť hladiny expresie OVA-špecifickej protilátky IgG a protilátkovej typizácie IgG1 a IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS a CCDPS môžu tiež významne zvýšiť percento podobsahu CD4 plus T a CD8 plus T buniek (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS a CCDPS nemali žiadny vplyv na hmotnosť imunizovaných myší.

Záver:WCDSP aj CCDPS môžu významne zvýšiť humorálne a bunkové imunitné reakcie špecifické pre OVA a medzi nimi nie je žiadny štatisticky významný rozdiel a majú dobrú bezpečnosť.

Kľúčové slová: cistanche; polysacharidy z cistanche; ovalbumín; adjuvans

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),tiež známy ako Cunyun a Dayun, je už mnoho rokov parazitická bylina z čeľade Lydanaceae. Ide o vzácny a vzácny čínsky liečivý materiál. Medzi jeho hlavné zložky patria polysacharidy z cistanche, zlúčeniny fenyletanoidových glykozidov z cistanche, organické kyseliny, alkaloidy atď.⑷, majú viacero funkcií, ako je výživná esencia a krv, podpora jangu a tonizácia obličiek a zmiernenie starnutia⑸. Pre mimoriadne vysokú liečivú hodnotu cistanca je nadmerné vykorisťovanie voľne žijúcich druhov na pokraji vyhynutia a úspešne sa darilo umelo pestovaným cistancom. Vedci doma aj v zahraničí vykonali veľa výskumov o chemických zložkách a aktívnych zložkách divo rastúcich a umelo pestovaných cistanch, ale existuje len málo správ o porovnaní divokých a kultivovaných polysacharidov cistanche z adjuvantnej aktivity cistanche (WCDPS/CCDPS). . Veľké množstvo štúdií ukázalo, že rastlinné polysacharidy z cistanche ako adjuvans môžu regulovať imunitnú odpoveď organizmu. Mnohí výskumníci použili čínsku bylinnú medicínu ako adjuvans vakcíny a dosiahli značný pokrok.

Táto štúdia je založená na predchádzajúcom výskume (6) na porovnaniena posilnenie imunityčinnosti Xinjiang WCDPS a CCDPS. Najmä prostredníctvom imunizačných experimentov u myší boli rôzne dávky WCDPS a CCDPS subkutánne imunizované OVA u ICR myší a ich účinky na hladinu humorálnejimunitaa bunková imunita indukovaná OVA po imunizácii. Porovnajdivo rastú cistancheaumelo pestované cistanchepolysacharidy Imunitná aktivita polysacharidov v citrusoch môže poskytnúť referenciu pre lepší vývoj a využitie umelo pestovaných cistanche v Xinjiang.

Materiály a metóda

Experimentálne materiály:

Voľne rastúce cistanche a kultivované cistanche (komerčne dostupné). Kultivačné médium RPMI 1640 bolo zakúpené od GIBCO; Fetálne hovädzie sérum bolo zakúpené od Israel Bioind; Protilátky prietokovej cytometrie: PE potkaní-anti myšací CD3, APC potkaní-anti myšací CD4, FITC potkaní-anti myšací CD8a boli zakúpené od American BD company, vaječný bielok Proteín (ovalbumín, OVA) produkt Sigma, kozia anti-myšia látka značená peroxidom chrenu IgG, IgGl a IgG2a boli zakúpené od Southbiotech, USA. Ostatné experimentálne chemické činidlá sú všetky domáce analytické činidlá.

Pokusné zvieratá:

Samice myší ICR čistého stupňa (6-8 týždňov, 18-22 g) boli zakúpené od Experimental Animal Center of Xinjiang Medical University. Zvieratá boli držané vo zvieracej miestnosti nášho laboratória a experiment sa začal 7 dní po aklimatizácii zvierat.

Príprava WCDPS a CCDPS:

Odkaz [17] používa metódu extrakcie vody a zrážania alkoholom. Krátke kroky sú nasledovné: Vezmite suchý Xinjiang kultivovaný a divoký cistanche prášok, pridajte 10-násobok objemu vazelíny a absolútneho etanolu do ultrazvuku na 1 hodinu; po sacej filtrácii ponechajte zvyšok lieku a vysušte, pridajte 10-násobok objemu destilovanej vody 37T Ultrasound dvakrát, centrifugujte pri 4 000 ot./min počas 10 minút, spojte supernatanty, rotačne odparte a zakoncentrujte a zrážajte cez noc s alkohol; po vákuovej filtrácii a sušení sa získa surový extraktový prášok; Savage metóda ⑻ odstraňuje proteín z WCDPS a CCDPS. Obsah polysacharidov z cistanche vo WCDPS a CCDPS stanovený metódou cibuľovej kyseliny sírovej bol 76,82 percent a 59,58 percent.

