Granule Yishen Qingli Heluo v liečbe chronického ochorenia obličiek: Analýza sieťovej farmakológie a experimentálna validácia Ⅱ

Výsledky

Informácie o aktívnych zlúčeninách a súvisiacich cieľoch YQHG

Celkovo 63 aktívnych zlúčenín YQHG bolo vybraných z databázy TCMSP a rozsiahlej ťažby literatúry. Všetky aktívne zlúčeniny vyhovovali metóde filtrovania ADME, OB väčší alebo rovný 30% a DL väčší alebo rovný 0,18. Počty zlúčenín pre každú bylinu v YQHG boli 17 (NX), 13 (TFL), 16 (HQ), 10 (HZ), 10 (DH), 8 (HJ), 5 (SW), 2 (DG), 2 (JXC), 1 (LYX) (tabuľka S1). Medzi 63 účinnými látkami bolo 9 zlúčenín, ktoré existovali vo viac ako jednej bylinke. Napríklad zlúčeninu Quercetin možno nájsť v 6 bylinkách (HQ, NX, HZ, TFL, SW, JXC) YQHG. Identifikovali sme 250 cieľov pre 63 aktívnych zlúčenín (tabuľka S2). Počet potenciálnych cieľov ovplyvnených aktívnymi zlúčeninami z HQ, NX, HZ, TFL, SW, JXC, HJ, DH, DG a LYX bol 208, 201, 193, 174, 169, 150, 55, 43, 30 a 11 , resp. Mnohé aktívne zlúčeniny prejavujú svoje farmakologické účinky väzbou na viac ako jeden cieľ súčasne. Napríklad wogonín ako aktívna zlúčenina v NX môže interagovať so 43 cieľmi vrátane TP53, CASP3, PTGS2, IL-6 a tak ďalej.

ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK

Kandidátske ciele YQHG proti CKD

Prostredníctvom skríningu databázy sa získalo 1161 cieľov súvisiacich s CKD (526 v databáze OMIM, 379 v databáze DisGeNET, 331 v databáze GeneCards, 113 v databáze MalaCards a 73 v databáze TTD). Priesečníkové ciele boli znázornené Vennovým diagramom (obrázok 2A).

Obrázok 2 Vennove diagramy. (A) Ciele CKD. Ciele súvisiace s CKD boli získané z piatich databáz (OMIM, DisGeNET, GeneCards, MalaCards, TTD). (B) Kandidátske ciele YQHG pri liečbe CKD.

Potenciálne ciele YQHG sa prekrývali s cieľmi súvisiacimi s CKD platformou Venn (obrázok 2B). Celkovo bolo vybratých 79 pretínajúcich sa cieľov ako kandidátskych cieľov pre YQHG proti CKD (tabuľka 2). Tu sme skúmali distribúciu cieľov relevantných pre CKD medzi 10 bylinami (72 z HQ, 72 z HZ, 69 z NX, 64 z SW, 64 z TFL, 59 z JXC, 21 z HJ, 15 z DH, 9 z DG, 2 od LYX) prostredníctvom Vennovej analýzy. Týchto 79 cieľov sa potom použilo na vytvorenie siete H-CT pomocou Cytoscape.

