Cistanche na liečbu zápalu a ochorenia obličiek: Aká je príčina patogénnej úlohy zápalu pri zahrnutí obličiek do cystinopatie?

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Interakcia medzi galektínom-3 a cystinozínom odhaľuje patogénnu úlohu zápalu pri postihnutí obličiek cystinózou

Tatiana Lobryová^1,2 a kol

Zápalsa podieľa na patogenéze mnohých porúch. Základné mechanizmy sú však často neznáme. Tu testujeme, čicystinóza, proteín, ktorý je súčasťoucystinózaje kritickým regulátorom galektínu^-3, člen rodiny proteínov viažucich b-galaktozidázu, počaszápal. Cystinózaje porucha lyzozomálneho ukladania a napriek všadeprítomnej expresii cystinózy,obličkyje primárny orgán postihnutý chorobou.Cystinózazistilo sa, že zvyšuje lyzozomálnu lokalizáciu a degradáciu galektínu-3. V Ctns^–/–myši, model myšicystinóza, galektín-3 je nadmerne exprimovaný vobličky. Neprítomnosť galektínu-3 u cystinotických myší zlepšuje patologickú funkciu a štruktúru obličiek a znižuje infiltráciu makrofágov/monocytov v obličkách Ctns^–/–Gal3^–/–myši v porovnaní s Ctns^–/– myši. Tieto údaje silne naznačujú, že galektín-3 sprostredkúvazápalzapojené vobličkyprogresia ochorenia pri cystinóze. Ďalej sa zistilo, že galektín-3 interaguje s prozápalovým cytokínom Monocyte Chemoattractant Protein-1, ktorý stimuluje nábor monocytov/makrofágov, a preukázalo sa, že je významne zvýšený v sére myší Ctns–/– a tiež pacienti scystinóza. Naše zistenia teda zdôrazňujú novú úlohu interakcie cystinózy a galektínu-3 pri zápale a poskytujú ďalšie mechanické vysvetlenieobličkyochorenie cystinózy. To môže viesť k oddialeniu identifikácie nových liekových cieľovcystinózaprogresie.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ:chronické ochorenie obličiek; cystinóza; galektín-3;zápal; monocytový chemoatraktant proteín – 1

cistanche môže liečiť chronické ochorenie obličiek a cystinózu

Hlavnou príčinou zápalu je, že oxid dusnatý môže viesť k produkcii zápalových buniek.Cistancheje cenný čínsky bylinný liek. Jeho aktívne zložky môžu inhibovať sekréciu oxidu dusnatého a zohrávajú úlohu pri prevencii a liečbe zápalov a ochorení obličiek.

Prekladové vyhlásenie

Napriek liečbe pacienti stále progredujú do konečného štádia zlyhania obličiek. V tejto štúdii sme ukázali, že absenciacystinózavedie k narušenej lyzozomálnej degradácii galektínu-3 (Gal{1}}), čo vedie kzápala progresiachronické ochorenie obličiekvcystinóza. Tieto zistenia otvárajú nové pohľady na potenciálne terapeutické ciele, ktoré by mohli obmedziť alebo oddialiť degeneráciu obličiek u pacientov scystinóza. Ako také protizápalové lieky a inhibítory Gal-3, ako sú nesteroidné protizápalové lieky alebo indometacín, môžu zlepšiť renálnu patogenézu pri cystinóze.

Zápalje normálna akútna reakcia organizmu na poranenie alebo infekciu,¹ale chronickázápalje spojená s poškodením tkaniva. V prípade chronických ochorení, ako je cukrovka, poškodené tkanivá aktivujú imunitný systém, čo vedie k nepretržitej zápalovej reakcii a nakoniec k degenerácii tkaniva.² Cytokíny sú kľúčovými modulátormizápala sú schopné aktivovať alebo vyriešiťzápalprocesu.3 U pacientov schronické ochorenie obličiek(CKD), zvýšená plazmatická koncentrácia cytokínov (interleukín [IL]-6 a tumor nekrotizujúci faktor-a) azápalmarkery (C-reaktívny proteín, IL-6, hyaluronan a neopterín) sú spojené s progresiou do konečného štádia renálneho ochorenia.4 Pochopenie špecifických mediátorov, ktoré spúšťajú zápalové reakcie, uľahčuje objavenie vhodných liekových cieľov na prevenciu degeneratívneho poškodenia .

Cystinózaje autozomálne recesívne metabolické ochorenie, ktoré patrí do rodiny lyzozomálnych porúch ukladania a je charakterizované akumuláciou cystínu vo všetkých orgánoch.⁵ Gén je defektnýcystinóza, CTNS, kóduje lyzozomálny kotransportér cystín/protón, cystinózu.^6,7 Hoci CTNS je všadeprítomný,obličkyje prvým postihnutým orgánom u osôb scystinóza. Pacienti zvyčajne majú v prvom roku života Fanconiho syndróm, ktorý sa vyznačuje závažnými poruchami tekutín a elektrolytov, slabým rastom a krivicou.⁸Následne sa vyvinie CKD, ktorá progreduje do konečného štádia renálneho ochorenia a vyžadujeobličkytransplantácia. Akumulácia cystínu vo všetkých tkanivách nakoniec vedie k multiorgánovej dysfunkcii; pacienti pociťujú fotofóbiu a slepotu, hypotyreózu, hypogonadizmus, cukrovku, myopatiu a zhoršenie centrálneho nervového systému.⁹ Na pozadí C57BL/6 je vyradený model myši (Ctns^–/–) 10 replikuje obličkový fenotyp cystinotických pacientov,¹¹ ako aj ukladanie cystínových kryštálov v rohovke¹²a dysfunkciou štítnej žľazy.¹³

