Homozygotný Dab1-// je potenciálnou novou príčinou autozomálnych recesívnych vrodených anomálií myších obličiek a močových ciest
Feb 28, 2022
Úvod
Mutované myši Yotari, získané spontánnou akvizíciou mutácie v géne Dab1, vykazujú histologické abnormality v centrálnom nervovom systéme [1,2], veľmi podobné ako u myší reeler (reelin//), čo naznačuje, že reelin a DAB1 patria k rovnakú signálnu dráhu [1–4]. Uvádza sa, že aberácie v dráhe reelin/DAB1 sú spojené s rôznymi psychiatrickými poruchami [5–7]. Je zaujímavé, že okrem centrálneho nervového systému bola prítomnosť DAB1 a reelínových proteínov potvrdená aj v periférnom nervovom systéme a niektorých extraneurálnych tkanivách. Prítomnosť DAB1 bola zistená v myších podocytoch [8] a ľudskom plodeobličky[9], zatiaľ čo expresia reelínu bola hlásená počas vývoja myšieho a ľudského plodu, ako aj v niektorých endotelových bunkách pozdĺž krvných ciev u dospelých myší [9–11]. Kanonická dráha reelin/DAB1 môže spúšťať odlišné downstream proteíny, vrátane receptorov NOTCH2, ktoré hrajú rozhodujúcu úlohu pri rozhodovaní o osude buniek a diferenciácii počasobličkyrozvoj [12–14]. Receptory NOTCH2 sú potrebné na vytvorenie proximálnych tubulov a podocytov [13], ale po dosiahnutí maturácie nefrónu je táto dráha väčšinou umlčaná [15]. V podmienkach akútochorenia obličiek,zvýšená expresia NOTCH2 môže potenciálne prispievať k regenerácii, zatiaľ čo trvalá expresia je kauzálne spojená s intersticiálnou fibrózou a glomerulosklerózou [15]. Downregulácia signalizácie NOTCH môže výrazne znížiť autofágiu a spôsobiť poruchu diferenciácie podocytov počas vývoja [16].
V dôsledku toho dysfunkčné podocyty zohrávajú kľúčovú úlohu pri glomerulárnom ochorení, najmä pri ľudskom idiopatickom nefrotickom syndróme [17,18] a pri nefrotickom syndróme s minimálnymi zmenami (MCNS) [19]. Autofágia teda udržiava bunkovú homeostázu za normálnych fyziologických podmienok, zatiaľ čo v patologických podmienkach môže prejsť do autofagickej smrti [20]. Široko používaným autofagickým biomarkerom je LC3B, štrukturálny proteín autofagozomálnych membrán [21]. Komplexné presluchy medzi autofágiou a apoptózou tiež prispievajú k udržiavaniu homeostatickej rovnováhy ako odozvy na mikroprostredie bunky. Je dobre známe, že počet apoptotických udalostí sa v priebehu zvyšujeobličkyvývoj [22] a výrazne sa zmenšujú po ukončení dozrievania, s výnimkou podmienokpoškodenie obličiek[23]. Apoptóza je nepopierateľne zložitý mechanizmus regulovaný súhrou niekoľkých dráh, ale väčšinou končí aktiváciou kaspázy3 (CASP3), ktorej aktivácia je jedným z najčastejšie používaných markerov na detekciu apoptózy [23].
V tejto správe sme sa zamerali na analýzu toho, ako ovplyvňuje funkčné umlčanie génu Dab1obličkymorfológia a expresia a lokalizácia reelínu, NOTCH2, LC3B a štiepených proteínov CASP3 u postnatálnych myšíobličky. Predpokladáme, že tieto proteíny sú exprimované v postnatálnej myšioblička,a ich funkčná súhra prispieva k zachovaniu ich štruktúry a funkcie. Okrem toho, keďže prítomnosť DAB1 bola potvrdená počas ľudského ploduobličkyvývoj [9], možno predpokladať, že jeho inaktivácia môže spôsobiť poruchu širokého spektra vrodených anomáliíobličkya močových ciest (CAKUT).