Imunizácia myší a odber séra:

Samice myší ICR vo veku {{0}}} týždňov sa použili ako experimentálne zvieracie modely. Experiment bol rozdelený do 9 skupín, 5 v každej skupine: 0,9 percent NaCl, OVA 10 prípravok, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Pred imunizáciou sa rozpustí v 0,9 percentách NaCl a myši sa imunizujú subkutánne dvakrát v intervale 2 týždňov. Krv sa odoberie pred imunizáciou a sérum-80Y sa pripraví a uloží na neskoršie použitie.

Účinky WCDPS a CCDPS na rast myší:

Na pozorovanie účinkov WCDPS a CCDPS na rast myší boli hmotnosti myší v každej skupine odvážené v 0 d pred počiatočnou imunizáciou, 14 d a 21 d po imunizácii.

Detekcia IgG a typizácia myších sérových protilátok po imunizácii WCDPS a CCDPS:

Na stanovenie sérových protilátok bola použitá nepriama metóda ELISA. Platňa ELISA bola potiahnutá 2,5 jig/ml OVA, 4Y cez noc; 3-krát premyté PBST a potom pridané 5 percent sušeného odtučneného mlieka 37 1 na blokovanie počas 1 hodiny; 3-krát premyté PBST a pridaná primárna protilátka k myšiam po imunizácii v každej skupine Sérum, pomer riedenia primárnej protilátky je 1:100, 100 piluliek na jamku, 37 Tl h; po 3-krát premytí PBST pridajte sekundárne protilátky: kozie anti-myšie IgG, IgGl, IgG2a (1: 5 000) označené HRP 37 Inkubujte draka 1 h; po 4-násobnom premytí PBST pridajte roztok substrátu tetrametylbenzidínu (TMB), aby ste zabránili svetlu počas 15 minút. Pridajte 50 do každej jamky na zastavenie reakcie s 2 mol/l H2SO4 a zmerajte hodnotu A45O/655. Porovnajte hladiny protilátok v každej skupine.

Detekcia proliferácie lymfocytov v slezine myší po imunizácii WCDPS a CCDPS:

Metóda MTT bola použitá na detekciu proliferácie lymfocytov v slezine myší imunizovaných CCDPS a WCDPS. Slezina myší bola izolovaná za aseptických podmienok 21 dní po počiatočnej imunizácii a bunky sleziny boli nariedené 10 percentným médiom RPMI 1640 obsahujúcim FBS, aby sa jednotlivé bunky suspendovali, spočítali a upravili sa bunky(r buniek/ml rozložte do 96-jamkovej doštičky na kultiváciu buniek, pridajte 20 OVA (konečná koncentrácia 10 |xg/ml) a ConA (konečná koncentrácia 5 ošípaných/ml) Stimulujte, nastavte prázdnu bunkovú kontrolu a prázdne sérum kontrola súčasne, vložte ju do 37Y bunkového inkubátora na 48 hodín, pridajte 20 MTT do každej jamky, 37^ a pokračujte v inkubácii počas 4 hodín, pridajte 100|±1 DMSO do každej jamky, aby sa rozpustilo a otestovalo srdce 0 /63. Vyhodnoťte, vypočítajte stimulačný index (SI) každej skupiny myší.

Expresia CD4 a CD8 na CD3 plus T bunkách po imunizácii WCDPS a CCDPS:

Na detekciu expresie CD4 plus T a CD8*T buniek na povrchu CD3 plus T buniek sa použila prietoková cytometria. Myšia slezina bola izolovaná za aseptických podmienok 21 dní po primárnej imunizácii a slezina bola ošetrená médiom RPMI 1640 obsahujúcim 10 percent FBS. Pripravte jednobunkovú suspenziu, spočítajte a upravte počet buniek na 1x106 buniek/vzorku, vykonajte farbenie CD4 a CD8 na povrchu CD3 plus T buniek, chráňte pred svetlom pri izbovej teplote počas 25 minút a použite 10 ml fosfátom pufrovaný roztok obsahujúci 0,5 percenta FBS (fosfátový pufrovaný roztok). fyziologický roztok, PBS) 1 200 r/min 7 min raz premyť, pridať 250 |il PBS, prejsť 200 mesh medeným sitom, prietokovú cytometriu na detekciu expresie CD4 a CD8 na povrchu CD3*T buniek.