V tejto štúdii odhaľujeme novú úlohu precystinózavzápalprostredníctvom interakcie s Gal-3. Gal-3 je členom rodiny proteínov viažucich lektín a b-galaktozid ²¹ a podieľa sa na viacerých biologických funkciách, vrátanezápal.²²V kontexteobličkyPri ochoreniach sa ukázalo, že inhibícia Gal{0}} znižuje expresiu prozápalových markerov a renálnu fibrózu a zabraňuje poklesu rýchlosti glomerulárnej filtrácie v modeloch hyperaldosteronizmu, hypertenzie alebo obezity.^23–26Tu uvádzame dôkaz, že vcystinóza, absenciacystinózavedie k nadmernej expresii Gal-3obličkyzvýšenie infiltrácie makrofágov a progresie CKD. Okrem toho identifikujeme monocytový chemoatraktant proteín-1 (MCP{1}}) ako potenciálny mediátor, ktorý odhaľuje nové génové ciele pre liekovú terapiu. VÝSLEDKY Gal-3 interaguje s cystinózou prostredníctvom svojej domény rozpoznávania uhľohydrátov na identifikáciu špecifickej interakcie partnermi pomocou kvantitatívnej hmotnostnej spektrometrie, Madin-Darbyho psomobličky(MDCK) bunky boli transdukované lentivírusovým konštruktom, aby stabilne exprimovali fúzny proteín cystinóza-zelený FL fluorescenčný proteín (GFP). Okrem 9 podjednotiek Hþ adenozíntrifosfatázy vakuolárneho typu publikovaných predtým,¹⁹Gal-3 bol identifikovaný ako jeden z interagujúcich proteínovcystinóza(Obrázok 1a). Táto interakcia bola ďalej potvrdená koimunoprecipitáciou nasledovanou Western blotovaním (obrázok 1b a c). Okrem toho sme ukázali interakciu medzi Gal-3 acystinózabol sprostredkovaný Gal-3 sacharidovou rozpoznávacou doménou (CRD) lokalizovanou v C-terminálnom chvoste proteínu. Interakcia bola inhibovaná tiodigalaktosidom, silným inhibítorom interakcií galektín-sacharid (obrázok 1d). Ako všetky galektíny, aj Gal-3 má afinitu ku glykozylovaným proteínom,21 takže je pravdepodobné, že k interakcii s Gal-3 dochádza prostredníctvom cystinózovej glykozylovanej skupiny umiestnenej v intralyzozomálnom N-terminálnom konci proteínu.²⁷

Cystinozín zvyšuje Gal-3 lyzozomálnu lokalizáciu a degradáciu

Overiť potenciálnu lyzozomálnu lokalizáciu Gal-3 pri interakcii scystinózasme ukázali, že Gal-3, podobne ako katepsín D (intralyzozomálna proteáza), bol chránený pred trávením proteinázou K, zatiaľ čo oba proteíny boli natrávené, keď boli lyzozómy permeabilizované Tritonom X- 100 (obrázok 2a a doplnkové Obrázok S1). Podobné údaje sa získali v lyzozómoch izolovaných z myšej pečene, čo potvrdzuje lyzozomálnu lokalizáciu Gal-3 in vivo (obrázok 2b a c). Kvôli absencii spoľahlivej protilátky na detekciucystinózaimunologické farbenie sa uskutočnilo nacystinóza-GFP-exprimujúce MDCK bunkové línie s anti-Gal-3 protilátkou. Potvrdila prítomnosť Gal-3 v lúmene lyzozómov, zatiaľ čo cystinóza-GFP a Lamp-2 (lyzozomálny transmembránový proteín) sa našli iba na membráne vezikúl (obrázok 2d).

Ak chcete zistiť, čicystinozínbol zapojený do obchodovania s Gal-3, analyzovali sme dynamiku obochcystinózaa Gal-3–pozitívne vezikuly s použitím dvojfarebnej fluorescenčnej mikroskopie s úplným vnútorným odrazom FL na živých bunkách v myších embryonálnych fibroblastoch (MEF) z divokého typu (WT) a Ctns^–/–myši exprimujúce CTNS-DsRed aj Gal-3–GFP. Naša analýza to potvrdilacystinózaa Gal-3 prechádzajú skutočnou kolokalizáciou v Ctns–/– MEF, ako je potvrdené podobnou časopriestorovou distribúciou týchto molekúl v celkovej vnútornej reflexnej FL fluorescenčnej mikroskopickej zóne (obrázok 2e). Údaje vo WT MEF boli podobné (údaje nie sú uvedené). Navyše, keď sa analyzovali MEF transfekované iba Gal- 3–GFP, v cytoplazme sa našiel Gal-3–GFP a nepozorovala sa žiadna odlišná vezikulárna štruktúra, na rozdiel od kotransfekcie s CTNS-DsRed ( údaje nie sú zobrazené).

Tieto údaje boli potvrdené v bunkách 293T, v ktorých sa pozoroval silný signál GFP v cytoplazme v bunkách exprimujúcich iba Gal-3–GFP, zatiaľ čo v bunkách exprimujúcich Gal-3–GFP ajcystinozín-DsRed, Gal-3-GFP bol lokalizovaný hlavne v lyzozómoch exprimujúcich cystinózu-DsRed (obrázok 3a). Okrem toho kvantifikácia expresie Gal-3 proteínu v bunkách transfekovaných samotným Gal-3–GFP alebo Gal- 3–GFP a CTNS-DsRed a Gal-3–GFP a DsRed ako kontrola vykazovala významne menej proteínov Gal-3-GFP v bunkách kotransfekovaných s CTNS-DsRed v porovnaní s bunkami transfekovanými samotným Gal-3-GFP alebo kotransfekovanými s DsRed (obrázok 3b). Celkovo tomu tieto výsledky nasvedčujúcystinozínzlepšuje lyzozomálnu lokalizáciu a degradáciu Gal-3. Ukázalo sa, že cystinozín je zapojený do CMA.28 Proteín tepelného šoku 70 kDa (Hsc70) sa podieľa na CMA tým, že napomáha rozbaľovaniu a translokácii substrátových proteínov cez membránu do lyzozomálneho lúmenu spôsobom závislým od LAMP2A.29,30 Pretože Gal{ {8}} bolo navrhnuté na degradáciu pomocou CMA,31 sme skúmali lokalizáciu Gal{10}} v porovnaní s Hsc70 v cystinotických MEF. Analýza konfokálnou mikroskopiou potvrdila kolokalizáciu Gal-3–GFP na Hsc{13}} pozitívnych štruktúrach vo WT (údaje nie sú uvedené) aj Ctns^–/–buniek (obrázok 3c), čo podporuje kotransportáciu Gal-3 s Hsc70 a naznačuje, že lyzozomálna internalizácia, ale nie rozpoznanie Gal-3 chaperónom je chybnécystinóza.