Vizualizácia siete

(1) C-T network. To reveal the synergistic effects of multi-compound and multi-target in the 10 herbs of YQHG (Figure 3A) and evaluate its mechanism of action, a C-T network analysis was carried out (Figure 3B). The active compounds corresponding to the abbreviations in Figure 3 were shown in Table S1. The C-T network consisted of 63 active compounds, 250 targets, and 914 C-T interactions (313 nodes and 914 edges). The average degree centrality, betweenness centrality, and closeness centrality values were 14.67, 0.02, and 0.33, respectively. The above topological parameters of 12 compounds were higher than the average, which were shown in Table 3. These compounds were considered to be the main active compounds of YQHG in the treatment of CKD. The average number of targets for each herb was 123, indicating the multi-target properties of these herbs. A total of 31 key targets satisfied the screening rules (degree centrality>3.656, betweenness centrality>0.003, closeness centrality>0.333), of which PTGS2 has the highest filtering parameters (degree centrality=41, betweenness centrality=0.085, closeness centrality=0.516). (2) H-CT network. To explore the synergistic effects of YQHG at the individual herb level, we constructed a H-CT network (Figure 3C). We found that 6 herbs covered more than 75% of the 79 candidate targets, of which HQ and HZ both covered 91%. Interestingly, the 10 herbs in YQHG shared a common target, which is PTGS2. The existence of this target is a manifestation of the synergistic effect of TCM, which may be involved in the pathological process of CKD. (3) PPI network. The proteins with a combined score>0.90 boli vybrané na vytvorenie siete PPI (obrázok 3D). Parameter "Stupeň" bol použitý na vyhodnotenie topologickej dôležitosti uzlov v sieti. Prvých 6 proteínov získaných sieťovým analyzátorom v softvéri Cytoscape bolo TP53, AKT1, RELA, IL6, MAPK1 a ESR1. Následne sa na ďalšiu analýzu použilo 6 najlepších aktívnych zlúčenín (Quercetin, Kaempferol, Luteolin, 7-O-metylizomukronulatol, wogonín, Stigmasterol) a šesť proteínových cieľov skrínovaných cez siete CT a PPI.

Analýza obohatenia GO a KEGG

Termíny GO boli klasifikované podľa biologického procesu, molekulárnej funkcie a bunkovej zložky a prvých 10 bolo znázornených na obrázku 4A. Kandidátske cieľové proteíny kategórie molekulárnej funkcie boli väčšinou spojené s aktivitou receptorového aktivátora a aktivitou receptor-ligand. Cieľové proteíny v kategórii bunkových komponentov boli obohatené o membránovú mikrodoménu a membránový raft. Pokiaľ ide o biologický proces GO, zohrával hlavnú úlohu vo vyššie uvedených troch pojmoch GO. Preto objasnenie relevantného biologického procesu YQHG proti CKD do určitej miery poukázalo na smerovanie mechanizmu. Podľa 79 kandidátskych cieľov YQHG pri liečbe CKD bolo identifikovaných 10 najlepších biologických procesov. Zamerali sa na dve oblasti: (1) Regulácia bunkového cyklu a apoptózy (proliferácia epitelových buniek, regulácia apoptickej signálnej dráhy, negatívna regulácia apoptickej signálnej dráhy). (2) Regulácia metabolického procesu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) (reakcia na oxidačný stres, metabolický proces reaktívnych foriem kyslíka, reakcia na hladiny kyslíka, bunková odpoveď na oxidačný stres, reakcia na reaktívne formy kyslíka, regulácia metabolického procesu reaktívnych foriem kyslíka, pozitívna regulácia metabolického procesu reaktívnych foriem kyslíka). Aby sme ďalej objasnili potenciálne mechanizmy YQHG proti CKD, skrínovali sme 40 najlepších KEGG dráh pomocou clusterProfiler (obrázok 4B). Výsledky ukázali, že 8 dôležitých signálnych dráh (p53, Toll-like receptor, VEGF, T bunkový receptor,

Molekulárne dokovanie základných aktívnych zlúčenín a proteínov

Na ďalšie overenie presnosti sieťovej farmakológie sa väzbová afinita medzi kľúčovými aktívnymi zlúčeninami a hubovými proteínmi analyzovala metódou molekulárneho dokovania založenou na softvéri Autodock Vina. Väzbová afinita šiestich aktívnych zlúčenín (Quercetin, Kaempferol, Luteolin, 7-O-metylizomukronulatol, Wogonin, Stigmasterol) k hubovým proteínom (TP53, AKT1, RELA, IL6, MAPK1, ESR1) bola menej ako -5 kcal/mol, čo naznačuje, že mali dobrú väzbovú aktivitu. Podrobnosti o väzbovej afinite sú uvedené v tabuľke 4. Vodíková väzba hrá rozhodujúcu úlohu pri stabilizácii väzbových interakcií zlúčenina-proteín. Preto je zaistená priaznivá väzbová vzdialenosť medzi atómami H-donora a H-akceptora menšia ako 3,5 Á [24]. Kvercetín, Kaempferol a Luteolín boli najlepšie vo väzbovom režime so šiestimi proteínmi v tejto štúdii. Okrem toho bol zavedený prístup UHPLC-MS na odhalenie stability YQHG (obrázok S2A a B) a kvantifikáciu kľúčových aktívnych zlúčenín (kvercetín, kaempferol a luteolín) v extrakte (tabuľka S3 a obrázok S2C a D). Výsledky dokovania zlúčeniny a proteínu s najlepšou konformáciou sú znázornené na obrázku 5.