Štatistické metódy:

Softvér Flowjo 7.6 spracováva výsledky testov prietokovej cytometrie; Na analýzu údajov sa používa GraphPad Prism 5.0 a všetky údaje sú založené na priemere ± štandardná odchýlka. Použite Študent a test na porovnanie údajov medzi experimentálnymi skupinami. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Výsledok

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Účinok WCDPS a CCDPS na OVA-špecifickú protilátku IgG: WCDPS a CCDPS boli subkutánne imunizované s OVA na detekciu expresie OVA-špecifickej protilátky IgG v sére po 14 dňoch a 21 dňoch imunizácie. Výsledky sú znázornené na obrázku 1, WCDPS a CCDPS podporovali expresiu protilátky IgG v sére spôsobom závislým od dávky; OVA plus WCDPS 50 p,g v porovnaní s OVA plus CCDPS 50 |xg môže významne podporiť OVA-špecifické protilátky v porovnaní s OVA plus CCDPS 50 |xg. Expresia IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Účinok WCDPS a CCDPS na typizáciu OVA-špecifickej protilátky: 21 dní po imunizácii bola detegovaná expresia OVA-špecifickej protilátky typujúcej IgG1 a IgG2a v sére. Výsledky sú znázornené na obrázku 2. OVA-WCDPS 50 prípravok a OVA-WCDPS 100 |xg Mumu významne podporili expresiu protilátky IgG2a v sére ako samotná skupina OVA (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Účinok WCDPS a CCDPS na proliferáciu myších OVA-špecifických lymfocytov: Aby sa zistil účinok WCDPS a CCDPS na slezinové lymfocyty, polysacharidy z cistanche boli subkutánne imunizované OVA a slezinové bunky boli oddelené 21 dní po imunizácii. a na ich detekciu sa použila metóda MTT. Podporte OVA-špecifickú proliferáciu lymfocytov. Výsledky sú znázornené na obrázku 3. WCDPS a CCDPS zvýšili OVA-špecifickú proliferáciu lymfocytov spôsobom závislým od dávky. Kombinácia WCDPS a CCDPS so skupinou OVA môže významne podporiť proliferáciu lymfocytov špecifickú pre OVA v porovnaní so samotnou skupinou OVA. Proliferácia lymfocytov (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Účinok WCDPS a CCDPS na CD3 plus CD4 plus T a CD3 plus CD8 plus T bunky: 21 dní po subkutánnej imunizácii WCDPS a CCDPS s OVA bola expresia CD4 a CD8 v CD3 plus T bunkách detegovaná prietokovou cytometriou ako je znázornené na obrázku 4A Je ukázané, že OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 prípravok a OVA-WCDPS 100 môžu významne podporovať proliferáciu CD3 plus CD4 plus T buniek (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Diskusia

Početné štúdie ukázali, že čínska bylinná medicína má imunomodulačnú funkciu "Da] a existuje tiež veľké množstvo správ dokazujúcich, že polysacharidy čínskej bylinnej medicíny z cistanche možno použiť ako adjuvans na zvýšenie imunitného účinku vakcín"3], a púštne mäso Xinjiang z Congrong vybrané v tejto štúdii je jedinečným liečivým materiálom v Sin-ťiangu a voľne žijúce druhy sú na pokraji vyhynutia, v kombinácii s ich vyššou liečivou hodnotou je pestovanie pestovaných druhov obzvlášť dôležité pre rozvoj a využitie zdrojov liečivých rastlín . Nové vakcíny na súčasnom trhu majú dobrú antigénovú špecifickosť, ale slabú imunogenicitu. Rastlinné polysacharidy z cistanche môžu tento nedostatok nahradiť. moja krajina má veľkú výhodu vo výskume čínskej bylinnej medicíny. Vyšetrujeme adjuvans vakcín z prírodných čínskych bylinných liekov. Vysoká realizovateľnosť. Štúdie ukázali, že čínske rastlinné polysacharidy z cistanche majú rôzne stupne regulácie špecifickej imunity a nešpecifickej imunity, ako napríklad polysacharidy Ganoderma z cistanche, polysacharidy Radixisatidis z cistanche, polysacharidy Poria cocos z cistanche koji, polysacharidy inulín z cistanche27ci 27ci . Môže zvýšiť imunitný účinok vakcíny.

V dôsledku rýchleho nárastu dopytu po cistanche boli jej voľne žijúce druhy ťažené a teraz sú v mojej krajine uvedené ako ohrozené a chránené rastliny. Na základe úspechu umelej výsadby púštneho Caulis Carlsbad sa očakáva, že pestované druhy nahradia voľne žijúce druhy. V tomto experimente sa divo rastúce cistanche a kultivované umelé kultivované cistanche polysacharidy použili ako OVA adjuvans na uskutočnenie in vivo experimentov imunizácie myší. Testovaním rôznych indikátorov bol spočiatku vyhodnotený imunitný účinok divých a pestovaných cistanche, čo poskytlo referenciu pre efektívne využitie pestovaných cistanche v Sin-ťiangu.