Kľúčové slová:yotari; funkcia obličiek; postnatálny vývoj obličiek; imunofluorescenčné farbenie; transmisná elektrónová mikroskopia
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL
Materiály a metódy
Zbierka vzoriekAko konvenčné mutanty Dab1 null sme použili myši yotari (Dab1 / ), ktoré predtým opísali Howell et al. [24]. PCR priméry použité na genotypizáciu myší boli yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT a CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, divoký typ lokusu Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT a CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Myši C57BL/6 N boli chované a umiestnené v skupinách v štandardných polykarbonátových klietkach (vrátane aspoň jedného z každého genotypu) s ad libitným prístupom k potrave a vode v miestnosti s kontrolovanou teplotou (23 ± 2 ◦C) s 12 hodinovým svetlom/ temný cyklus. V postnatálnych dňoch 4, 11 a 14 (P4, P11 a P14) boli myši hlboko anestetizované pentobarbitalom a transkardiálne perfundované počas 10 minúty fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS, pH 7,2) a 4% paraformaldehydom (PFA ) v 0,1 M PBS.Obličkyboli odstránené a fixované 4 percentami PFA v 0.1 M PBS cez noc na konvenčné histologické analýzy (hematoxylín-eozín (H&E), imunohistochemické a imunofluorescenčné farbenie) a v zmesi 2 percent PFA plus 2,5 percenta glutaraldehydu (GA) na vyšetrenie elektrónovým mikroskopom. Po fixácii bolo tkanivo pripravené na ďalšie histologické vyšetrenie, ako sme už opísali [25,26].
Imunofluorescencia a farbenie imunoperoxidázouPo deparafinizácii a rehydratácii sa rezy zahrievali 20 min v 0,01 M citrátovom pufri (pH 6,0) vo vodnom parnom hrnci a potom sa ochladili na izbovú teplotu. Blokovací pufor (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) sa aplikoval na 30 minút, aby sa vylúčilo nešpecifické zafarbenie. Rezy sa potom inkubovali cez noc vo vlhkej komore s primárnymi protilátkami (tabuľka 1). Po premytí v PBS sa na jednu hodinu aplikovali sekundárne protilátky (tabuľka 1) a znova sa premyli v PBS. Potom boli jadrá zafarbené 4060 -diamidino-2-fenylindolom (DAPI) počas 2 minút, premyté v PBS a prekryté krycím sklíčkom. Vykonali sme preadsorpčný test tak, že každá primárna protilátka bola použitá so zodpovedajúcim peptidom a aplikovaná ich kombinácia na rezy. Výsledky neukázali žiadne farbenie protilátkou. Okrem toho sa uskutočnili kontroly s vynechaním primárnej protilátky na stanovenie hladín nešpecifickej väzby sekundárnych protilátok.
Na imunoperoxidázové farbenie sa ako primárna protilátka aplikovala králičia polyklonálna anti-CASP3 (1:100 riedenia, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) počas jednej hodiny vo vlhkej komore po ošetrení rezu 0,1 percent H2O2. Po premytí v PBS sa uskutočnila sekundárna detekcia s použitím spojenia a streptavidín peroxidázy, každý počas pätnástich minút (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) a diaminobenzidínu (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), starostlivo kontrolované, aby sa predišlo nadmernému zafarbeniu pozadia. Jadrá boli zafarbené hematoxylínom, opláchnuté vo vode z vodovodu počas 10 minút, krátko dehydratované vo vzostupných sériách etanolových roztokov a prekryté krycím sklíčkom.
Príprava tkaniva pre transmisný elektrónový mikroskop (TEM)Po fixácii zmesou 2 percent PFA a 2,5 percenta GA v 0,1 M PBS počas 2 hodín sa vzorky premyli PBS a následne sa fixovali vo vodnom roztoku 2 percent oxidu osmičelého počas 2 hodín. Všetky vzorky sa dvakrát premyli v PBS, dehydratovali sa v etanole so stúpajúcim stupňom a vložili do Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Sériové rezy (hrúbka 70 nm) boli narezané na ultramikrotóme Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko) a zafarbené 1 percentom uranylacetátu a citrátu olovnatého.
Získavanie a analýza údajovAnalýza sa uskutočnila pomocou epiflfluorescenčného mikroskopu (Olympus BX51, Tokio, Japonsko) vybaveného digitálnym fotoaparátom DP71 (Olympus), transmisným elektrónovým mikroskopom JEM 1400 (JEOL, Tokio, Japonsko) prevádzkovaným pri 80 kV a fotografovaným s nábojom JEOL- kamerový systém so spojeným zariadením (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) a nakoniec mikroskop s jasným fifieldom (BX40, Olympus, Tokio, Japonsko). Všetky analyzované obrázky boli spracované softvérom ImageJ a Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Na skúmanú skupinu sme použili tri až štyri zvieratá. Všetky zhromaždenéobličkyboli narezané na rezy s hrúbkou 5 um a maximálneobličky length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, čo naznačuje vynikajúcu zhodu [27].