Gal-3 sa podieľa na zápale obličiek v Ctns^–/–myši

Preštudovať si úlohu Gal-3 vcystinózain vivo sme vytvorili model myši s dvojitým knockoutom, ktorý je v oboch prípadoch deficitnýcystinozína Gal-3 (Ctns^–/–Gal-3^–/–myši). WT, Ctns^–/–a Gal-3^–/–myši boli použité ako kontrolné subjekty. V C57BL/6 Ctns^–/–u myší sa obličkové anomálie objavujú okolo 10. mesiaca veku.11 Štúdie sa preto uskutočnili v 8. až 9. mesiaci, kedyobličkyanomálie sa začínajú zisťovať a v 12. až 15. mesiaci, keď anomálie obličiek progredujú. Pretože sa zistilo, že obsah cystínu je odlišný u mužských a ženských Ctns^–/– obličkyboli analyzované samostatne. Ak sa obsah cystínu zvyšuje s vekom v oboch genotypoch, nepozoroval sa žiadny významný rozdiel v obličkách samcov a samíc medzi myšami Ctns–/– Gal-3–/– a Ctns^–/– myši vo veku 8 až 9 mesiacov a 12 až 15 mesiacov (obrázok 4a).

Renálna funkcia bola hodnotená v sére a moči a nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel medzi WT a Ctns^–/–myši vo veku 8 až 9 mesiacov (údaje nie sú uvedené), ale vo veku 12 až 15 mesiacov, Ctns^–/–myši vykazovali významne vyššie hladiny sérového kreatinínu a močoviny v porovnaní s myšami WT. Zaujímavé je, že Ctns^–/–Gal-3^–/–myši vykazovali zlepšenú funkciu obličiek v porovnaní s Ctns^–/–myši vo veku 12 až 15 mesiacov, s nižším sérovým kreatinínom (P < 0.05) a močovinou (P < 0,05; tabuľka 1).

Histologické štúdie 8- až 9-mesačných a 12- až 15-mesačných myšíobličkyrezy odhalili prítomnosť závažných anomálií v Ctns^–/– obličkyvrátane tubulárnej atrofie, stiahnutých glomerulov a mononukleárnych infiltrátov. Slepá analýza rezov obličiek dosahovala rozsah poškodenia kôry od 1 (zachovaná štruktúra tkaniva) do 6. Priemerné skóre pre Ctns^–/–myši boli 2.64 - 0,36 vo veku 9 mesiacov (n ¼ 7) a 4,12 0,37 vo veku 12 až 15 mesiacov (n ¼ 16). V obličkách Ctns^–/–Gal-3^–/–myši v rovnakom veku boli tieto anomálie podstatne menej rozsiahle: 1.62 - 0.11 vo veku 9 mesiacov (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" a="" 3.{10}}.22="" po="" 12="" až="" 15="" mesiacoch="" (n="" ¼="" 33;="" p="">< 0,05,="" mann-whitneyho="" t-test)="" (obrázok="" 4b="" a="" doplnkový="" obrázok="" s2).="" okrem="" toho="" bolo="" každému="" tkanivu="" priradené="" percento="" tubulárnej="" atrofie="" a="" priemer="" pre="">^–/–myši a Ctns^–/–Gal-3^–/–myši boli 66 percent a 42 percent, v uvedenom poradí, vo veku 12 až 15 mesiacov (P ¼ 0,01). Okrem toho, výrazný rozdiel medzi Ctns^–/–a Ctns^–/– Gal-3^–/– obličkysekcií bola prítomnosť niekoľkých mononukleárnych infiltrátov v Ctns^–/–Gal-3^–/–úseky, zatiaľ čo ťažké infiltráty boli konzistentne pozorované v Ctns^–/– obličky(Obrázok 4b).

Charakterizovali sme mononukleárne infiltráty pozorované histologickým vyšetrením u 8- až 9-mesačných Ctns^–/– obličkyako makrofágy/monocyty spoločným imunofarbením s CD68 a CD45 a s CD68 a hlavnou histokompatibilitou triedy II (doplnkový obrázok S3), ale nie s CD68 a CD163, čo naznačuje, že tieto makrofágy majú prozápalový profil podobný M1-.32 ,33 Kvantifikácia CD{10} pozitívnych buniek odhalila významne menej makrofágov/monocytov vo WT, Gal-3^–/–a Ctns^–/–Gal-3^–/– obličkyv porovnaní s Ctns^–/– obličky(Obrázok 4c), čo potvrdzuje histologické údaje (Obrázok 4b).

Celkovo tieto zistenia naznačujú, že Gal-3 sa podieľa na nábore makrofágov/monocytov v cystinózeobličkya že jeho absencia zlepšuje ochorenie obličiek inCtns^–/–myši. Preto to naznačujezápalje zodpovedný, aspoň čiastočne, za poškodenie obličiek v Ctns^–/– myši.