YQHG zlepšila funkciu obličiek a fibrózu u 5/6 nefrektomizovaných potkanov

Uskutočnilo sa komplexné hodnotenie vzhľadu obličiek (farba, kapsula, okraj), súvisiacich parametrov (Scr, BUN, močový proteín, oblasť glomerulárnej fibrózy, oblasť tubulointersticiálnej fibrózy) a patológia tkaniva obličiek (H&E, Masson) s cieľom preskúmať potenciálnu terapeutickú hodnotu YQHG na CKD. Na tento účel sa stanovil model 5/6 nefrektómie a režim dávkovania YQHG (obrázok 6A). Ako sa očakávalo, modelová skupina vykazovala stratu hmotnosti, bledé obličky, nerovnomerné okraje a ťažko odlupovateľné kapsuly. Je pozoruhodné, že liečba YQHG spôsobom závislým od dávky bránila progresii ochorenia, čo sa ukázalo zvýšenou telesnou hmotnosťou potkanov, obnovením červenohnedých obličiek, integritou okrajov a hladkosťou kapsúl (obrázok 6B a C). Scr, BUN a močový proteín sú kľúčovými markermi indikujúcimi dysfunkciu obličiek. Naše výsledky ukázali, že v porovnaní s modelovou skupinou YQHG významne znížilo hladiny troch parametrov v závislosti od dávky (obrázok 6D–F). Histopatologická analýza jasne ukázala infiltráciu zápalu, mezangiálnu expanziu, tubulárnu atrofiu a dilatáciu, glomerulárnu sklerózu a intersticiálnu fibrózu u 5/6 potkanov s nefrektómiou, pričom všetky sa dramaticky zlepšili liečbou YQHG (obrázok 6G). Okrem toho sa po liečbe YQHG skúmali histopatologické indikátory vrátane oblasti glomerulárnej fibrózy a oblasti tubulointersticiálnej fibrózy. Tu sme zistili, že liečba YQHG významne znížila oblasť glomerulárnej fibrózy (obrázok 6H). Okrem toho liečba HD YQHG významne znížila oblasť tubulointersticiálnej fibrózy (obrázok 6I). Celkovo tieto údaje naznačujú, že YQHG mal hlboký ochranný účinok na 5/6 nefrektomizovaných potkanov, ktorý sa vyznačoval zmiernením poškodenia tkaniva, zlepšením funkcie obličiek a znížením fibrózy obličiek.

YQHG pretvorená črevná mikroflóra znížením pomeru Firmicutes/Bacteroidota u 5/6 nefrektomizovaných potkanov

Byliny TČM úzko spolupracujú s črevnou mikroflórou a ovplyvňujú ich zloženie.30 Naopak, črevná mikroflóra zohráva dôležitú úlohu aj pri premene sacharidov, bielkovín, lipidov a malých nevýživových chemikálií z bylín TČM na chemické metabolity, ktoré môžu mať prospešné, resp. nepriaznivé účinky na ľudské zdravie.31 Vzhľadom na to, že homeostáza črevnej mikrobioty hrá dôležitú úlohu v účinnosti bylín TČM,32–34 sme potom skúmali účinky YQHG na črevnú mikroflóru u 5/6 nefrektomizovaných potkanov. Analyzovali sme črevnú mikroflóru na dvoch rôznych taxonomických úrovniach (kmeň a rod). PCoA odhalilo, že črevné mikrobiálne zloženie skupín YQHG bolo blízke zloženiu falošnej skupiny a odlišné od zloženia modelovej skupiny (obrázky 7A a F). Analýza komunity na úrovni kmeňa ukázala, že v porovnaní s falošnou skupinou a skupinami YQHG (obrázok 7B) sa črevné mikrobiálne zloženie modelovej skupiny zmenilo u určitých baktérií, ako sú Firmicutes a Bacteroidota. Konkrétne liečba LD YQHG významne znížila početnosť Firmicutes (obrázok 7C) a zvýšila početnosť Bacteroidota (obrázok 7D). Dôležité je, že pomer týchto dvoch baktérií bol významne znížený liečbou YQHG spôsobom závislým od dávky (obrázok 7E). Okrem toho sa črevná mikroflóra na úrovni rodu preformovala v skupinách YQHG, čo ukázal komunitný barplot a Circos graf (obrázok 7G a H). Celkovo tieto výsledky ukázali, že liečba YQHG účinne obnovila zloženie črevnej mikroflóry a znížila pomer Firmicutes/Bacteroidota (F/B), čím podporila normalizáciu črevného mikrobiálneho ekosystému s cieľom uplatniť liečivý účinok bylín TCM.

