Nový prírodný antioxidačný biomateriál z listov Cinnamomum Osmophloeum Kanehira potláča melanogenézu a chráni pred poškodením DNA

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* a Chi-Yue Chang 2

Abstrakt:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) je pôvodný druh stromu na Taiwane. Chemické zloženie,antioxidantaktivita, hubatyrozinázaskúmala sa inhibícia, represia syntézy melanínu a ochrana pred poškodením DNA hydrosólu z listov COK parnou destiláciou. Uskutočnili sme 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylový radikál zachytávajúci, chelátovanie kovových iónov, redukujúci výkon a Trolox ekvivalentnú antioxidačnú kapacitu (TEAC) a určili sme korelácie medzi celkovým obsahom fenolov a antioxidačnými aktivitami. Zistenia ukázali, že antioxidačné vlastnosti hydrosólu COK úzko korelujú s ich obsahom fenolov. Okrem toho hlavné zložky hydrosólu, tj cinnamaldehyd a benzaldehyd, mali od dávky závislé antityrozinázové účinky proti aktivitám monofenolázy aj difenolázy. Analýza GC-MS odhalila, že hlavnými bioaktívnymi zložkami hydrosolu boli trans-cinnamaldehyd (87,7 percenta), benzaldehyd (7.{11}} percent) a cinnamylacetát (5,3 percenta). Okrem toho sme zistili, že hydrosól s prítomnosťou benzaldehydu je účinnejší ako čistý cinnamaldehyd a zvyšujetyrozinázainhibičná aktivita hydrosol. V kinetických analýzach Lineweaver-Burk grafy a grafy ukázali, že hydrosol COK je inhibítor zmiešaného typu. Okrem toho sme zistili, že veľmi nízke dávky hydrosólu COK potláčali syntézu transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou indukovanú hormónom stimulujúcim melanocyty, čo viedlo k zníženiu syntézy melanínu v bunkách melanómu B16-F10. Tieto výsledky ukázali, že výroba hydrosólu z listov COK pomocou destilácie vodnou parou môže poskytnúť bezpečný a účinný zdrojkoža-bieleniečinidlá pre kozmetické a farmaceutické aplikácie, santioxidantanti-tyrozinázu, anti-melanogenézu a ochranné aktivity DNA.

Kľúčové slová: antioxidantčinnosť; Cinnamomoum ​​osmophloeum; hydrosol;tyrozinázainhibičná aktivita;bielenie; Ochranné účinky proti poškodeniu DNA

Kliknite naCistanchestonka a prípravok na bielenie pokožky

1. Úvod

Poruchy ľudskej kože, ako je lentigo, starecké škvrny, melazma a malígne melanómy, sú spojené s tvorbou a akumuláciou melanínu [1]. Inhibícia tyrozináz a melanogenézy môže zlepšiť dermatologické poruchy a hyperpigmentačný syndróm. Okrem toho sa celosvetový trh s činidlami na bielenie pokožky a kozmetickými výrobkami nedávno rozšíril, pretože mnohí jedinci s tmavšou pokožkou uprednostňujú svetlejšiu farbu pleti [2]. Preto efektívne a bezpečnétyrozinázaa inhibítory syntézy melanínu sa považujú za dôležité na prevenciu pigmentových ochorení a iných problémov ľudského zdravia súvisiacich s melanínom [3,4]. Okrem toho environmentálne toxické látky spôsobujú ľuďom rôzne oxidačné stresy a môžu produkovať reaktívne druhy dusíka alebo reaktívne formy kyslíka (ROS) [5]. Nadmerné množstvo voľných radikálov a ROS sú spojené so zápalovými signálnymi dráhami, ktoré nakoniec vedú k poškodeniu buniek, starnutiu, nervovým poruchám, cukrovke, ateroskleróze, zápalom, kardiovaskulárnym ochoreniam, rakovine a melanogenéze [6,7]. Nasvedčujú tomu viaceré štúdieantioxidantymôže inhibovať poškodenie oxidatívnym tlakom tým, že pôsobí ako lapače voľných radikálov alebo ROSscavengers [7,8]. Okrem toho môžu inhibítory tvorby ROS aj vychytávače ROS znižovať produkciu melanínových pigmentov [9]. konkrétnetyrozinázaje kľúčový enzým, ktorý katalyzuje rýchlosť obmedzujúci krok v prvých dvoch krokoch počas procesov syntézy melanínu [10] a down-regulácia tyrozinázy je kritickým cieľom prevencie kožných ochorení a produkciebielenie pokožky[11]. Preto je nevyhnutný vývoj prírodných antioxidantov, ktoré účinne inhibujú tyrozinázy na prevenciu alebo liečbu nežiaducej hyperpigmentácie kože a ochranu pred poškodením DNA.