Obličky s nedostatkom Ctns vykazujú nadmernú expresiu Gal-3

Pomocou analýzy Western blot sme zistili, že expresia Gal-3 sa výrazne zvýšila vobličkyz 12-mesiaca Ctn^s–/–myši v porovnaní s myšami WT (obrázok 5a a b). Aby sme zistili, či je táto zvýšená expresia Gal-3 špecifická pre Ctns^–/– obličkysme kvantifikovali expresiu Gal-3 na úrovni transkriptu a proteínu vobličkyod myší s CKD vyvolaným štandardnou medzisúčtovou 2-krokovou nefrektómiou a od zvierat, ktoré podstúpili falošnú operáciu. WT a Ctns^–/–myši boli použité ako kontrolné subjekty. Gal{0}} transkripty boli významne zvýšené v Ctns–/– a falošných obličkách, ale vysoko zvýšené v CKDobličkyv porovnaní s myšami WT (obrázok 5c). Naproti tomu na úrovni proteínu bol Gal-3 detegovaný iba v Ctns^–/–obličky, čo silne naznačuje, že iba Ctns^–/–obličky neboli schopné degradovať Gal-3 proteín (obrázok 5d). Imunofluorescenčné farbenie Gal-3 u myšíobličkypo 8 až 9 mesiacoch tiež preukázala nadmernú expresiu Gal-3 v Ctns^–/– obličkyv porovnaní s WTobličky(Obrázok 5e). Okrem toho bol Gal-3 exprimovaný CD68þ makrofágmi, ako aj obličkovými bunkami v Ctns^–/– obličkyvo veku 8 až 9 mesiacov (doplnkový obrázok S4). Celkovo sú tieto údaje v súlade so zníženou degradáciou Gal-3 v neprítomnosticystinózaako sa preukázalo in vitro (obrázok 3a a b), čo vedie k akumulácii proteínu Gal-3 v Ctns^–/– obličky.

Neprítomnosť cystinozínu vedie k zvýšeniu sérovej MCP-1 prostredníctvom zvýšenej regulácie Gal-3

Gal-3 regulujezápalprostredníctvom rôznych mechanizmov.34 Získať teda ďalšie poznatky o mechanizme vcystinózaskúmali sme expresiu rôznych prozápalových alebo protizápalových cytokínov v sére 12- až 15-mesačných WT, Ctns^–/–, dievča-3^–/–a Ctns^–/–Gal- 3^–/–myši. Šesť hladín cytokínov sa meralo pomocou myšieho cytometrického poľa guľôčok, MCP{0}}, interferónu-g, faktora nekrózy nádorov a IL-10, IL-6 a IL-12p70. Iba expresia MCP-1 bola významne zvýšená v sére myší Ctns–/– v porovnaní s myšami WT a Gal-3–/– a tiež s Ctns^–/–Gal-3^–/–myši, ktorých hladiny MCP{0}} v sére boli porovnateľné s myšami WT (obrázok 6a). MCP-1 je produkovaný rôznymi typmi buniek, pričom hlavným zdrojom MCP-1 sú makrofágy a monocyty35 a pôsobí ako chemoatraktant pre monocyty a makrofágy regulujúci ich migráciu a infiltráciu. Na rozdiel od toho sa v rovnakom veku zistilo, že expresia Gal-3 je podobná v sére myší Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) a myší WT (40).{12} },41 ng/ml; n=7).

Vzťah medzi Gal-3 a MCP-1 bol ďalej skúmaný koimunoprecipitáciou pomocou Gal-3–GFP a MCP-1–DsRed– alebo Gal-3– GFP a CTNS-DsRed– (ako pozitívna kontrola) exprimujúce 293T bunky. Bola pozorovaná interakcia medzi Gal-3 a MCP-1 (obrázok 6b), čo naznačuje priamu indukciu MCP-1 pomocou Gal-3. Inkubácia s N-acetyl-D-laktozamínom (LacNAc), inhibítorom Gal-3 CRD, ukázala, že na rozdiel odcystinozíninterakcie, CRD nie je zapojený do interakcie medzi Gal-3 a MCP-1 (obrázok 6c).

Aby sme vyhodnotili, či je toto zistenie relevantné pre ľudí, merali sme hladiny Gal-3 a MCP-1 u pacientov scystinózaktorí nepodstupovali imunosupresívnu liečbu alebo neužívali protizápalové lieky. Hoci sa zistilo, že hladina Gal-3 je mierne zvýšená v sére pacientov s cystinózou v porovnaní so zdravými darcami, rozdiel nebol významný (obrázok 6e), čo potvrdzuje naše výsledky získané v Ctns^–/–myši. Len 2 pacienti mali vysokú hladinu Gal-3 (25,34 a 39,54 ng/ml); boli považované za odľahlé hodnoty, a preto neboli zahrnuté na obrázku 6e. Na rozdiel od toho sa pri použití enzýmovo viazaného imunosorbentného testu namiereného proti ľudskému MCP-1 (obrázok 6d) zistilo, že hladiny MCP{10}} v sére sú významne zvýšené u pacientov scystinóza(252.1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; vekové rozpätie 1–23 rokov) napriek liečbe cysteamínom v porovnaní so zdravými kontrolnými jedincami (166.9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1 0; vekový rozsah 8 – 63 rokov) (P < 0,001).="" u="" oboch="" pacientov="" sa="" nezistila="" žiadna="" korelácia="" medzi="" vekom="" a="" hladinou="">cystinózaa zdravých darcov (údaje nie sú uvedené).

Cistanchemáprotizápalovévlastnosti

DISKUSIA

Napriek tomu, že cystín sa hromadí vo všetkých tkanivách u pacientov scystinóza, obličky sú orgány, ktoré sú najzraniteľnejšie voči poškodeniu. Preto veríme, že akumulácia cystínu nie je výlučne zodpovedná za degeneráciu obličiek. Tu popisujeme novú rolu precystinozínv reguláciizápalpodieľa sa na progresii chronického ochorenia obličiek vcystinóza. Táto štúdia môže vysvetliť, prečo sa pacienti vyvinú do konečného štádia zlyhania obličiek napriek tomu, že podstupujú liečbu cysteamínom.