YQHG reguloval expresiu PTGS2, P53 a IL-6 u 5/6 nefrektomizovaných potkanov

Sieť H-CT, analýza obohatenia dráhy KEGG a molekulárne dokovanie predpovedali, že tri kľúčové proteínové ciele (PTGS2, p53, IL6) boli zapojené do YQHG proti CKD. Preto sa po liečbe YQHG skúmali expresie PTGS2 a p53. Tu sme zistili, že liečba HD YQHG významne znížila expresiu PTGS2 v tkanive obličiek (obrázok 8A a B). Okrem toho by HD YQHG mohol do určitej miery regulovať expresiu p53 (obrázok 8A a C). Ďalej sme hodnotili inhibičný účinok YQHG na expresiu IL6. Po liečbe YQHG sa expresia IL6 významne znížila v tkanive obličiek (obrázok 8D).

Obrázok 5 Spôsob väzby proteínu so zlúčeninou. (A) Spôsob väzby proteínu ESR1 s luteolínom. (B) Spôsob väzby proteínu MAPK1 s kvercetínom. (C) Spôsob väzby proteínu TP53 s luteolínom. (D) Spôsob väzby proteínu AKT1 s Kaempferolom. (E) Spôsob väzby proteínu RELA s kvercetínom. (F) Spôsob väzby proteínu IL6 s kvercetínom. Každý obrázok zobrazuje tri oblasti: (I) 3D štruktúra komplexu. (II) Povrch aktívneho miesta. (III) Režim viazania detailov komplexu. Chrbtica proteínu je vykreslená v skúmavke a zafarbená na zeleno. Zlúčenina je vykreslená žltou farbou. Žltá pomlčka predstavuje vzdialenosť vodíkovej väzby alebo π-skladanie

Obrázok 6 YQHG zlepšuje funkciu obličiek a fibrózu u 5/6 nefrektomizovaných potkanov. (A) Konštrukcia modelu 5/6 nefrektómie a harmonogramu dávkovania YQHG. (B) Obličky potkanov boli odfotografované (n=6). (C) Zmerala sa telesná hmotnosť potkanov (n=6). (D–F) Účinky liečby YQHG na hladiny Scr, BUN a močového proteínu u 5/6 nefrektomizovaných potkanov (n =6). (G) Reprezentatívne snímky H&E (4{{20}}× zväčšenie, mierka 20μm) farbenie a Massonovo (40× zväčšenie, mierka 20μm) farbenie tkanív obličiek (n =6). (H–I) Kvantitatívna analýza oblasti glomerulárnej fibrózy a oblasti tubulointersticiálnej fibrózy na základe farbenia podľa Massona (n=6). Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Pre normálne rozložené údaje (telesná hmotnosť, Scr, močový proteín, oblasť glomerulárnej fibrózy, oblasť tubulointersticiálnej fibrózy) sa použila jednosmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho testom. Pre nenormálne distribuované údaje (BUN) bol použitý Kruskal-Wallisov test, po ktorom nasledoval neparametrický Wilcoxonov rank-sum test. **P < 0,01 oproti simulovanej skupine; # P < 0,05, ##P < 0,01 oproti skupine modelov.

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK