Zachovaná dlhá nekódujúca RNA, GAPLINC, moduluje imunitnú odpoveď počas endotoxického šoku

Ak sa chcete dozvedieť viac informácií, kontaktujte prosímdavid.wan@wecistanche.com

Význam

Zápal bol do značnej miery študovaný v kontexte génov kódujúcich proteíny. Nedávne štúdie odhalili IncRNA ako dôležité regulátory imunity. Funkčná charakterizácia týchto génov zostáva aktívnou oblasťou výskumu. V tejto štúdii identifikujeme GAPLINC ako funkčne konzervovanýIncRNAmedzi ľuďmi a myšami. Deplécia GAPLINC vedie k zvýšenej expresii génov imunitnej odpovede, ktoré sú priameNF-kBciele. Prekvapivo sme pozorovali, že Gaplinc knockout myši vykazujú rezistenciu voči LPS-indukovanému endotoxickému šoku a zistili sme, že bazálna expresia zápalových génov zabraňuje tvorbe bodiek na ochranu pred multiorgánovým zlyhaním a smrťou. Tieto zistenia majú dôsledky pri liečbe sepsy, v ktorej nové terapie zamerané na IncRNA môžu prispieť cennými informáciami k pochopeniu zápalu a zlepšeniu výsledkov pacientov.

Kliknutím sem sa dozviete viac o Cistanche

FG 1. identifikácia a charakterizácia špecifických pre makrofágyIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) Analýza RNA-SeqGAPLNCexpresia počas diferenciácie monocytov na makrofágy pre uvedené časové body. Expresia GAPLINC je reprezentovaná ako kópie na bunku (FPKM. (D) Tepelná mapa predstavuje génovú expresiu z vlastného panelu Nanostring, ktorý zobrazuje 10 najlepších rozdielne exprimovaných InciNA porovnávajúcich monocyty s makrofágmi v primárne ľudské bunky a bunky THP-1. Údaje z Nanotringu boli uskutočnené v biologických duplikátoch. (E) Schéma pre granulocytovo-monocytové progenitorové bunky, z ktorej vznikli dve odlišné populácie; 1) MDDC a 2) MDM. Stopa prehliadača genómu UCSC zobrazuje čítania RNA-Seq z monocytov, makrofágov a dendritických buniek naGAPLINClokus. () qPCR analýza RNA purifikovaných z jadrových (bielych) a cytoplazmatických (sivých) frakcií v MDM (G qPCR analýza Russa izolovaného z rôznych polyzómových frakcií MDM systémov (10 až 50 percentný gradient sacharózy, SW41, 40 K ot./min., pre ~ 1,5 h).

Nedávne štúdie identifikovali tisíce dlhých nekódujúcich RNA (ncRNA) v genómoch cicavcov, ktoré regulujú génovú expresiu v rôznych biologických procesoch. Hoci IncRNA boli identifikované v rôznych imunitných bunkách a podieľajú sa na imunitnej odpovedi, biologická funkcia a mechanizmus väčšiny zostávajú nepreskúmané, najmä pri sepse. Tu identifikujeme úlohu hdRNA - prediktívnej dlhej intergénnej nekódujúcej RNA (GAPLINC) pre adenokarcinóm žalúdka - predtým charakterizovanú svojou úlohou pri rakovine, teraz v kontexte vrodenej imunity, makrofágov a endotoxického šoku vyvolaného LPS. Analýza transkriptómu makrofágov od ľudí a myší ukazuje, že GAPLINC je konzervovaná IndRNA, ktorá je vysoko exprimovaná po diferenciácii makrofágov. Po zápalovej aktivácii je GAPLINC rýchlo regulovaný smerom nadol. Makrofágy ochudobnené o GAPLINC vykazujú zvýšenú expresiu zápalových génov na začiatku, zatiaľ čo nadmerná expresia GAPLINC túto odpoveď potláča. V súlade s bunkami ochudobnenými o GAPLINC vykazujú knockoutované myši Gaplinc zvýšené bazálne hladiny zápalových génov a vykazujú rezistenciu vočiindukované LPSendotoxický šok. Mechanicky je prežitie spojené so zvýšenými hladinami jadrového NF-xB u Gaplinc knockout myší, ktoré riadia bazálnu expresiu cieľových génov, ktoré sa typicky aktivujú až po zápalovej stimulácii. Ukazujeme, že táto aktivácia génov imunitnej odozvy pred výzvou LPS vedie k tvorbe krvných zrazenín v oblastiach, ktoré chránia Gaplinc knockout myši pred multiorgánovým zlyhaním a smrťou. Spoločne naše výsledky identifikujú predtým neznámu funkciu GAPLINC ako negatívneho regulátora zápalu. a odhaliť kľúčovú úlohu tejto lncRNA pri modulácii endotoxického šoku.

Obr.2. GAPLINC je negatívny regulátor zápalu a je závislý od signalizácie Nf-sB. Monocyty izolované z ľudských PBMC a diferencované na makrofágy boli transfekované kontrolnou alebo GAPLINC siRNA. (A)RNA-sekvenačná analýzana GAPLINC kd alebo kontrolných siRNA MDM. RNA-Seq sa uskutočnila v biologických duplikátoch. Výsledky sú znázornené v grafe sopky. Výrazne up-regulované gény s násobnou zmenou väčšou alebo rovnou 2 sú orámované červenou farbou. (6) GO-Term analýza významne up-regulovaných génov. (C) Tepelná mapa predstavuje génovú expresiu špičkových génov súvisiacich s imunitou up-regulovaných na GAPLINC kd. Údaje z RNA-Seq sa uskutočnili v biologických duplikátoch. Izoformy (D) GAPLINC v MDM boli stanovené sekvenovaním R2C2 na báze Nanopore. Údaje zo sekvenovania Nanopore sa uskutočnili v biologických duplikátoch (nespracované údaje sú dostupné na SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Tabuľka predstavujúca počty prečítaní a percentá každej izoformy GAPLINC. (F) Obojsmerný vektor exprimujúci GFP-zetocín na jednej strane a GAPLINC na druhej strane. (G a H) qPCR analýza expresie GAPLINC v THP-1 bunkách exprimujúcich ektopický GAPLINC alebo kontrolu prázdneho vektora. Hladiny IL6 boli kvantifikované po stimulácii LPS (200 nl ml) počas 6 hodín; údaje boli spojené z troch nezávislých experimentov.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U qPCR analýza GAPLINC v MDM （n=3）vopred ošetrené DMSO alebo BAY-7082（10 μM）, po ktorej nasledovala LPS stimulácia （200 ngmL） počas 6 hodín, údaje sa spojili z troch nezávislých experimentov. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

sepsa je život ohrozujúce ochorenie spôsobené nadmernou reakciou tela na prítomnosť infekcie, ktorá môže rýchlo viesť k multiorgánovému zlyhaniu a smrti. Imunitný systém je nevyhnutný pri poskytovaní ochrany pred infekciou; nekontrolovaná aktivácia však môže mať pre hostiteľa vážne následky. Podľa Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb má jeden z troch pacientov, ktorí zomierajú v nemocnici, sepsu (1). a napriek tomu stále nerozumieme základným molekulárnym mechanizmom, ktoré vedú k smrteľnému výsledku. Klinické možnosti liečby sepsy sú obmedzené na dodávanie tekutín, antibiotík a podpornej starostlivosti a zostali v podstate nezmenené po celé desaťročia. Hoci včasná diagnostika a rýchla liečba zlepšili výsledky sepsy (2), existuje kritická potreba vyvinúť nové terapie. Hoci sa uskutočnili štúdie génovej expresie na preskúmanie potenciálnych terapeutických cieľov pre sepsu, tieto ciele zostávajú do značnej miery necharakterizované (3). Identifikovali sme dlhú nekódujúcu RNA (lncRNA) s úlohami pri kontrole imunitnej odpovede a endotoxického šoku, ktorý poskytuje cesty pre vývoj nových liekov na zacielenie sepsy.

Výsledok

Obr. 3. GAPLINC je konzervovaný u myší a reguluje odpoveď na endotoxický šok. (4) GAPLINC je konzervovaný v synténe. GAPLINC sa nachádza na Chr18 u ľudí a na Chr17 u myší, medzi génmi kódujúcimi proteín Dlgap1 a Gift. Dlgapil nie je vyjadrený vmakrofágy. (B)MCA ukazuje distribúciu hladín Gaplicu v rôznych typoch imunitných buniek (BM). (C) qPCR analýza expresie Gaplinc v B bunkách a BMDM; tieto údaje (priemer ± SD) sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty, (D) qPCR analýza expresie Gaping v BMDME stimulovanej LPS (200 na/ml) počas 6 hodín; tieto údaje (priemer ± SD) reprezentujú tri nezávislé experimenty. (E) Schéma lokusu Gaplinc pred a po delécii sprostredkovanej CRISPRCas9. Prerušované čiary označujú približnú oblasť delécie. Gél predstavuje PCR amplifikáciu genómových dát. Dĺžky amplikónov sa porovnávajú pre myši WT a Gaping KO, (F) qPCR analýza expresie Gaplinc vo WT a Gaplinc-KO BMDM s použitím kombinácie primérov na detekciu Exon1, Exon2 a exón-preklenujúcich oblastí Gaplinc transkriptu; tieto údaje (priemer ± SD) reprezentujú tri nezávislé experimenty. Analýza (G)RNA-Seq v BMDM z myší WT a Gaplinc KO (n =3). Výsledky sú znázornené v grafe sopky. Výrazne upregulované gény s násobnou zmenou väčšou alebo rovnou 2 sú znázornené červenou farbou. (H) GO-Term analýza na výrazne up-regulovaných génoch. (I a J) Údaje o prežití myší WT a Gaplinc KO sú uvedené ako odpoveď na výzvu E. coli LPS (5 mg/kg/myš) (n =6 až 10). Štatistický test rozdielov bol počítaný pomocou log-rank testu (Mantel-Cox). "...P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Keďže expresia lncRNA môže regulovať imunitnú odpoveď ovplyvnením diferenciácie imunitných buniek a ich príslušnej funkcie (4-7), chceli sme preskúmať úlohu ncRNA v makrofágoch. Makrofágy sú dôležité vrodené imunitné bunky, ktoré môžu byť odvodené z monocytov a sú rozhodujúce pre rozpoznávanie patogénov pomocou Toll-like receptorov (TLR). Po aktivácii. TLR iniciujú komplexné signálne dráhy, ktoré aktivujú kľúčové transkripčné faktory, ako je NF-kB, čo vedie k transkripcii stoviek génov imunitnej odpovede (8).

Na identifikáciu IncRNA zapojených do diferenciácie a funkcie makrofágov sme vykonali sekvenovanie RNA (RNA-Seq) v ľudských primárnych makrofágoch odvodených od monocytov (MDM) a monocytárnej bunkovej línii THP-1s (obr. 1A a SI príloha. Obr. S1). Identifikovali sme predikčnú dlhú intergénnu nekódujúcu RNA (GAPLINC) adenokarcinómu žalúdka ako najviac up-regulovanú IncRNA počas diferenciácie monocytov na makrofágy (obr. 1B). Hladiny GAPLINC boli detegovateľné v deň 1 a zvýšili sa na ~ 300 kópií na bunku (obr. 1C). Pomocou technológie profilovania RNA (nCounter, Nanostring) sme potvrdili GAPLINC ako jednu z 10 najlepších mRNA exprimovaných v diferencovaných primárnych MDM a THP{10}} (obr. 1D). Tiež sme potvrdili, že GAPLINC je vysoko exprimovaný v MDM, ale nie je exprimovaný v blízko príbuzných dendritických bunkách odvodených od monocytov (MDDC) (obr. 1E), čo naznačuje, že expresia GAPLINC je špecifická pre bunkový typ. Vykonaním experimentu s bunkovou frakcionáciou a meraním hladín GAPLINC v cytoplazmatických a jadrových kompartmentoch makrofágov pomocou qPCR sme zistili, že GAPLINC je prevažne lokalizovaný v cytosóle v porovnaní s CD14, cytoplazmatickou mRNA a NEAT1, jadrovou IncRNA (obr. 1F). To je v súlade s nálezmi v rakovinových bunkách, v ktorých je GAPLINC lokalizovaný hlavne v cytoplazme (9). Aby sme sa uistili, že GAPLINC je nekódujúci, vykonali sme polyzómové profilovanie, metódu používanú na analýzu toho, či je gén aktívne preložený do proteínu. Na rozdiel od CD14 sa NEATI ani GAPLINC nenašli vo frakcii s vysokým obsahom polyzómov, čo naznačuje, že GAPLINC nie je preložený (obr. 1G),

Obr.4. Gaplnc KO up-reguluje IRG a vykazuje zvýšenú hladinu p65 v nahej na začiatku. (A) Hladiny cytokínov v sére myší WT a Gaplinc KO na bazálnej hodnote.n=4 až 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Ďalej sme skúmali účinok umlčania GAPLINC na diferenciáciu makrofágov. Keď sa hladiny GAPLINC počas diferenciácie zvyšovali, predpokladali sme, že zníženie GAPLINC (KD) ovplyvní gény zapojené do diferenciácie. Pomocou združených malých interferujúcich RNA (siRNA) sme dosiahli ~ 55 až 65 percent kd GAPLINC v primárnych MDM (príloha SI, obr. S2). Uskutočnili sme RNA-Seq a identifikovali sme množstvo génov, ktoré boli dysregulované po GAPLINC kd (obr. 24). Najlepšie zásahy sme potvrdili pomocou Nanostringu (príloha SI, obr. S3). Analýza obohatenia génovej ontológie (GO) ukázala, že gény imunitnej odpovede boli významne nadmerne zastúpené v génoch up-regulovaných po GAPLINC kd a nie v génoch zapojených do diferenciácie makrofágov, na rozdiel od našej pôvodnej hypotézy. (obr. 2B). Rozdielne exprimované gény v bunkách GAPLINC-KD zahŕňajú prozápalové cytokíny a chemokíny (IL6, CXCL10 a TNFSF10), gény stimulované IFN (ISG) (IFIT2 a RSAD2) a proteíny viažuce guanylát (GBP) (GBP3 a GBP5) (Obr. 2C a SI príloha. Obr. S4). Aby sa overilo, že diferenciácia makrofágov nebola ovplyvnená GAPLINC kd. hladiny CD11B.CD16 a CD14 sa merali v kontrolných makrofágoch a makrofágoch ošetrených signalizáciou a zistilo sa, že sú podobné (príloha SI, obr. S5). Ďalej sme použili ďalší prístup kdCRISPRinhibícia (CRISPRi) na zacielenie miesta začiatku transkripcie pomocou GAPLINPoužitím troch rôznych vodiacich RNA (gRNA) v THP-1 bunkách stimulovaných forbol 12-myristát 13-acetátom (PMA). Dosiahli sme viac ako 80 percent kd GAPLINC a opäť pozorujeme zvýšenú expresiu prozápalového cytokínu IL6, keď je GAPLINC znížený na základnej úrovni (príloha SI. Obr. S6 A a B). Je zaujímavé, že po aktivácii lipopolysacharidu (LPS) boli hladiny IL6 podobné v kontrolných bunkách verzus GAPLINC kd THP{7}} (príloha SI, obr. S6C). Pretože sa základné hladiny líšia, celková násobná indukcia IL6 sa zníži, keď sa odstráni GAPLINC. (Príloha S7, Obr. S6D).

Keďže GAPLINC kd viedol k up-regulácii génov imunitnej odpovede, vytvorili sme bunkovú líniu THP-1 nadmerne exprimujúcu GAPLINC, aby sme určili, či sprostredkúva opačný účinok. Použitie dlho čítaných sekvenčných údajov. identifikovali sme dominantné izoformy GAPLINC exprimované v MDM (obr. 2D). Najrozšírenejšia izoforma, ktorá zodpovedá anotácii génu referenčnej sekvencie (RefSeq), bola inkorporovaná do nášho konštruktu (obr. 2E). Použili sme lentivírusový vektor obsahujúci obojsmerný promótor na paralelné riadenie zeleného fluorescenčného proteínu (GFP)/zeocínu a GAPLINC (obr. 2F). Pomocou qPCR sme potvrdili, že GAPLINC bol stabilne exprimovaný v THP-1s v porovnaní s kontrolou (obr. 2G). Nadmerná expresia GAPLINC redukovala IL6 na úrovni RNA v porovnaní s kontrolou po stimulácii LPS, zložkou gramnegatívnych baktérií (obr. 2H). Tieto pozorovania naznačujú, že GAPLINC pôsobí ako negatívny regulátor zápalovej odpovede.

Ďalej sme skúmali hladiny GAPLINC v primárnych MDM v reakcii na zápal. Po stimulácii LPS sme zistili, že GAPLINC bol rýchlo regulovaný smerom nadol (obr. 2I). Okrem toho pomocou qPCR ukazujeme, že GAPLINC je tiež down-regulovaný po aktivácii rôznymi spôsobmiTLRligandy (príloha SI, obr. S7A). Potvrdila sa indukcia pozitívnych kontrolných zápalových génov TNF-a, IL6 a CCL5 (príloha SI, obr. S7B). Tieto údaje naznačujú, že expresia GAPLINC sa musí po stimulácii znížiť, aby nastala optimálna indukcia zápalového génu. Na vyhodnotenie úlohy NF-kB pri kontrole expresie GAPLINC boli MDM vopred ošetrené dimetylsulfoxidom (DMSO) alebo BAY11-7082, inhibítorom NF-B,

nasledovala stimulácia LPS počas 6 hodín. U MDM liečených BAY11-7082- bola down-regulácia GAPLINC znížená v porovnaní s kontrolou (obr. 2/). čo naznačuje, že regulácia GAPLINC je závislá od signalizácie NF-KB. Bola potvrdená indukcia pozitívnych kontrolných zápalových génov TNF- a IL6 po stimulácii LPS (príloha SI, obr. S7C). Aby sme pochopili, ako je GAPLINC regulovaný, použili sme test na chromatín prístupný transpozázou pomocou sekvenovania (ATAC-seq) v MDM. posúdiť dostupnosť chromatínu lokusu GAPLINC. Zistili sme, že GAPLINC je aktívne transkribovaný v pokojových makrofágoch, ale po stimulácii LPS je tesne vypnutý (obr. 2K), čo naznačuje, že GAPLINC je regulovaný na úrovni transkripcie.

Preskúmať zachovanie GAPLINC medzi ľuďmi a myšami. snažili sme sa identifikovať syntenické lokusy, v ktorých sú gény pozične konzervované medzi rovnakými dvoma génmi kódujúcimi proteín. nasleduje posúdenie funkčnej ochrany. Tu ukazujeme, že Gaplinc je pozične konzervovaný a nachádza transkript medzi génmi Dlgap1 a TgifI (obr. 3A). Na potvrdenie špecifickosti bunkového typu sme použili atlas myších buniek (MCA).

(10) na posúdenie hladín transkriptu v imunitných bunkách v kostnej dreni (BM) a zistilo sa, že je najviac exprimovaný v makrofágoch, s nižšími hladinami expresie v progenitoroch neutrofilov (obr. 3B). Ďalej, aby sme určili, či sa expresné vzory zachovali počas diferenciácie makrofágov u ľudí aj u myší, vykonali sme RNA-Seq porovnávajúc BM bunky s makrofágmi odvodenými z kostnej drene (BMDM), dokončili sme zostavenie de novo transkriptov a zistili sme, že hladiny Gaplicu u myší sa po diferenciácii zvýšili. (príloha SI, obr. S8A). Overili sme to pomocou qPCR, porovnaním hladín Gaplinc v bunkách BM s BMDM (obr. 3C). Porovnateľné s ľudským GAPLINC. myši Gaplinc je rýchlo down-regulovaný v LPS-stimulovaných BMDM (obr. 3D). Ako kontrola sme potvrdili indukciu zápalových génov The-a a I6 (príloha SI. Obr. S8B). Myší Gaplinc je tiež rýchlo down-regulovaný po aktivácii rôznymi TLR ligandmi. Potvrdila sa aj indukcia pozitívnych kontrolných génov 116 a Ccl5 (príloha SI, obr. S8C).

Pomocou CRISPR sme vygenerovali Gaplinc knockout (KO) myš, z ktorej bol odstránený exón I a väčšina prvého intrónu (obr. 3E). Chaplin KO myši sa chovali normálne a nevykazovali žiadne zjavné vývojové defekty. Delécia Gapline bola potvrdená PCR amplifikáciou genómovej DNA u myší divokého typu (WT) a myší Gaplinc KO, s veľkosťou amplikónov ~1 300 bp pre WT a ~ 500 bp pre myši Gaplinc KO (obr. 3E), Úplná stratégia genotypovania na potvrdenie WT a Gaplinc KO je zvýraznené v prílohe SI, obr. S9. Deficienciu Gaplicu pri BMDM sme potvrdili aj pomocou qPCR (obr. 3F). Aby sme zhodnotili, či deficit Gaplinc ovplyvnil diferenciáciu, zafarbili sme WT a Gaplinc-KO BMDM pre CD11B a F4/80; vzory farbenia boli podobné, čo naznačuje normálnu diferenciáciu makrofágov (príloha SI, obr. S104). Na posúdenie, či Gaplinc KO narušil funkciu makrofágov, sme porovnali aktivitu fagocytózy u WT a Gaplinc-KO BMDM a nezistili sme žiadne rozdiely (príloha SI, obr. S10B).

Na posúdenie globálneho vplyvu deficitu Gaplinc v makrofágoch sme vykonali RNA-Seq na WT a Gaplinc-KO BMDM; obe boli neošetrené a LPS stimulovaný počas 6 hodín. V Gaplinc-KO BMDM bola expresia 23 génov (znázornených červenou farbou, obr. 3G) na začiatku významne zvýšená. Medzi tieto gény patria prozápalové cytokíny a chemokíny (Il6.l1-a. I1-8 a Cxd10), ISG (Ifitlbl1), členovia rodiny GBP (Gbp5 a Gbp0) a markery bunkového povrchu špecifické pre aktivované makrofágy (Cd69). GO analýza potvrdila, že gény zapojené do imunitnej odpovede sú nadmerne zastúpené v Gaplinc-KO BMDM na začiatku (obr. 3H). Tieto gény sú typicky up-regulované po stimulácii LPS (príloha SI. Obr. S11). Podobne ako údaje získané z našich štúdií na ľuďoch, tieto údaje to naznačujúGAPLINCje funkčne konzervovaný naprieč druhmi, aby v podstate kontroloval expresiu génov zápalovej odozvy (IRG). Medzi WT a Gaplinc-KO BMDM (Dataset S1) nebol žiadny veľký rozdiel v génoch, ktoré boli up-regulované po stimulácii LPS.

Početné štúdie preukázali schopnosť IncRNA regulovať transkripciu susedných génov (11). Ako také sme skúmali potenciálne cis-regulačné úlohy pre Gaplinc, pretože jeho susedný gén, Tgif1, sa už predtým podieľal na modulácii aktivácie makrofágov (12). Pomocou našich údajov RNA-Seq sme potvrdili, že v GaplincKO BMDM nebola expresia Tgifl v porovnaní s T bunkami ovplyvnená (SIAppendir.Fig.S124). Ďalej sme pomocou qPCR potvrdili, že Tgifl bol v Gaplinc-KO BMDMs nezmenený (príloha SI, obr. S12B). Ďalej sme skúmali možnosť, že narušenie lokusu Gaplinc by mohlo odstrániť dôležitý regulačný prvok, ako je zosilňovač. Využili sme údaje ATAC-seq z WT BMDM na posúdenie transkripčne aktívnych oblastí v lokuse Gaplinc (13). Neidentifikovali sme signály v oblasti delécie Gaplinc, iba tie, ktoré zodpovedajú promótoru Gaplinc (príloha SI. Obr. S13). Súhrnne tieto údaje naznačujú, že up-regulácia IRG pri deficite Gaplicu nie je spôsobená účinkami na susedné gény alebo odstránením regulačného prvku.