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) je taiwanský pôvodný druh škorice s mnohými použitiami ako čínska bylinná medicína. Aktívne zlúčeniny COK esenciálnych olejov vykazujú vynikajúci potenciál ako farmakologické antibakteriálne látky [12]. Hoci predchádzajúce štúdie alkoholových extraktov z listov COK preukázali antityrozinázové aktivity, takmer všetky tieto štúdie sa zamerali na etanolové extrakty alebo esenciálne oleje z COK. Okrem toho neboli hlásené žiadne kvantitatívne a systematické štúdieantioxidantvlastnosti,tyrozinázainhibičné aktivity a potlačenie syntézy melanínu vodnými extraktmi (hydrosol) listov COK. Preto sa táto štúdia uskutočnila s cieľom preskúmať účinky hydrosólu COK na oxidačný stres a melanogenézu v bunkách melanómu B16F10 a chrániť pred poškodením DNA. Táto štúdia je prvou podrobnou správou o chemickom zložení aantioxidant,inhibícia tyrozinázy, represívna melanogenéza a ochranné aktivity hydrosólu z listov COK proti poškodeniu DNA.

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie a protilátky

Hubatyrozináza, butylovaný hydroxytoluén (BHT), -tokoferol, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboxylová kyselina (Trolox), kyselina trichlóroctová (TCA), gallová kyselina, ferikyanid draselný, chlorid železitý, chlorid železnatý, ferozín, 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH),2,20-azino-bis-3-etylbenztiazolín{{14} } kyselina sulfónová (ABTS), Folin-Ciocalteuovo činidlo, L-tyrozín a L-3,4-dihydroxyfenylalanín (L-DOPA) boli získané od spoločnosti Merck Co. (Darmstadt, Nemecko). Všetky chemikálie a rozpúšťadlá použité v štúdii boli analytickej kvality alebo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Protilátky proti transkripčnému faktoru asociovanému s mikroftalmiou (MITF) a -aktínu boli získané od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) a Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA).

2.2. Príprava hydrosólu: Extrakcia z listov COK pomocou parnej destilácie

Listy z 13-ročného stromu COK na Taiwane (č. 186, Yongping Road, Zhongliao Township, Nantou County, Taiwan) boli sušené na vzduchu. Pomocou mlynčeka z nehrdzavejúcej ocele sa listy potom rozomleli na jemný prášok (menej ako < 10="" mesh)="" a="" potom="" sa="" skladovali="" pri="" teplote="" miestnosti.="" ďalej="" sa="" 3,5="" kg="" sušeného="" prášku="" z="" listov="" cok="" extrahovalo="" pomocou="" destilácie="" vodnou="" parou="" počas="" 4="" hodín.="" tento="" proces="" sa="" opakoval="" štyrikrát.="" pomocou="" vákua="" sa="" extrakt="" prefiltroval="" a="" potom="" sa="" pomocou="" rotačnej="" odparky="" získal="" suchý="" extrakt="" (obrázok="" 1).="" extrakt="" sa="" nakoniec="" odparil,="" čím="" sa="" získala="" konečná="">