Štatistická analýzaNa analýzu rozdielov v priemernom priemere medzi PCT, DCT a G zvierat divokého typu a zvierat yotari sa uskutočnil dvojstranný t-test. Priemer bol prezentovaný ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Úroveň významnosti bola nastavená na p < 0.05.="" na="" preskúmanie="" rozdielov="" v="" percentách="" pozitívnych="" buniek="" medzi="" pct,="" dct="" a="" glomeruľami="" vo="" všetkých="" časových="" bodoch="" sa="" použil="" dvojcestný="" test="" anova,="" po="" ktorom="" nasledoval="" tukeyho="" viacnásobný="" porovnávací="" test.="" percento="" pozitívnych="" buniek="" bolo="" vyjadrené="" ako="" priemer="" ±="" štandardná="" chyba="" priemeru="" (sem).="" hladina="" významnosti="" bola="" stanovená="" na="" p="">< 0,05.="" analýza="" sa="" uskutočnila="" v="" softvéri="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Výsledky
Farbenie hematoxylín-eozín (H&E) a meranie priemeru obličiekH&E farbenie stredných sagitálnych rezovobličkyvo všetkých skúmaných časových bodoch zdôrazňuje malýobličkyfenotyp myší yotari v porovnaní s divokým typom (obrázok 1a). Pri 4P priemerobličkypriemer zvierat yotari bol okolo 55 um ako okolo 75 um. Okrem toho bol tento rozdiel viditeľný v neskorších časových bodoch v dôsledku pomalšieho rastuobličkyv yotari v porovnaní s progresívnym rastomobličkyu zvierat divokého typu. Ak chcete zistiť, či zníženie celkovoobličkyveľkosť bola spôsobená znížením veľkosti segmentu nefrónu, spriemerovali sme priemer PCT, DCT a G na skupinu. V skutočnosti došlo k zníženiu stredného priemeru G, PCT a DCT v skupine s yotari v porovnaní s divokým typom (obrázok 1b, p < 0,05).="" okrem="" toho="" farbenie="" h&e="" odhalilo="" tenšiu="" kôru="">obličkovérozšírenie panvy u zvierat yotari a mierne difúzne rozšírená DCT na 14P. Základná štruktúra a vzorec dozrievania glomerulov sú rovnaké v oboch skúmaných skupinách zvierat.
Opisná histologická analýza založená na mikrofotografiách TEMNa mikrofotografiách získané pomocou TEM, glomeruly myší divokého typu vykazovali typický vzhľad všetkých častí fifiltračnej bariéry, ktoré boli normálne vyvinuté a rozpoznateľné (obrázok 2a). Podocyty, výbežky a pedikly podocytov, fifiltračné štrbiny, glomerulárne bazálne membrány a kapilárny lúmen s fenestrovaným endotelom boli ľahko rozlíšiteľné (obrázok 2a). Na druhej strane v glomerulách myší yotari bolo možné pozorovať progresívne poškodenie podocytov s vymazaním procesu nohy a nedostatkom fifiltračných štrbín (obrázok 2b – d). Tieto ultraštrukturálne zmeny boli pozorované u všetkýchobličkyvyšetroval a zahŕňal väčšinu skúmaných glomerulov. V PCT alebo DCT myší yotari sa nezaznamenali žiadne abnormality ako u zvierat divokého typu (obrázok 2e–h). V PCT boli bunkové rozhrania definované zle kvôli nepravidelnosti bunkových membrán a vzájomnému prepojeniu buniek s ich susedmi. Cytoplazma bola bohatá, obsahovala dobre rozlíšené jadrá, predĺžené mitochondrie, bazálne infoldingy a mnoho tubulárnych jamiek medzi mikroklkami, ktoré tvorili kefový lem na apikálnej membráne. Väčšie zväčšenie odhalilo apikálny povrch PCT epitelových buniek obsahujúcich dlhé mikroklky, ktoré tvoria kefový okraj a tesné spojenia medzi okrajmi luminálnych buniek susedných tubulárnych epitelových buniek (obrázok 2e, f). Na druhej strane apikálny povrch DCT epitelových buniek obsahoval niekoľko krátkych mikroklkov a početné vezikuly (obrázok 2g, h).