Štúdia molekulárnych partnerov cystinózy odhalila priamu interakciu s Gal-3, ktorá môže byť inhibovaná inhibítormi Gal-3 CRD. Nedávne štúdie ukázali, že Gal-3 by mohol interagovať s glykánmi umiestnenými v lyzozomálnom lúmene po lyzozomálnom poškodení, ako je nahromadenie kryštálov.36 V našej štúdii interakcia medzi Gal-3 acystinozínbola študovaná na zdravých bunkách exprimujúcichcystinozína teda neakumulovať cysteín alebo cystínové kryštály. Okrem toho nadmerná expresia Gal-3 aj cystinozínu v zdravých bunkách zmenila subcelulárnu lokalizáciu Gal-3, ktorá bola potom lokalizovaná v lyzozómoch, v porovnaní s nadmernou expresiou iba Gal-3, ktorá sa nachádzal v cytoplazme. Tieto výsledky silne naznačujú, že interakcia medzi Gal-3 a cystinozínom sa vyskytuje nezávisle od poškodenia lyzozómov a že cystinozín je aktívne zodpovedný za lokalizáciu Gal-3 lyzozómov. V minulosti sa ukázalo, že Gal-3 sa degraduje prostredníctvom proteolýzy závislej od lyzozómov v neprítomnosti Abl a Arg, 2 tyrozínkináz.³¹

Navyše sme to ukázalicystinózaa Gal-3 sa spolulokalizujú v dynamických vezikulárnych štruktúrach a sú spolu mobilizované časopriestorovým spôsobom.cystinozínpredtým bol spojený s mechanizmami prenosu lyzozomálneho LAMP2A, jediného známeho CMA receptora, ktorý je nesprávne lokalizovaný vcystinóza.²⁸V minulosti sa ukázalo, že degradácia Gal-3 je sprostredkovaná CMA.³¹Analýza konfokálnou mikroskopiou potvrdila kolokalizáciu Gal-3 na Hsc70-pozitívnych štruktúrach v oboch Ctns^–/– a WT bunky, podporujúce kotransportáciu Gal-3 s Hsc70 na prezentáciu v lyzozóme a degradáciu pomocou CMA, pretože Hsc70 napomáha translokácii substrátových proteínov cez membránu do lyzozomálneho lúmenu.^29,30Možná interpretácia našich výsledkov je takátocystinozínreguluje obchodovanie a dodávanie Gal-3 do CMA-aktívnych lyzozómov na degradáciu.

Táto nová cestacystinozínGal-3 lyzozomálna lokalizácia a degradácia je podporovaná in vivo, pretože myši s deficitom Ctns vykazujú nadmernú expresiu Gal-3 vobličky. Navyše, zatiaľ čo zvýšená mRNA Gal{0}} bola obmedzená v Ctns^–/–obličky v porovnaní s iným modelom CKD, veľké množstvo proteínu Gal-3 bolo detegované iba v Ctns^–/– obličky. Tieto údaje silne podporujú záver, žecystinozínsa podieľa na degradácii Gal-3 proteínu, ktorý môže kontrolovať nadmernú expresiu Gal-3 mRNA v stresových podmienkach, ako je CKD.

Gal-3 má niekoľko biologických úloh vrátane úloh v akútnych a chronických prípadochzápalpriťahovaním monocytov a makrofágov.^37,38V Ctns^–/– u myší sme pozorovali ťažké mononukleárne infiltráty hlavne vobličkyako už bolo opísané,^11,39ktoré boli charakterizované ako monocyty/makrofágy. Naproti tomu obličky z dvojitého knockoutu Ctns^–/–Gal-3^–/–myši vykazovali veľmi málo monocytov/makrofágových infiltrátov, čo silne naznačuje, že Gal-3 sa podieľa nazápalv obličkách Ctns^–/–myši. V kontexte opakovaného poškodenia tkaniva môže Gal-3 spustiť prechod do chronickéhozápala fibrózy.³⁴V súlade s týmito zisteniami naše údaje preukazujú zapojenie Gal-3 do progresie CKD vcystinóza. Skutočne, dvojitý knockout Ctns^–/– Gal-3^–/–myši sa ukázali lepšieobličkyfunkcie a štruktúry v porovnaní s Ctns^–/–myši. Podobne myši s deficitom Gal-3 vykazujú menej renálnej fibrózy vobličkyv porovnaní s myšami WT po jednostrannej obštrukcii močovodu,⁴⁰ a Gal{0}} knockout myši vystavené ischemicko-reperfúznemu poškodeniu mali lepšiu funkciu obličiek v porovnaní s WT myšami vystavenými ischemicko-reperfúznemu poškodeniu.⁴¹

Hoci sa zistila korelácia medzi hladinami Gal-3 v plazme a rozvojom CKD,42 nebol pozorovaný žiadny rozdiel v expresii Gal{2}} v sére myší a ľudí postihnutýchcystinózaa zdravé kontrolné subjekty. Meraním rôznych hladín cytokínov v sére sme zistili významné zvýšenie MCP-1 v Ctns^–/–myši, zatiaľ čo Ctns^–/–Gal-3^–/–myši mali hladiny porovnateľné s hladinami WT myší. MCP-1 je cytokín, ktorý sa môže uvoľňovať v sére a vytvára gradient na prilákanie monocytov a makrofágov na miesto poškodenia.35 Nárast MCP-1 v sére Ctns^–/–myši v porovnaní s Ctns^–/–Gal-3^–/–myši boli nezávislé od akumulácie cystínu, pretožeobličkyobsah cystínu bol podobný v oboch genotypoch. Okrem toho, napriek liečbe cysteamínom, ktorá umožnila výstup cystínu z lyzozómov, sa zistilo, že MCP-1 sa významne zvýšil v sére pacientov scystinózav porovnaní so zdravými darcami. Tieto údaje silne naznačujú, že absenciacystinozín, a nie akumulácia cystínu, je zodpovedná za zvýšenie MCP-1 v sére. Okrem toho sme ukázali priamu interakciu medzi Gal-3 a MCP-1, čo nedávno navrhli Gordon-Alonso et al.43, ale ďalej sa to neštudovalo. Mechanizmus aktivácie MCP-3 sprostredkovanej Gal-1 tu nebol študovaný. Hypotézou je prítomnosť signálneho peptidu v ľudskom MCP-1, ktorý možno štiepiť, aby sa zvýšila jeho sekrécia.44 Okrem toho môže plazmín štiepiť C-koniec MCP-1, čo zvyšuje jeho chemoatraktant účinnosť.45 Okrem toho, v korelácii s našimi údajmi, inhibícia MCP-1 na myšom modeli diabetickej nefropatie zabránila infiltrácii obličkových makrofágov a zlepšila funkciu obličiek.46,47 Vcystinóza, naše údaje silne naznačujú, že absenciacystinozínvedie k zvýšeniu Gal-3, čo aktivuje MCP{1}} mobilizáciu krvi, čím sa zvyšuje funkcia obličiekzápala progresiachronické ochorenie obličiek.