S cieľom pochopiť bezpečnosť divoko pestovať cistanche a kultivované umelo pestovanécistanche sacharidyz cistanche, in vivo experimenty s imunizáciou zvierat pozorovali vzhľadové charakteristiky myší a zistili, že myši nemajú po imunizácii žiadne hnačky, vzpriamené vlasy ani slzy a ich aktivity a dýchanie sú normálne a nevyskytujú sa žiadne svalové zášklby. Neexistoval žiadny významný rozdiel v telesnej hmotnosti myší v každej skupine kvôli fenoménu poruchy, čo naznačuje, že imunizácia WCDPS a CCDPS neovplyvnila rast myší a má určitý stupeň bezpečnosti. Výsledky IgG protilátok a typizačného testu ukazujú: WCDPS a CCDPS môžu významne zvýšiť expresiu OVA-špecifickej protilátky IgG po spoločnej imunizácii s OVA a účinok je ekvivalentný hliníkovému adjuvans; môže významne zvýšiť expresiu OVA-špecifickej protilátky typu IgG2a a IgGl. Ukazuje sa, že polysacharidy z cistanche súčasne zosilňujú imunitnú odpoveď Th1 a Th2 a nie je významný rozdiel medzi WCDPS a CCDPS. Výsledky typizácie protilátok IgG2a zistili, že WCDPS a CCDPS a OVA koimunizačná skupina môže významne zvýšiť expresiu IgG2a v porovnaní so skupinou hliníkového adjuvans, hliníkové adjuvans je slabšie pri podpore expresie T buniek, čo dokazuje, že sa používajú WCDPS a CCDPS ako adjuvans Schopnosť podporovať bunkovú imunitu je výrazne vyššia ako u hliníkových adjuvans.

Výsledky detekcie proliferácie lymfocytov metódou MTT ukázali, že bunky sleziny myší v každej skupine boli stimulované OVA. Stimulačný index (SI) proliferácie lymfocytov v WCDPS a CCDPS v kombinácii s OVA bol významne vyšší ako v imunizačnej skupine so samotným OVA. OVA- Stimulačný index v skupine WCDPS 50 Ah a OVA-CCDPS 50 prípravku bol významne vyšší ako v skupine s hliníkovým adjuvans; naznačuje, že WCDPS a CCDPS v kombinácii so skupinou OVA môžu významne zvýšiť proliferáciu lymfocytov špecifických pre OVA v porovnaní so skupinou OVA a skupinou s hliníkovým adjuvans.

Existujú rôzne podskupiny T lymfocytov. CD3 je povrchová molekula všetkých T lymfocytov. Podľa rôznych fenotypov ich možno rozdeliť na CD8 plus T bunky a CD4 T bunky. Molekuly CD4 plus sa môžu vytvárať pôsobením molekúl MHC fl, ktoré sa po aktivácii používajú najmä ako pomocné (Th) bunky. Molekuly CD8 plus musia byť vytvorené pôsobením molekúl MHC I. Po aktivácii sa z nich stávajú zabíjačské (TC alebo CTL) bunky, ktoré hrajú dôležitú úlohu v imunite proti vírusovým infekciám a nádorovej imunite. 3". Prietoková cytometria deteguje expresiu CD3PD4 plus T a CD3 plus CD8 plus T buniek, výsledky ukazujú, že WCDPS a CCDPS môžu významne podporiť proliferáciu CD4 plus T a CD8 plus T buniek v určitom rozsahu dávok a neexistuje žiadny významný rozdiel medzi WCDPS a CCDPS pri rovnakej dávke Kombinácia CCDPS a OVA môže stimulovať expresiu CD3 plus CD4 plus T a CD3 plus CD8 plus T buniek a tieto dva účinky sú ekvivalentné.

Stručne povedané, WCDPS a CCDPS sú bezpečné ako adjuvans. Po imunizácii OVA môžu súčasne zvýšiť špecifickú humorálnu imunitu a bunkovú imunitu. V porovnaní s hliníkovými adjuvans majú WCDPS a CCDPS lepšie účinky na zvýšenie bunkovej imunity a nie je žiadny rozdiel v posilňujúcich účinkoch dvoch polysacharidov z cistanche. Tieto výsledky výskumu poskytujú materiálové referencie pre Xinjiang umelo kultivované polysacharidy cistanche z cistanche ako adjuvans a tiež poskytujú materiálový základ pre skríning bezpečných a účinných imunitných adjuvantov z púšte Xinjiang.cistanche.

Referencie

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, a kol. Imunitná adjuvantná odpoveď polysacharidov z Atractylodis macrocephalus Koidz u kurčiat očkovaných proti pseudomoru hydiny (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. carb pop. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W a kol. Vodný extrakt Pleurotus ferulate zvyšuje dozrievanie a funkciu dendritických buniek odvodených z kostnej drene myši prostredníctvom signálnej dráhy TLR4 [J]. Vaccine, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vakcína.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, a kol. Enterická slizničná imunitná odpoveď môže spustiť imunomodulačnú aktivitu polysacharidu Ganoderma u myší[J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.