Obrázok 2. Mikrofotografie divokého typu a yotari z transmisného elektrónového mikroskopu (TEM).obličky.Glomeruli zvierat divokého typu (a) vykazovali normálne vyvinutú fifiltračnú bariéru s fenestrovaným endotelom (E) kapiláry (C), bazálnej membrány (BM), podocytmi (P) s pediklom (PE) a fifiltračnými štrbinami (FS ). Vobličkyu zvierat yotari bolo možné pozorovať vymazanie pedikúl a nedostatok fifiltračných štrbín (hviezdičky, b–d). Neboli zaznamenané žiadne abnormality v proximálnych stočených tubuloch (PCT) alebo distálnych stočených tubuloch (DCT) myší yotari v porovnaní so zvieratami divokého typu (e–h). V PCT bola cytoplazma bohatá, obsahovala dobre rozlíšené jadrá (N), predĺžené mitochondrie (M), bazálne infoldingy (BI) a mnoho tubulárnych jamiek (TP) medzi mikroklkami, ktoré tvorili kefový lem (BB) na apikálna membrána (e, f). Väčšie zväčšenie odhalilo apikálny povrch PCT epitelových buniek obsahujúcich dlhé mikroklky na vytvorenie kefového okraja a tesných spojení (TJ) medzi okrajmi luminálnych buniek susedných tubulárnych epiteliálnych buniek (e, f). Na druhej strane apikálny povrch DCT epitelových buniek obsahuje niekoľko krátkych mikroklkov a početné vezikuly (g, h). Mierka na obrázkoch (a–d) a vložkách (e–h) je 1 µm; stupnica na obrázkoch (e–h) je 2 µm.
Lokalizácia a kolokalizácia Reelin a DAB1Reelín bol slabo exprimovaný s miernou až strednou reaktivitou (tabuľka 2) v glomerulách a DCT všetkých skúmaných zvierat vo všetkých pozorovaných časových bodoch (p < 0.05,="" obrázok="" 3a).="" iba="" u="" pct="" myší="" yotari="" bolo="" percento="" pozitívnych="" buniek="" významne="" vyššie="" ako="" u="" zvierat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 3a).="" v="" glomerulárnych="" bunkách="" bola="" lokalizácia="" farbenia="" perinukleárna,="" zatiaľ="" čo="" v="" pct="" a="" dct="" bola="" rozptýlená="" po="" celej="" cytoplazme="" (obrázok="" a,="">
obrázok 4. Imunofluorescenčné farbenie postnatálnych yotariobličkys reelínovým markerom (a) a dvojitým imunofluorescenčným farbením postnatálneho divokého typuobličkys DAB1 a reelínovými markermi (b). (a, b) Farbenie DAPI jadrovej DNA sa zlúčilo s DAB1 a paralelne sa zobrazuje reelínová imunofluorescencia (zlúčenie). Pozorované časové body boli P4, P11, P14. Expresia skúmaných markerov v glomerulách (G), proximálnych stočených tubuloch (PCT) a distálnych stočených tubuloch (DCT) je označená šípkami, zatiaľ čo hviezdičky označujú expresiu reelínu v extracelulárnej matrici (a). Vložky zobrazujú najvýraznejší výraz na obrázku. Jadrové farbenie DAPI odhalilo zlú kolokalizáciu DAB1 a reelínu, väčšinou v DCT (hrot šípky). Mierka je 20 µm a vzťahuje sa na všetky obrázky.
V glomeruloch a PCT zvierat divokého typu pri P4 nebola takmer žiadna imunitná reaktivita DAB1, zatiaľ čo percento pozitívnych buniek s miernou reaktivitou (tabuľka 2) sa významne zvýšilo pri P11 a P14 (p < 0,05,="" obrázok="" 3b).="" v="" dct="" sa="" dab1="" exprimoval="" väčšinou="" v="" apikálnych="" a="" laterálnych="" častiach="" bunkových="" membrán="" (obrázok="" 4b)="" so="" silnou="" reaktivitou="" (tabuľka="" 2).="" percento="" pozitívnych="" buniek="" bolo="" výrazne="" vyššie="" ako="" v="" predchádzajúcich="" štruktúrach,="" okolo="" 60="" percent="" (obrázok="" 3b),="" najmä="" v="" macula="" densa="" (obrázok="" 4b).="" nedošlo="" takmer="" k="" žiadnej="" kolokalizácii="" dab1="" a="" reelínu="" okrem="" dct="" zvierat="" divokého="" typu="" v="" p14="" (šípka,="" obrázok="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" obrázok="" 4.="" imunofluorescenčné="" farbenie="" postnatálnych="">obličkys reelínovým markerom (a) a dvojitým imunofluorescenčným farbením postnatálneho divokého typuobličkys DAB1 a reelínovými markermi (b). (a, b) Farbenie DAPI jadrovej DNA sa spojilo s DAB1 a paralelne sa zobrazuje reelínová imunofluorescencia (zlúčenie). Pozorované časové body boli P4, P11, P14. Expresia skúmaných markerov v glomerulách (G), proximálnych stočených tubuloch (PCT) a distálnych stočených tubuloch (DCT) je označená šípkami, zatiaľ čo hviezdičky označujú expresiu reelínu v extracelulárnej matrici (a). Vložky zobrazujú najvýraznejší výraz na obrázku. Jadrové farbenie DAPI odhalilo zlú kolokalizáciu DAB1 a reelínu, väčšinou v DCT (hrot šípky). Mierka je 20 µm a vzťahuje sa na všetky obrázky. V glomeruloch a PCT zvierat divokého typu pri P4 nebola takmer žiadna imunitná reaktivita DAB1, zatiaľ čo percento pozitívnych buniek s miernou reaktivitou (tabuľka 2) sa významne zvýšilo pri P11 a P14 (p < 0,05,="" obrázok="" 3b).="" v="" dct="" sa="" dab1="" exprimoval="" väčšinou="" v="" apikálnych="" a="" laterálnych="" častiach="" bunkových="" membrán="" (obrázok="" 4b)="" so="" silnou="" reaktivitou="" (tabuľka="" 2).="" percento="" pozitívnych="" buniek="" bolo="" výrazne="" vyššie="" ako="" v="" predchádzajúcich="" štruktúrach,="" okolo="" 60="" percent="" (obrázok="" 3b),="" najmä="" v="" macula="" densa="" (obrázok="" 4b).="" nedošlo="" takmer="" k="" žiadnej="" kolokalizácii="" dab1="" a="" reelínu="" okrem="" dct="" zvierat="" divokého="" typu="" na="" p14="" (šípka,="" obrázok="">
Priestorové a časové vzorce expresie NOTCH2 a LC3BPercento NOTCH{{0}}pozitívnych buniek bolo menej ako 20 percentá v glomeruloch oboch zvieracích genotypov vo všetkých pozorovaných časových bodoch. Iba pri P14 bolo percento pozitívnych buniek významne vyššie v glomeruloch zvierat yotari ako zvierat divokého typu (p < 0,05,="" obrázok="" 3c).="" intenzita="" farbenia="" bola="" mierna="" až="" stredná="" (tabuľka="" 2),="" väčšinou="" lokalizovaná="" perinukleárne="" (obrázok="" 5a–f).="" v="" pct="" a="" dct="" oboch="" zvieracích="" genotypov="" sa="" percento="" pozitívnych="" buniek="" časom="" zvýšilo.="" na="" p14="" bolo="" percento="" pozitívnych="" buniek="" významne="" vyššie="" v="" pct="" a="" dct="" zvierat="" yotari="" ako="" pct="" a="" dct="" zvierat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 3c).="" intenzita="" signálu="" vo="" všetkých="" pozorovaných="" časových="" bodoch="" bola="" mierna="" až="" stredná="" (tabuľka="" 2)="" a="" rozptýlená="" po="" celej="" cytoplazme="" (obrázok="" 5a–f).="" obrázok="" 5.