Tieto zistenia otvárajú nové pohľady na potenciálne terapeutické ciele, ktoré by mohli obmedziť alebo oddialiť degeneráciu obličiek u pacientov scystinóza. Zistilo sa, že nesteroidné protizápalové lieky, ako je aspirín a indometacín, inhibujú expresiu Gal-3 inhibíciou jeho transkripcie.48 Indometacín sa v skutočnosti používa na reguláciu polyúrie a polydipsiecystinóza,49 a nedávna štúdia 307 európskych pacientov s cystinózou preukázala zlepšený renálny výsledok u pacientov liečených indometacínom.50 Vo svetle našej štúdie sa ukázalo, že použitie indometacínu alebo nesteroidných protizápalových liekov na liečbucystinózapacienti môžu byť prehodnotení.

METÓDY

Pokusy na zvieratách

C57BL/6 Ctns^–/–myši boli poskytnuté Dr. Antignac (Inserm U1163, Paríž, Francúzsko). C57BL/6 galektín-3 null (Gal-3^–/–) myši poskytli Dr. Fu-Tong Liu (University of California, Davis) a Dr. Jerrold M. Olefsky (University of California, San Diego). Šľachtiteľská stratégia na generovanie WT, Ctns^–/–, dievča-3^–/–, Ctns–/– a Gal- 3^–/–myši sú opísané v doplnkových metódach.

Bunkové línie

neporiadok vznikol z novorodeneckých kožných biopsií WT a Ctns^–/–myši. Bunkové línie MEF, 293T a MDCK typu II (ATCC, Manassas, VA) boli pestované v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu obsahujúcom 10 percent fetálneho teľacieho séra alebo fetálneho hovädzieho séra, 100 jednotiek/ml penicilínu, 0,1 mg/ml streptomycínu a 2 mM L-glutamínu.

Koimunoprecipitácia a analýza hmotnostnej spektrometrie

Na štúdium interakcií proteín-proteín sa bunky MDCK transdukovali pomocou lentivírusového vektora pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE, aby sa stabilne exprimovalicystinozín-GFP.⁵¹Koimunoprecipitácia sa uskutočnila tak, ako je opísané v Doplnkových metódach. Ko-imunoprecipitované proteíny sa rozdelili elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli sodnom (SDS-PAGE) a analyzovali hmotnostnou spektrometriou, LTQ Orbitrap, ako už bolo opísané.¹⁹

293T bunky exprimujúce Gal-3–GFP a MCP-1–DsRed alebo Gal-3– GFP a CTNS-DsRed sa použili na koimunoprecipitáciu, ako je opísané v doplnkových metódach. Koimunoprecipitované proteíny sa rozdelili pomocou SDS-PAGE a Gal-3-viažuci MCP-1 sa detegoval pomocou protilátky anti-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

Subcelulárna frakcionácia

Z myší C57BL/6 sa získalo osem pečene a pripravilo sa tak, ako bolo opísané vyššie.52 Podmienky gradientu boli v podstate rovnaké, ako sú opísané v pôvodnej publikácii,52 s výnimkou toho, že namiesto metrizamidu sa použil Nycodenz.

Liečba inhibítorom Gal-3 a proteinázy K

Lyzáty zcystinozín-GFP MDCK bunky a 293T exprimujúce Gal-3–GFP a CTNS-DsRed alebo Gal-3–GFP a MCP-1–DsRed boli inkubované s alebo bez 5 mM tiodigalaktozidu alebo 5 mM N - Acetyl-D-laktozamín, respektíve 2 inhibítory Gal-3 CRD. Po 30 minútach inkubácie pri 4 - C za stáleho trepania sa lyzáty inkubovali s 50 ml anti-GFP mikroguľôčok a uskutočnila sa imunoprecipitácia, ako bolo uvedené vyššie. Vyzrážané proteíny sa rozdelili pomocou SDS-PAGE na 10 percentnom géli.

Lyzáty zcystinozín-GFP MDCK bunky a frakcie obohatené o lyzozómy myšacej pečene sa inkubovali s alebo bez 2 percent Triton X-100 počas 10 minút pri 4 - C a potom sa inkubovali 30 minút s alebo bez 2,5 mg/ml a 25 mg /ml proteinázy K, resp. Po inaktivácii enzýmu 1 mM fenylmetylsulfonylfluoridom počas 5 minút pri 4 - C sa proteíny rozdelili pomocou SDS-PAGE na 10 percentnom géli.

Imunofluorescenčná analýza

Fixované MDCK bunky boli inkubované s anti-Lamp{0}} (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) a anti-Gal-3 protilátkou (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) 2 hodiny pri izbovej teplote, po čom nasledoval Alexa Fluor 555 sekundárnej protilátky (Invitrogen, Carlsbad, CA) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Konfokálne snímky boli urobené pomocou mikroskopu Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Nemecko).

293T bunky prechodne exprimujúce Gal-3–GFP samotný, Gal-3–GFP a DsRed alebo Gal-3–GFP acystinozín-DsRed boli kultivované na krycom sklíčku predtým, ako boli pripevnené na sklíčko. Bunky sa zobrazili pomocou prístroja Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japonsko).

