Zerumbone, tropický zázvorový seskviterpén Zingiber Officinale Roscoe, zmierňuje melanogenézu indukovanú MSH v bunkách B16F10, časť 1

Abstrakt:Ukázalo sa, že Zerumbone (ZER), aktívna zložka čeľade Zingiberaceae, vykazuje niekoľko biologických aktivít, ako sú protizápalové, antialergické, antimikrobiálne a protirakovinové účinky; nebol však skúmaný z hľadiska antimelanogénnych vlastností. V tejto štúdii demonštrujeme, že ZER a Zingiber sú oficiálne (ZO) extrakty, ktoré významne zmierňujú akumuláciu melanínu v myších melanogénnych B16F10 bunkách stimulovaných hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH). Ďalej, aby sme objasnili molekulárny mechanizmus, ktorým ZER potláča akumuláciu melanínu, analyzovali sme expresiu transkripčného faktora spojeného s melanogenézou, transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF) a jeho cieľových génov, ako je tyrozináza, proteín 1 súvisiaci s tyrozinázou ( TYRP1) a proteín 2 súvisiaci s tyrozinázou (TYRP2) v bunkách B16F10, ktoré sú stimulované -MSH. Tu sme zistili, že ZER inhibuje MITF-sprostredkovanú expresiu melanogénnych génov po stimulácii -MSH. Okrem toho bunky ošetrené rôznymi koncentráciami zerumbone a ZO vykazovali zvýšenú fosforyláciu kináz 1 a 2 (ERK1/2) regulovaných extracelulárnym signálom, ktoré sa podieľajú na mechanizme degradácie MITF. Farmakologická inhibícia ERK1/2 pomocou U0126 dostatočne zvrátila anti-melanogénny účinok ZER, čo naznačuje, že pre jeho antimelanogénnu aktivitu je potrebná zvýšená fosforylácia ERK1/2. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že extrakty ZER a ZO môžu byť použité ako aktívne zložky v kozmetike na bielenie pokožky kvôli ich antimelanogénnemu účinku.

Podľa relevantných štúdií je cistanche bežná bylina, ktorá je známa ako „zázračná bylina, ktorá predlžuje život“. Jeho hlavnou zložkou jecistanozid, ktorý má rôzne účinky ako naprantioxidant,protizápalovéa podpora imunitnej funkcie. Mechanizmus medzicistancheabielenie kožespočíva v antioxidačnom účinku cistancheglykozidy. Melanín v ľudskej koži je produkovaný oxidáciou tyrozínu katalyzovanou otyrozinázaa oxidačná reakcia si vyžaduje účasť kyslíka, takže bezkyslíkaté radikály v tele sa stávajú dôležitým faktorom ovplyvňujúcim produkciu melanínu. Cistanche obsahuje cistanozid, ktorý je antioxidantom a môže tak znížiť tvorbu voľných radikálov v teleinhibícia produkcie melanínu.

Kliknite na Ako používať Cistanche

Ďalšie informácie:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Kľúčové slová:zerumbone; Zingiber official Roscoe; melanogenéza; MITF; ERK1/2

1. Úvod

Melanogenéza, produkcia melanínu epidermálnymi melanocytmi, je stimulovaná hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH), ktorý sa vylučuje z keratinocytov po vystavení ultrafialovému (UV) žiareniu [1,2]. Faktor kmeňových buniek (SCF) je ďalším melanogénnym faktorom, ktorý prísne kontroluje migráciu, proliferáciu a diferenciáciu melanocytov na udržanie postnatálnej kožnej melanogenézy [3]. Transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou (MITF), ktorý je melanogénnym transkripčným faktorom, sa aktivuje prostredníctvom signálnej dráhy cAMP-PKA-CREB (cyklická adenozínmonofosfát-proteínkináza A-cAMP väzbový proteín odpovede elementu) po stimulácii -MSH prostredníctvom receptora melanokortínu 1 (MC1R) v cytoplazmatických membránach epidermálnych melanocytov [4]. O niekoľkých chemikáliách, ako je forskolín a IBMX (3-izobutyl-1-metylxantín), je známe, že aktivujú signálnu dráhu cAMP-PKA-CREB, čo vedie k indukcii melanogenézy [5]. Niekoľko štúdií odhalilo, že trvalá aktivácia extracelulárne regulovaných kináz 1 a 2 (ERK1/2), ktorá sa podieľa na molekulárnom mechanizme onkogenézy, podporuje fosforyláciu MITF na Ser73 a jeho následnú degradáciu prostredníctvom proteolýzy závislej od ubikvitínu [6,7 ]. V skutočnosti sa uvádza, že U0126, selektívny inhibítor ERK1/2 dráhy, zvyšuje expresiu MITF a aktivitu tyrozinázy, čo vedie k produkcii melanínu [6]. Stabilizovaný a aktivovaný MITF zvyšuje expresiu melanogénnych génov, ako je tyrozináza, proteín príbuzný tyrozináze 1 (TYRP1) a proteín príbuzný tyrozináze 2 (TYRP2). Transformácia tyrozínu na 3,4-dihydroxyfenylalanín (L-DOPA), ktorá je počiatočným krokom melanogenézy, je katalyzovaná tyrozinázou. Proteíny súvisiace s tyrozinázou (TRP) katalyzujú ďalšie oxidačné a tautomerizačné reakcie [8]. Po syntéze melanínu je zrelý melanín transportovaný z epidermálnych melanocytov do cytoplazmy bazálnych keratinocytov na ochranu buniek pred UV žiarením [2].

Abnormálne zvýšená melanogenéza spôsobuje viaceré typy kožných porúch, ako je rakovina kože, chloazma a pehy [4]; teda malé molekuly alebo prírodné produkty, ktoré sa zameriavajú buď na katalytickú aktivitu tyrozinázy, alebo na regulátory signálnych dráh v melanogenéze, vrátane ERK1/2, alebo transkripcie melanogénnych génov sprostredkovanej MITF, boli identifikované ako aktívne zložky, ktoré sa majú využiť v kozmetických prípravkoch. priemyslu. Niekoľko malých molekúl, ako je kyselina kojová, arbutín a niacínamid, sa široko používa ako kozmetické prísady kvôli ich antimelanogénnym aktivitám. Správy však ukázali, že kyselina kojová spôsobuje viaceré vedľajšie účinky, vrátane cytotoxicity, dermatitídy, rakoviny kože a hepatocelulárneho karcinómu, kvôli svojej genotoxickej aktivite [9]. Hoci sa arbutín, ktorý bol izolovaný z rastliny medvedice lekárskej, používal na liečbu hyperpigmentačnej poruchy, v poslednej dobe je jeho použitie ako kozmetickej zložky obmedzené pre niekoľko vedľajších účinkov [9]. Bolo publikované, že niacínamid má antimelanogénnu aktivitu a táto aktivita sa uskutočňuje inhibíciou prenosu melanozómov z melanocytov do okolitých keratinocytov [10]. Preto sa všeobecne používa ako zlúčenina na bielenie pokožky v kozmetickom priemysle. Na prekonanie obmedzení zavedených činidiel na bielenie pokožky, ktoré majú niekoľko vedľajších účinkov, je dôležité vyvinúť bezpečné prísady na bielenie pokožky získané z prírodných zdrojov. Napríklad -thujaplicín, linderanolid B, 4-butylrezorcinol a plumbagin boli identifikované ako antimelanogénne zlúčeniny kvôli ich inhibičným účinkom na tyrozinázu [4,11]. Nobiletín, withaferín A, sezamol a chaetocín vykazujú antimelanogénne vlastnosti moduláciou signálnych medziproduktov v dráhe melanogenézy [11].

Zerumbone (ZER) je prírodný produkt, ktorý je izolovaný z prchavých esenciálnych olejov rastlín patriacich do čeľade Zingiberaceae, ako sú Zingiber zerumbet Smith a Zingiber officinal Roscoe [12]. Niekoľko štúdií ukázalo, že ZER má široké spektrum biologických aktivít, vrátane antimikrobiálnych, antioxidačných, antidiabetických, protirakovinových, protizápalových, antialergických a antiangiogénnych aktivít [12]. Je zaujímavé, že sa ukázalo, že ZER má ochranný účinok proti oxidačnému poškodeniu kožných keratinocytov vyvolanému ultrafialovým žiarením A (UVA) vďaka svojej schopnosti zachytávať reaktívne formy kyslíka (ROS) prostredníctvom aktivácie jadrového faktora E{{8} }súvisiaci faktor-2 (Nrf2) [1,13]. To naznačuje, že ZER možno použiť ako funkčnú prísadu do kozmetických prípravkov na starostlivosť o pleť. Podrobný mechanizmus antimelanogénnych vlastností účinku ZER je však potrebné ešte študovať.

V tejto štúdii sa študovali inhibičné účinky extraktu ZER a Zingiber officinal (ZO) na melanogenézu stimulovanú -MSH a ich základné mechanizmy. Tu ukazujeme, že ZER významne potláča melanogenézu indukovanú -MSH zvýšením regulácie fosforylácie ERK1/2 a inhibíciou expresie melanogénnych génov sprostredkovanej MITF.

2. Výsledky

2.1. Zerumbone (ZER) potláča melanogenézu indukovanú MSH v bunkách myšacieho melanómu B16F10

Na štúdium antimelanogénneho účinku zerumbone (ZER) sme pôvodne hodnotili jeho cytotoxicitu v bunkách B16F10 aj HaCaT. Chemická štruktúra ZER je znázornená na obrázku 1A. Pozorovalo sa, že ZER pri koncentráciách nad 20 uM vykazoval silný cytotoxický účinok, zatiaľ čo pri koncentráciách pod 20 uM ZER nevykazoval cytotoxicitu v oboch bunkových líniách (obrázok 1B). Ďalej sme skúmali inhibičné účinky ZER na akumuláciu a sekréciu melanínu v bunkách B16F10 indukovanú hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH). Ukázalo sa, že ZER silne potláča intracelulárnu akumuláciu melanínu indukovanú MSH a jeho sekréciu do kultivačného média (obrázok 1C, D). Okrem toho sme zistili, že ZER zmierňuje melanogenézu efektívnejšie ako 1 mM arbutín alebo 0, 2 mM kyselina kojová, dobre známe aktívne zložky kozmetických prípravkov na bielenie pokožky (obrázok 1D). Na objasnenie, či ZER postačuje na potlačenie melanogenézy v ľudských bunkách, sme použili bunky ľudského melanómu G361 produkujúce melanín. Ako je znázornené na obrázku 1E, ZER významne znižuje extra- a intracelulárny obsah melanínu indukovaný faktorom kmeňových buniek (SCF). Tieto výsledky potvrdzujú anti-melanogénnu aktivitu ZER v melanogénnych myších B16F10 a ľudských G361 bunkách.

2.2. Zerumbone potláča génovú expresiu melanogenézneho transkripčného faktora, MITF a jeho cieľových génov v bunkách ľudského melanómu G361 

Uvádza sa, že endotelín{0}} a signalizácia SCF zohrávajú zásadnú úlohu v melanogenéze v ľudských melanocytoch a niekoľkých podtypoch melanómu [3,14–16]. V tejto štúdii sme zistili, že ZER potláča melanogenézu po melanogénnych stimuloch, -MSH a SCF, v myších B16F10 a ľudských melanómových bunkách G361 (obrázok 1).

Merali sme teda zmeny v hladinách expresie génov a proteínov súvisiacich s melanogenézou po stimulácii SCF v bunkách ľudského melanómu G361. Zistili sme, že ZER zmierňuje expresiu MITF a tyrozinázového proteínu indukovanú SCF 2–4 hodiny a 24–48 hodín po stimulácii SCF (obrázok 2A). Okrem toho bola v bunkách G361 ošetrených ZER potlačená génová expresia génov súvisiacich s melanogenézou, ako je MITF, tyrozináza a proteín 1 súvisiaci s tyrozinázou (TYRP1) (obrázok 2B, C). Tieto výsledky odhalili maximálny čas pre expresiu génov súvisiacich s melanogenézou po stimulácii SCF; maximálna indukcia mRNA MITF sa pozorovala do 1–2 hodín a pozorovalo sa, že hladiny mRNA tyrozinázy a TYRP1 dosiahli svoje maximum 24–48 hodín po stimulácii SCF.

2.3. Zerumbone potláča expresiu melanogénnych génov a enzýmov v myších bunkách B16F10

Aby sme preskúmali molekulárny mechanizmus, ktorým ZER potláča melanogenézu, merali sme génovú expresiu transkripčného faktora melanogenézy, MITF, a jeho cieľových génov, ako je proteín 1 súvisiaci s tyrozinázou (TYRP1), tyrozináza a proteín 2 súvisiaci s tyrozinázou (TYRP2) v neprítomnosti alebo prítomnosti ZER. Keďže maximálny čas expresie génov súvisiacich s melanogenézou po stimulácii SCF a -MSH je známy pre ľudské bunky melanómu G361 (obrázok 2) a myšie B16F10 [4], ďalej sme merali expresiu MITF, tyrozinázy, TYRP1 a TYRP2. v ZER ošetrených myších melanómových bunkách B16F10 po 2 hodinách alebo 48 hodinách inkubácie s -MSH. Obrázok 3A ukazuje, že ZER je dostatočný na zoslabenie expresie MITF, TYRP1, TYRP2 a tyrozinázy indukovanej MSH v bunkách B16F10. Podobne sa hladiny expresie MITF, tyrozinázy a proteínu TYRP2 znížili po liečbe ZER. Fosforylácia CREB sprostredkovaná proteínkinázou A (PKA) je hlavnou signálnou dráhou zvyšujúcou MITF na transkripčnej úrovni po stimulácii -MSH [4]. Tu sme teda analyzovali, či znížená fosforylácia CREB pomocou ZER môže sprostredkovať potlačenie MITF. Zistili sme, že fosforylácia CREB indukovaná -MSH nebola ovplyvnená liečbou ZER, čo naznačuje, že ZER potláča expresiu MITF indukovanú -MSH nezávisle od osi signálnej dráhy PKA-CREB (obrázok 3B). Pretože tyrozináza je enzým obmedzujúci rýchlosť, ktorý reguluje syntézu melanínu [2,4,11], ďalej sme analyzovali hladiny intracelulárneho proteínu tyrozinázy a jej enzymatickú aktivitu po liečbe arbutínom, kyselinou kojovou a ZER. Obrázok 3C ukazuje, že ZER dostatočne znižuje hladiny tyrozinázového proteínu indukovaného MSH v bunkách B16F10. Okrem toho obrázok 3D ukazuje, že 10 uM ZER účinnejšie potláča oxidáciu L-DOPA ako inhibítory tyrozinázy, arbutín a kyselina kojová, čo naznačuje, že oxidácia L-DOPA na dopachinón prostredníctvom enzymatickej aktivity tyrozinázy je potlačená v bunkách ošetrených ZER . Tieto výsledky ukazujú, že ZER zoslabuje melanogenézu sprostredkovanú MSH potlačením génovej expresie MITF, transkripčného faktora spojeného s melanogenézou, a jeho cieľových génov.

2.4. Anti-melanogénny účinok Zerumbone je prostredníctvom fosforylácie ERK1/2

Je známe, že aktivácia proteínkinázy B (AKT) a kináz regulovaných extracelulárnym signálom (ERK1/2) rastovými faktormi alebo melanogénnymi stimulmi potláča melanogenézu prostredníctvom zníženej expresie MITF a jeho cieľových génov [11]. Fosforylácia MITF na Ser73 a Ser409 ako odpoveď na signálnu dráhu ERK1/2 podporuje jeho degradáciu závislú od proteazómu [17,18]. Preto sme skúmali, či ZER reguluje fosforyláciu ERK1/2 v B16F10 myších a G361 ľudských melanómových bunkách. Zvýšená fosforylácia ERK1/2 (p-ERK1/2), ale nie celková ERK1/2 (T-ERK1/2), bola pozorovaná po liečbe ZER spôsobom závislým od času a dávky (obrázok 4A, B). Je zaujímavé, že sa pozorovalo, že fosforylácia ERK1/2 sa rýchlo zvýšila v priebehu 10–30 minút a 1–2 hodín po liečbe ZER u myších buniek B16F10 a ľudských melanómových buniek G361 (obrázok 4A). Fosforylácia AKT a MEK sa však pri liečbe ZER nepozorovala, čo naznačuje, že fosforylácia ERK1/2 indukovaná ZER môže potlačiť MITF (obrázok 4B). Pretože fosforylácia ERK1/2 podporuje fosforyláciu a proteazomálnu degradáciu MITF [17,18], skúmali sme, či inhibítor proteazómu zabraňuje redukcii MITF pomocou ZER. Potlačenie MITF pomocou ZER nebolo pozorované v prítomnosti MG132, čo potvrdzuje, že ZER znižuje expresiu MITF prostredníctvom proteazomálnej degradácie (obrázok 4C). Ďalej sme skúmali, či ZER fosforyluje MITF na Ser73, čo je cieľový zvyšok ERK1/2. Na detekciu fosforylovaného MITF boli bunky vystavené pôsobeniu -MSH a MG132. Tu sme zistili, že fosforylovaný MITF (Ser73) bol významne zvýšený pomocou ZER v prítomnosti -MSH a MG132 (obrázok 4D). U0126, selektívny inhibítor mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) [19], zrušil ZER-indukovanú fosforyláciu MITF (obrázok 4D). Navyše celkové hladiny proteínu MITF v lyzátoch celých buniek (WCL) neboli zmenené pomocou ZER a U0126 v prítomnosti MG132 (obrázok 4D). Tieto výsledky naznačujú, že fosforylácia MITF (Ser73) a proteazomálna degradácia sprostredkovaná ERK1/2- je kritickým mechanizmom pri potlačovaní MITF sprostredkovanom ZER. Okrem toho obrázok 4E ukazuje, že U0126 významne obnovil znížené hladiny proteínu MITF v bunkách ošetrených ZER. V súlade s tým bol znížený obsah intracelulárneho melanínu pomocou ZER obnovený pomocou U0126 na približne 40 percent (obrázok 4F), čo naznačuje, že aktivácia ERK1/2 je potrebná pre antimelanogénny účinok ZER.

2.5. Anti-melanogénny účinok extraktov Zingiber Offificinale (ZO).

ZER je fytochemikália odvodená z niekoľkých rastlinných druhov čeľade Zingiberaceae, ako sú Zingiber zerumbet a Zingiber officinal [12]. Pôvodne sme teda merali životaschopnosť buniek v neprítomnosti alebo prítomnosti extraktu ZO v bunkách B16F10 a HaCaT. Obrázok 5A ukazuje, že životaschopnosť buniek nebola ovplyvnená ZO extraktom. Ďalej sme analyzovali antimelanogénne účinky extraktu Zingiber officinal (ZO). Pretože expresia MITF a jeho cieľových melanogénnych génov bola znížená pomocou ZER prostredníctvom aktivovanej signálnej dráhy ERK1/2 (obrázky 2 a 3), skontrolovali sme, či extrakt ZO potláča -MSH-indukovaný MITF a jeho cieľovú expresiu melanogénnych proteínov v bunkách B16F10. Podobne ako anti-melanogénny účinok ZER, -MSH-indukovaný MITF, tyrozináza a TYRP2 boli významne znížené extraktom ZO spôsobom závislým od dávky (obrázok 5B). Je zaujímavé, že fosforylácia ERK1/2 sa zvýšila aj v bunkách ošetrených extraktom ZO (obrázok 5B). Expresia MITF a jeho cieľových génov, ako je tyrozináza, TYRP1 a TYRP2, bola významne znížená po ošetrení 5 ug/ul ZO extraktom (obrázok 5C). Okrem toho sa extracelulárny aj intracelulárny obsah melanínu významne znížil na približne 40 percent po ošetrení extraktom ZO 5 ug/ul (obrázok 5D). Okrem toho sa v bunkách, ktoré boli ošetrené extraktom ZO, pozorovala znížená aktivita tyrozinázy (obrázok 5E). Tieto výsledky naznačujú, že extrakt Zingiber officinal (ZO) potláča melanogenézu oslabením expresie melanogénneho génu sprostredkovaného MITF.

Viac informácií: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501