Keďže Gaplinc KO v BMDM up-reguluje expresiu IRG za bazálnych podmienok, chceli sme ďalej vyzvať zvieratá Gaplinc KO in vivo, aby pozorovali rozdiely v reakcii hostiteľa. Použili sme model "endotoxického šoku". v ktorej bola Escherichia coli LPS intraperitoneálne (ip) injikovaná do myší WT a Gaplinc KO na meranie rozdielov v prežití. V dávke 5 mg/kg/myš. Myši WT vykazovali 0 percentné prežitie po 2 dňoch (obr. 30. Avšak 100 percent myší Gaplinc KO prežilo, čo naznačuje, že myši Gaplinc KO majú rezistenciu voči endotoxickému šoku vyvolanému LPS (obr. 31). sú pozorované významné teplotné rozdiely medzi WT a myšami s deficitom Gaplinc (obr. 3). Dokonca aj pri použití oveľa vyššej dávky LPS 20 mg/kg vykazujú myši s deficitom Gqplinc významnú výhodu v prežití (obr. 3K). tieto údaje ukazujú, že Gaplinc hrá dôležitú úlohu pri regulácii imunitnej odpovede in vivo.

Z našich štúdií na ľuďoch vieme, že GAPLINC môže regulovať imunitné gény na začiatku. Aj keď po zápalovej aktivácii nie je žiadny rozdiel v expresii cytokínov, existuje rozdiel vo veľkosti odpovede, pretože základné hladiny sa líšia. Preto, aby sme lepšie porozumeli týmto rozdielom v prežívaní in vivo, hodnotili sme zmeny v expresii cytokínov na začiatku. Použili sme multiplexné cytokínové pole na súčasné meranie biomarkerov spojených s imunitnou odpoveďou, sepsou a rakovinou. Na začiatku kľúčové imunitné gény vrátane MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. a M-CSF bol významne zvýšený v sére Gqplinc KO myší v porovnaní s WT (obr. 44). Tieto cytokíny sa podieľajú na nábore buniek: pomocou prietokovej cytometrie sme však potvrdili, že percento neutrofilov, T buniek, B buniek, eozinofilov, monocytov a makrofágov bolo porovnateľné medzi WT a Gaplinc KOmice na začiatku (príloha SI, obr. S14). . Je zaujímavé, že tieto percentá boli tiež porovnateľné s po podaní LPS v časových bodoch 6 hodín a 18 hodín (príloha SI, obr. S15 a S16). Okrem toho sérum z myší WT a Gaplinc KO testované na klinické znaky sepsy, vrátane laktátu a C-reaktívneho proteínu (CRP) (príloha S7, obr. S17), nevykazovalo žiadne rozdiely

Keďže zvýšené hladiny MDC alebo IL-13(obr. 44) boli predtým charakterizované tým, že hrajú ochrannú úlohu proti endotoxickému šoku prostredníctvom modulácie prozápalových cytokínov (14, 15), ďalej sme skúmali rozdiely v hladinách prozápalových cytokínov vrátane l6, Il1-, l1- a Cxcl10 po zápalovej aktivácii. Zatiaľ čo hladiny WT a Gaplinc KO sú rovnaké na úrovni transkriptu (obr. 4B) aj proteínu (príloha SI, obr. S18A-C), veľkosť zmeny je oveľa nižšia (obr. 4C), čo naznačuje, že tento znížený násobok zmena môže hrať úlohu pri prevencii citlivosti myší Gaplinc KO na LPS. indukovaný endotoxický šok.

Spolu s nekontrolovateľnou produkciou cytokínov. ďalším klinickým aspektom endotoxického šoku, ktorý môže viesť k úmrtnosti, je tvorba krvných zrazenín v menších cievach, čo vedie k multiorgánovému zlyhaniu (16.17). Aby sme to vyriešili, analyzovali sme sérum myší liečených LPS ip, aby sme vyhodnotili rozdiely v koagulácii. Použitím testu aktivovaného parciálneho tromboplastínového času (a), ktorý meria čas do vytvorenia zrazeniny, sme zistili, že myši WT vykazujú výrazne predĺžený čas v porovnaní s myšami Gaplinc KO po stimulácii LPS (obr. 4D). Predĺžené časy aPTT naznačujú, že myši WT už podstúpili koaguláciu a vyčerpali kľúčové koagulačné faktory, takže v čase testovania, iniciácie zrážania a merania sa čas do tvorby zrazeniny predĺžil. Údaje naznačujú, že rozdiely v prežití po expozícii LPS sú spôsobené tým, že myši WT podstupujú zvýšenú zrážanlivosť, čo vedie k prípadnému zlyhaniu orgánov a smrti.

Ďalej sme sa pokúsili mechanicky pochopiť, ako Gaplinc sprostredkúva tento efekt. Najprv sme potvrdili jeho lokalizáciu a analyzovali hladiny Gaplicu v cytoplazmatických aj jadrových kompartmentoch BMDM pomocou qPCR. Podobne ako ľudský GAPLINC. myš Gaplinc bola prevažne cytoplazmatická (príloha ST, obr. S19). Ďalej sme vykonali modifikovanú komplexnú identifikáciu proteínov viažucich RNA (ChIRP), spojenú s hmotnostnou spektrometriou a malým sekvenovaním RNA, pretože sa už predtým ukázalo, že GAPLINC interaguje s mikro RNA (18). Nepozorovali sme interakcie s predtým identifikovanými cieľmi (SIAppendix, Obr. S20).

Keďže sa nám nepodarilo identifikovať priameho väzbového partnera, zamerali sme sa na konzervovanú funkciu medzi ľuďmi a myšami, konkrétne na konzervované gény ovplyvnené v našich štúdiách ľudského GAPLINC kd a myšieho Gaplinc KO, z ktorých väčšina sú regulátory NF-kB (obr. 4E ). Najrozšírenejšou formou NF-KB aktivovanej LPS je heterodimér p65:p50 a sedem z deviatich konzervovaných génov sú priame ciele p65 (19). Použili sme natívnu imunoprecipitáciu RNA (RIP) a ukázali sme, že neexistuje žiadna priama interakcia medzi Gaplinom a p65 (príloha S7, obr. S21). V klasickej signálnej dráhe NF-kB sú podjednotky p6:p50 umiestnené v cytosóle a naviazané na inhibičný I-kB- v pokojových bunkách. Po aktivácii je I-KB- degradovaný, čo umožňuje p65:p50 translokovať sa do jadra a aktivovať cieľové gény (20). Vo WT a Gaplinc-KO BMDM sme merali degradáciu I-kB- pomocou Western blotu a nezistili sme žiadne rozdiely (obr. 4F). Ďalej sme porovnávali celkové hladiny p65 v BMDM. V našich údajoch RNA-Seg sú hladiny transkriptov p65 (RelA) v bazálnych aj LPS stimulovaných podmienkach pre WT a Gaplinc-KO BMDM porovnateľné (príloha SI, obr. S22). Keď sme však porovnali celkové hladiny proteínu p65 pomocou Western blotu, zistili sme významne zvýšené hladiny p65 v Gaplinc-KObunkách v porovnaní s WT (obr. 4G). To naznačuje, že Gaplinc reguluje celkové hladiny p65 na translačnej úrovni. Okrem toho sme hodnotili hladiny p65 v cytoplazmatických a jadrových kompartmentoch a zistili sme, že jadrový p65 je hojnejší v bunkách s deficitom Gaplinc v porovnaní s WT (obr. 4H). Tieto údaje spolu naznačujú mechanickú úlohu GAPLINC pri aktivácii kritických IRG.

Diskusia

Tu sme identifikovali GAPLINC ako konzervovanú cytosolicky exprimovanú IncRNA u ľudí a myší, ktorá funguje na kontrolu zápalovej génovej expresie prostredníctvom regulácie NF-xB. V porovnaní s publikovanými cytosolickými IncRNA, ktoré ovplyvňujú translačnú účinnosť moduláciou proteínovej expresie alebo zostavenia ribozómov (21-23), sme zistili, že Gapline cytosolicky prispieva k translačnej schopnosti p65; zostáva však určiť mechanizmus interakcie, či už priamej alebo nepriamej. Naše zistenia poskytujú pohľad na to, ako funkčne konzervovaná IncRNA reguluje imunitnú odpoveď a poskytujú možnosti skúmania vývoja terapeutík pre endotoxický šok.