Opravenéobličkyrezy sa inkubovali cez noc pri 4 - C s anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) alebo anti-Gal-3 protilátkou (BioLegend), po ktorej nasledovala sekundárna protilátka Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 hodina pri izbovej teplote. Obrázky boli získané pomocou prístroja Keyence BZ-X700. Kvantifikácia expresie CD68 je opísaná v Doplnkových metódach.

MEF exprimujúce Gal-3-GFP sa zafarbili pomocou protilátky anti-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) a zobrazili sa, ako je opísané vyššie.⁵³

Totálna vnútorná reflexná FL fluorescenčná mikroskopia

WT a Ctns^–/–MEF exprimujúce Gal-3–GFP a CTNS-DsRed sa naočkovali na 4-komorovú 35- mm borosilikátovú spodnú misku (Cellvis, Mountain View, CA). Po 2 dňoch v kultúre sa MEF analyzovali pomocou úplnej vnútornej reflexnej FL fluorescenčnej mikroskopie, ako je opísané vyššie⁵⁴a v doplnkových metódach. Obrázky sa analyzovali pomocou softvéru ImageJ.

Analýza výrazu Gal-3

293T bunky exprimujúce Gal-3–GFP, Gal-3–GFP a DsRed alebo Gal-3–GFP a CTNS-DsRed a explantovanéobličkysa lýzovali v rádioimunoprecipitačnom testovacom pufri obsahujúcom koktail inhibítora proteinázy. Proteíny boli oddelené na 4- až 15-percentnom géli a odhalené pomocou anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) alebo anti-glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) .

Obličkysa homogenizovali v RLT pufri obsahujúcom b-merkaptoetanol s použitím Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francúzsko). Izolovala sa RNA a uskutočnila sa Gal-3 – špecifická kvapôčková digitálna polymerázová reťazová reakcia, ako je opísané v Doplnkových metódach. Expresia transkriptu Gal-3 bola vyjadrená ako pomer v porovnaní s endogénnou kontrolou 18S. Na zistenie hladiny Gal-3 v myších a ľudských sérach sa použil enzýmový imunosorbentový test (Abcam) podľa pokynov výrobcu.

Funkcia obličiek

Hladiny fosfátu v sére a moči, sérového kreatinínu a močoviny sa odhadli pomocou súpravy QuantiChrom Phosphate Assay Kit, súpravy Quanti Chrom Creatinine Kit a súpravy QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Hladiny proteínu v moči sa merali pomocou súpravy Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).

Histológia

V čase, keď boli myši zabité,obličkyboli zozbierané, fixované vo formalíne a zaliate do parafínu. Rezy zafarbené hematoxylínom a eozínom boli zaslepene preskúmané Dr. Marie Claire Gubler, ako je opísané v Doplnkových metódach.

Meranie obsahu cystínu

Meranie cystínu v tkanive sa uskutočňovalo hmotnostnou spektrometriou (LC-ESI-MS/MS), ako bolo opísané vyššie.³⁹

Štandardná nefrektómia a simulovaná operácia

CKD u myší bolo vyvolané štandardnou operáciou medzisúčtu 2-štádia nefrektómie, ako bolo opísané vyššie.^55,56Falošná skupina myší podstúpila rovnaký postup, ale bez akéhokoľvek rezaniaobličkytkaniva.

Hladina cytokínov v sére

Na meranie hladín cytokínov v myšom sére, myšzápalkit cytometric bead array (BD Biosciences, San Jose, CA) sa uskutočnil podľa pokynov výrobcu. Koncentrácia MCP-1 v ľudskom sére bola stanovená pomocou enzýmového imunosorbentného testu namiereného proti MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) podľa pokynov výrobcu.

Štatistická analýza

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer - SEM. Významnosť výsledku bola hodnotená nepárovým 2-tailed t-testom alebo nepárovým 2-tailed t-testom s Welchovou korekciou. Skupinové porovnania 3 alebo viacerých podmienok sa uskutočňovali pomocou parametrických analýz rozptylu, po ktorých nasledoval Tukeyho viacnásobný porovnávací test na párové porovnania. Histologické skóre sa porovnávalo pomocou Mann-Whitneyho testu. Analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). P-hodnota menšia ako 0,05 sa považovala za významnú.

Schválenie štúdie

Experimenty na myšiach sa uskutočňovali v súlade s protokolmi InstitutionalAnimal Use Committee. Použitie ľudského tkaniva v tejto štúdii schválila Kalifornská univerzita v San Diegu, HumanResearch Protections Program.

DISCLOSURE

SC je členom vedeckej rady a členom správnej radycystinózaVýskumná nadácia. SC je spoluzakladateľom, akcionárom a členom vedeckej rady a predstavenstva spoločnosti GenStem TherapeuticsInc. Podmienky tohto dojednania boli preskúmané a schválené Kalifornskou univerzitou v San Diegu v súlade s jej zásadami konfliktu záujmov. Všetci ostatní autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

poskytovanie Gal-3^–/–myši. Ďakujeme Lou Devanneaux a NicholeFlerchinger za ich technickú pomoc a Elizabeth Souter za kontrolu rukopisu. Za poskytnutie myši ďakujeme Christopherovi Alfonsovi z BDBiosciencezápalcytometric bead array a za jeho pomoc pri interpretácii výsledkov. Túto prácu podporili granty Národného inštitútu zdravia RO1-DK090058 a R01-DK110162,CystinózaResearch Foundation a California Institute of Regenerative Medicine (CIRM, CLIN-09230). TL je podporovaná absolventským štipendiom z Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB a JZ sú podporované štipendiom zcystinózaVýskumná nadácia. Zariadenie UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility bolo financované grantom Národného inštitútu neurologických porúch a mŕtvice (NINDS) P30-NS047101.

LITERATÚRA

1. Medzhitov R. Pôvod a fyziologické úlohyzápal. Príroda. 2008;454:428–435.

2. Donath MY. Zacieleniezápalpri liečbe cukrovky 2. typu. Diabetes Obes Metab. 2013;15(suppl 3):193–196.

3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Cytokíny v syndróme systémovej zápalovej odpovede: prehľad. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth. 2010;2:161–175.

4. Pecoits-Filho R, Heimburger O., Barany P. a kol. Asociácie medzi cirkulujúcimi zápalovými markermi a reziduálnou renálnou funkciou u pacientov s CRF. Am JObličkyDis. 2003;41:1212–1218.

5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cystinóza. N Engl J Med. 2002;347: 111–121.

6. Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Zameraniecystinozínk lyzozomálnej membráne vyžaduje signál na báze tyrozínu a nový triediaci motív. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.

7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.cystinozín, proteín defektný vcystinóza, je H()-riadený lyzozomálny cystínový transportér. EMBO J. 2001;20:5940–5949.

8. Cherqui S, Courtoy PJ. Renálny Fanconiho syndróm vcystinóza: patogénne pohľady a terapeutické perspektívy. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.

9. Nesterová G, Gahl W. Nefropatickácystinóza: neskoré komplikácie multisystémového ochorenia. Pediatr Nephrol. 2008;23:863–878.

10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, a kol. Intralyzozomálna akumulácia cystínu u myší chýbacystinozín, proteín defektný vcystinóza. Mol Cell Biol. 2002;22:7622–7632.

11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, a kol. Renálny fenotypcystinózamyšací model závisí od genetického pozadia. Transplantácia nefrolového číselníka. 2010;25:1059–1066.

12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, a kol. Očné anomálie v acystinózazvierací model napodobňuje patogenézu ochorenia. Pediatr Res. 2007;62:156–162.

13. Sprievodca Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, a kol. Myší model naznačuje dva mechanizmy pre zmeny štítnej žľazy u infantilných detícystinóza: znížená syntéza tyreoglobulínu v dôsledku stresu endoplazmatického retikula/rozbalenej proteínovej odpovede a zhoršeného lyzozomálneho spracovania. Endokrinológia. 2015;156:2349–2362.

14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, a kol. Cysteamínová terapia odďaľuje progresiu nefropatiecystinózau neskorých adolescentov a dospelých.ObličkyInt. 2012;81:179–189.

15. Cherqui S. Cysteamínová terapia: liečba precystinóza, nie liek.ObličkyInt. 2012;81:127–129.

16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nefropatickécystinózau dospelých: prirodzený priebeh a účinky perorálnej liečby cysteamínom. Ann Intern Med. 2007;147:242–250.

17. Cherqui S, Courtoy PJ. Renálny Fanconiho syndróm vcystinóza: patogénne pohľady a terapeutické perspektívy. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.

18. Napolitano G, Johnson JL, He J, a kol. Poškodenie autofágie sprostredkovanej chaperónom vedie k selektívnym defektom lyzozomálnej degradácie pri chorobe lyzozomálneho ukladaniacystinóza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.

19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.cystinozínje zložkou vakuolárneho komplexu H-ATPáza-regulátor-handra, ktorý riadi cicavčí cieľ signalizácie rapamycínového komplexu 1. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678–1688.

20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, a kol. Aktivácia transkripčného faktora EB zachraňuje lyzozomálne abnormality pri cystinotikáchobličkybunky.ObličkyInt. 2016;89:862–873.

21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: príbeh s otvoreným koncom. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.

22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galektín-3: jedna molekula pre abecedu chorôb od A po Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).

23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M a kol. Vplyv inhibície galektínu-3 na poškodenie srdca a obličiek vyvolané aldosterónom. Zlyhanie srdca JACC. 2015;3:59–67.

24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, a kol. Farmakologická inhibícia galektínu-3 chráni pred hypertenznou nefropatiou. Am J Physiol Renálny Physiol. 2015;308:F500–F509.

25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Modifikovaný citrusový pektín znižuje expresiu galektínu{2}} a závažnosť ochorenia pri experimentálnych akútnych ochoreniachobličkyzranenie. PloS One. 2011;6:e18683.

26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Blokáda galektínu-3 znižuje renálnu fibrózu v dvoch normotenzných experimentálnych modeloch poškodenia obličiek. PloS One. 2016;11:e0166272.

27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, a kol. Dôsledok tohocystinózaglykozylácia na stabilitu proteínu diferenciálnym dynamickým stabilným izotopovým značením aminokyselinami v bunkovej kultúre (SILAC). Mol Cell Proteomics. 2017;16:457–468.

28. Napolitano G, Johnson JL, He J, a kol. Poškodenie autofágie sprostredkovanej chaperónom vedie k selektívnym defektom lyzozomálnej degradácie pri chorobe lyzozomálneho ukladaniacystinóza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.

29. Majeski AE, Kocka JF. Mechanizmy autofágie sprostredkovanej chaperónom. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435–2444.

30. Xie W, Zhang L, Jiao H a kol. autofágia sprostredkovaná chaperónom zabraňuje apoptóze degradáciou BBC3/PUMA. Autofágia. 2015;11:1623–1635.

31. Li X, Ma Q, Wang J a kol. c-Abl a Arg tyrozínkinázy regulujú lyzozomálnu degradáciu onkoproteínu galektín-3. Cell Death Differ. 2010;17:1277–1287.

32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Prevaha M2-polarizovaných makrofágov pri rakovine močového mechúra ovplyvňuje angiogenézu, stupeň nádoru a invazívnosť. Oncol Lett. 2016;11:3403–3408.

33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Oveľa viac ako makrofágov M1 a M2 existuje aj makrofágov CD169( ) a TCR( ). Front Immunol. 2015;6:263.

34. Henderson NC, Sethi T. Reguláciazápalgalektínom-3. Immunologic Rev. 2009;230:160–171.

35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocytový chemoatraktantný proteín-1 (MCP-1): prehľad. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313–326.

36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Spustený nábor strojov ESCRT podporuje endolyzozomálnu opravu. Veda. 2018;360(6384).

37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, a kol. Regulácia alternatívnej aktivácie makrofágov galektínom-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.

38. Sano H, Hsu DK, Yu L, a kol. Ľudský galektín-3 je nový chemoatraktant pre monocyty a makrofágy. J Immunol. 2000;165:2156–2164.