="" imunofluorescenčné="" farbenie="" postnatálneho="" divokého="" typu="" a="">obličkys markermi NOTCH2 a LC3B a imunoperoxidázovým farbením markerom štiepenej kaspázy3 (CASP3). (a – f) Farbenie DAPI jadrovej DNA je zlúčené s NOTCH2 a LC3B. Pozorované časové body boli P4, P11, P14. Expresia markerov NOTCH2 a LC3B v glomerulách (G), proximálnych stočených tubuloch (PCT) a distálnych stočených tubuloch (DCT) je označená šípkami. Obzvlášť silnú reaktivitu LC3B možno pozorovať v Bowmanovom puzdre rozkladajúcich sa glomerulov (hviezdička, e). Vložky zobrazujú najvýraznejší výraz na obrázku. CASP3 bol slabo exprimovaný vo všetkých pozorovaných časových bodoch. Jediná významná expresia bola v glomeruloch myší yotari na P14 (šípky). Mierka je 20 µm a vzťahuje sa na všetky obrázky. Biomolekuly 2021, 11, 609 9 z 14 3.4. Priestorové a časové vzorce expresie NOTCH2 a LC3B Percento NOTCH2-pozitívnych buniek bolo menej ako 20 percent v glomerulách oboch zvieracích genotypov vo všetkých pozorovaných časových bodoch. Iba pri P14 bolo percento pozitívnych buniek významne vyššie v glomeruloch zvierat yotari ako zvierat divokého typu (p < 0,05,="" obrázok="" 3c).="" intenzita="" farbenia="" bola="" mierna="" až="" stredná="" (tabuľka="" 2),="" väčšinou="" lokalizovaná="" perinukleárne="" (obrázok="" 5a–f).="" v="" pct="" a="" dct="" oboch="" zvieracích="" genotypov="" sa="" percento="" pozitívnych="" buniek="" časom="" zvýšilo.="" pri="" p14="" bolo="" percento="" pozitívnych="" buniek="" významne="" vyššie="" u="" pct="" a="" dct="" zvierat="" yotari="" ako="" pct="" a="" dct="" zvierat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 3c).="" intenzita="" signálu="" vo="" všetkých="" pozorovaných="" časových="" bodoch="" bola="" mierna="" až="" stredná="" (tabuľka="" 2)="" a="" rozptýlená="" po="" celej="" cytoplazme="" (obrázok="">
Obrázok 5. Imunofluorescenčné farbenie postnatálneho divokého typu a yotariobličkys markermi NOTCH2 a LC3B a imunoperoxidázovým farbením markerom štiepenej kaspázy3 (CASP3). (a – f) Farbenie DAPI jadrovej DNA je zlúčené s NOTCH2 a LC3B. Pozorované časové body boli P4, P11, P14. Expresia markerov NOTCH2 a LC3B v glomerulách (G), proximálnych stočených tubuloch (PCT) a distálnych stočených tubuloch (DCT) je označená šípkami. Obzvlášť silnú reaktivitu LC3B možno pozorovať v Bowmanovom puzdre rozkladajúcich sa glomerulov (hviezdička, e). Vložky zobrazujú najvýraznejší výraz na obrázku. CASP3 bol slabo exprimovaný vo všetkých pozorovaných časových bodoch. Jediná významná expresia bola v glomeruloch myší yotari na P14 (šípky). Mierka je 20 µm a vzťahuje sa na všetky obrázky.
V glomeruloch a DCT oboch zvieracích genotypov sa percento LC3B-pozitívnych buniek časom zvýšilo (p < 0.05,="" obrázok="" 3d).="" pri="" p11="" a="" p14="" bolo="" percento="" pozitívnych="" buniek="" významne="" vyššie="" v="" glomeruloch="" zvierat="" yotari="" ako="" v="" glomeruloch="" zvierat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázok="" 3d).="" v="" glomerulách="" zvierat="" yotari="" bola="" intenzita="" farbenia="" väčšinou="" stredná="" až="" silná="" (tabuľka="" 2)="" lokalizovaná="" v="" perinukleárnom="" a="" jadrovom="" priestore="" (obrázok="" 5a–f),="" vo="" všetkých="" pozorovaných="" časových="" bodoch,="" zatiaľ="" čo="" v="" glomerulách="" myší="" divokého="" typu="" bola="" intenzita="" prevažne="" mierna="" (tabuľka="" 2).="" pct="" zvierat="" yotari="" a="" divokého="" typu="" obsahovalo="" približne="" 20="" percent="" pozitívnych="" buniek="" vo="" všetkých="" pozorovaných="" časových="" bodoch="" (p="">< 0,05,="" obrázok="">
Rozštiepený výraz CASP-3Neexistoval takmer žiadny prejav aktivovaného CASP-3 vobličkyzvierat divokého typu vo všetkých pozorovaných časových bodoch. V PCT a DCT myší yotari bolo niekoľko jednotlivých buniek pozitívnych na CASP-3- (obrázok 3e). Iba v glomerulách obličiek yotari na P14 (obrázok 5e) sa percento pozitívnych buniek výrazne zvýšilo v porovnaní sobličkymyší divokého typu (p < 0,05, obrázok 3e).
Diskusia
Obličkymorfogenéza a vývoj sú zložité procesy presne koordinované prostredníctvom súhry veľkého počtu génov. Vrodené anomálieobličkya močové cesty (CAKUT) sú najčastejšou vrodenou chybou, ktorá tvorí 23 percent všetkých takýchto defektov a predstavuje hlavnú príčinu konečného štádiaobličkové ochorenieu detí [28,29]. Poruchy jedného génu môžu byť primárnym zdrojom CAKUT a doteraz bola ako príčina CAKUT identifikovaná mutácia vo viac ako 20 génoch [30]. Ako naša predchádzajúca práca ukázala veľkú expresiu DAB1 počas normálneho ľudského ploduobličkyvývoj [9] sme predpokladali, že DAB1 môže hrať významnú úlohu počas cicavcovobličkyrozvoj. Aby sme potvrdili našu hypotézu, skúmali smeobličkymorfológia a vzory expresie reelínových, NOTCH2, LC3B a aktivovaných CASP3 proteínov u Dab1 knockout myší.
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN
Rozdelenie cez myši yotariobličkyodhalila tenšiu kôru a výrazne menší priemerobličkya priemery PCT, DCT a G v porovnaní so zvieratami divokého typu. Pokles vobličkyveľkosť spôsobená nedostatočným vybavením nefrónov je známa akoobličkovéhypoplázia, jedna z najčastejších porúch CAKUT, ktorá predisponuje hypertenziu a chronické ochorenie obličiek u dospelých [31]. Okrem toho mikrofotografie zachytené pomocou TEM odhalili, že myši yotari vykazovali výrazné poškodenie podocytov s vymazaním procesu chodidla a nedostatkom fifiltračných štrbín. Po poranení podocyty prechádzajú procesom vyhladzovania, pri ktorom strácajú svoju štruktúru, čo vedie k zníženiu ich fifiltračnej bariérovej funkcie [32]. Všetky formy nefrotického syndrómu, ako aj fokálna segmentálna glomeruloskleróza (FSGS), sú charakterizované defektmi v štruktúre alebo funkcii podocytov [33].
Naša súčasná štúdia ukázala najvyššiu expresiu DAB1 v apikálnych a laterálnych častiach bunkových membrán DCT, zatiaľ čo REELIN bol väčšinou rozptýlený v cytoplazme PCT. V skúmaných časových bodoch neboli pozorované žiadne morfologické zmeny v tubuloch myší yotari, ale je potrebné ďalšie skúmanie na objasnenie úlohy DAB1 v tubulointersticiálnych kompartmentoch. Došlo k občasnej kolokalizácii proteínov DAB1 a REELIN, väčšinou v DCT. Tieto zistenia nadväzujú na našu predchádzajúcu prácu týkajúcu sa expresie týchto dvoch proteínov počas ľudského ploduobličkyrozvoj [9]. To môže naznačovať, že DAB1 a reelín majú podobné úlohy u ľudí a myšíobličkyaktiváciou niektorých downstream dráh, ako sú signálne kaskády Crk, MAPK a PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Naše údaje tiež odhalili zvýšenú expresiu reelínu v glomerulách myší yotari. Je zaujímavé, že predchádzajúca štúdia ukázala, že fosforylácia DAB1 a zvýšená expresia reelínu v glomerulách sú sprevádzané hypertenziou, proteinúriou a poškodením podocytov u potkanov s infúziou Ang II [10].
Okrem toho imunofluorescenčné farbenie odhalilo zvýšenú expresiu receptorov NOTCH2 v glomerulách myší P14 yotari. Je dobre známe, že expresia NOTCH2 je znížená, keď sa dosiahne dozrievanie nefrónov, s výnimkou podmienokporanenia obličiek,ako je diabetická nefropatia a FSGS [15,37]. Myši s nefrotickým syndrómom vyvolaným Adriamycínom tiež vykazovali zvýšenú expresiu aktivovaného NOTCH2, ktorý zlepšuje fibrózu [38]. V skúmaných časových bodoch sme nezaznamenali zvýšenú fifibrózu, ale zostáva objasniť presnú úlohu exprimovaného NOTCH2 v postnatálnom yotariobličky.Bolo by potrebné ďalšie sledovanie toho, či sa fifibrotické zmeny vyskytujú v neskorších štádiách. Existujú však už niektoré zistenia, ktoré naznačujú, že krátkodobý účinok zvýšenej aktivácie NOTCH2 je spojený so silným prínosom pre prežitie zranených podocytov, ktorý sa stráca v dlhodobých modeloch, ako je diabetická nefropatia [39].
Vyššia expresia LC3B v glomeruloch myší P11 a P14 yotari pravdepodobne odrážala akumuláciu autofagozómov v podocytoch. Jasne ukázať, že autofágia bola zrýchlená. Je potrebné analyzovať pomer expresie proteínu LC3-II a LC{5}}I. Za normálnych podmienok je pre normálny stav nevyhnutná autofágiafunkcie obličiek[40], najmä v podocytoch. Kvôli svojej obmedzenej schopnosti bunkového delenia a nahradenia vykazujú vysokú bazálnu úroveň autofágie [41]. Napriek týmto zisteniam bolo zvýšenie expresie LC3B hlásené pri niekoľkých glomerulárnych ochoreniach [42–44], najmä v súvislosti s vymiznutím výbežku chodidla a rozvojom nefrotického syndrómu, ako sa pozorovalo u myší s podmieneným knockoutom prorenínového receptora [45,46]. Všetky tieto štúdie naznačujú ochrannú úlohu zosilnenej autofágie v patologických stavoch, ďalej podporovanú nálezmi nefropatie vyvolanej adriamycínom, kde je autofágia aktivovaná na ochranu pred poškodením podocytov [43], ako aj pri glomerulárnom ochorení závislom od veku, kde sa oneskoruje progresívny funkčný úpadokfunkcie obličiek[40]. Analýza človekaobličkybiopsie tiež preukázali zvýšenú autofágiu v spojení s vymazaním výbežku chodidla pri niekoľkých glomerulárnych ochoreniach vrátane nefrotického syndrómu s minimálnou zmenou (MCNS), ktorý je jednou z najčastejších príčin idiopatického nefrotického syndrómu [19]. Pri stavoch diabetickej nefropatie a lipopolysacharidmi vyvolaných akútpoškodenie obličiek,zvýšenie autofágie pomocou niektorých terapeutík prostredníctvom inhibície dráhy PI3K/AKT/mTOR zlepšuje funkciu obličiek [47,48]. Všetky tieto zistenia naznačujú, že autofágia má nenahraditeľnú cytoprotektívnu úlohu pri adaptácii na strespoškodenie obličieka jej modulácia môže byť sľubnou terapeutickou stratégiou, hoci za určitých okolností môže byť autofágia škodlivá a môže prejsť do bunkovej smrti.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
Okrem zvýšenia autofágie bolo možné pozorovať zvýšenú úroveň apoptózy aj v glomerulách myší P14 yotari. Autofágia zvyčajne zabraňuje apoptóze, ale za špecifických patologických okolností môže mať aj opačný účinok na prežitie buniek posilnením a podporou apoptózy [42]. Po narodení apoptóza vobličkyje značne znížená, s výnimkou podmienokpoškodenie obličiek,ako je idiopatický nefrotický syndróm, kde prispieva k rozvoju ochorenia [23]. potenciálna nová príčina autozomálne recesívnych vrodených anomáliíobličkya močových ciest. Hlavná úloha DAB1 však počasobličkyvývoj zostáva nejasný. Okrem toho tieto myši vykazovali abnormality chodidiel a zvýšenú hladinu reelínu, NOTCH2, LC3B a štiepených proteínov CASP3 v glomerulách, čo môže viesť k poraneniam glomerulov, ako je nefrotický syndróm, ktorý v korelácii s hypopláziou môže byť potenciálnou príčinou smrti. týchto zvierat počas obdobia odstavenia. Na potvrdenie tejto hypotézy je potrebné poskytnúť ďalšie informácie týkajúce sa krvného tlaku a iných klinicko-laboratórnych parametrov, ako sú hladiny sérového kreatinínu, albumínu a proteínov.