2.3. Plynová chromatografia/hmotnostná spektrometria (GC/MS) Analýza hydrosólu

Thermo-GC/MS prístroj s THERMO WaxMS zosieťovanou 5-percentnou fenyl- 95-percentnou metylpolysiloxánovou kapilárnou kolónou (60 m × 0,25 mm vnútorný priemer, hrúbka filmu {{1 0}} 0,25 um) sa použilo s héliom ako nosným plynom pri konštantnej prietokovej rýchlosti 1,0 ml/min. Kolóna sa udržiavala pri 200 °C počas 5 minút po vstreknutí a potom sa zahrievala rýchlosťou 5 °C/min na 260 °C. Čistý esenciálny olej (1,0 ml) bol vstreknutý s deliacim pomerom 1:100. Teploty injektora, prenosového potrubia a iónového zdroja boli 250 ◦C, 250 ◦C a 200 ◦C. MS detekcia sa uskutočňovala v režime nárazu elektrónov pri 70 eVionizačnej energii a 60 uA ionizačného prúdu; prístroj pracoval v režime plného skenovania v rozsahu 50–350 amu. Zlúčeniny boli identifikované porovnaním retenčných časov a indexov chromatografických píkov s retenčnými časmi a indexmi autentických referenčných štandardov injikovaných za rovnakých podmienok. Vzorce fragmentácie MS boli porovnané so vzormi čistých zlúčenín a databáza hmotnostného spektra bola prehľadaná pomocou MSspektrálnej databázy Národného inštitútu pre štandardy a technológie (NIST) [13].

2.4.Celkový obsah fenolov

Celkový fenolický obsah (TPC) extraktov bol stanovený pomocou Folin-Ciocalteuovho testu, ako už bolo opísané [14]. Stručne, vzorky hydrosólu (100 µl) sa zmiešali so 100 µl alikvótami Folin-Ciocalteuovho činidla (10-násobné riedenie) a 10 µl alikvótami uhličitanu sodného (10 percent, w/v). Po 30 minútach skladovania absorbancia sa merala pri 735 nm. TPC sú vyjadrené ako ekvivalenty kyseliny galovej (GAE) v mg na 100 g čerstvého materiálu.

2.5. Testy zachytávania voľných radikálov DPPH

Ako už bolo opísané, pomocou testu DPPH sa určili aktivity hydrosólu na zachytávanie radikálov [15] s modifikáciami. V stručnosti, rôzne riedenia vzoriek hydrosólu (75 ul v troch vyhotoveniach) sa pridali k 150 ul alikvótom DPPH (0,02 g/100 ml) a absorbancia sa merala pri 517 nm po 30 minútach. BHT sa použil ako pozitívna kontrola (0,5 mg/ml etanolu). Aktivity zachytávania radikálov boli vyjadrené ako inhibičné pomery ( percentá ) pomocou nasledujúcej rovnice:

Pomer inhibície ( percentá )=[1 − (A/B)] × 100 percent

kde A je absorbancia hydrosólovej vzorky a B je absorbancia slepého pokusu.

2.6. Frakčné inhibičné koncentrácie

Testy frakčných inhibičných koncentrácií (FIC) sa uskutočňovali tak, ako je opísané vyššie [16], s modifikáciami. Stručne, FeS04 (20 ul; 2 mM) sa zmiešal s rôznymi riedeniami vzoriek hydrosólov (200 ul). Po pridaní ferozínu (40 ul; 5 mM) sa reakcie nechali prebiehať 10 minút a potom sa merala absorbancia pri 562 nm. Ďalej sa ako pozitívna kontrola použilo 0,5 mg/ml kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA). Percentuálna inhibícia ferozín-Fe2 plus tvorba komplexu sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca:

Kovový chelatačný účinok ( percentá )=[1 − (A/B)] × 100 percent

kde A je absorbancia hydrosólovej vzorky a B je absorbancia slepého pokusu.

2.7. Testy na zníženie výkonu

Redukčná sila hydrosólu COK bola stanovená monitorovaním redukcie Fe3 plus na Fe2 plus, ako bolo opísané vyššie [17] s modifikáciami. Stručne povedané, k 50 µl riedeniam hydrosólu boli 50-µLalikvóty fosfátového pufra (pH 6,6, 200 mM) a 50-µL alikvóty ferrikyanidu draselného (1 percento, w/v) pridané. Po inkubácii pri 50 °C počas 20 minút sa pridalo 50 ul TCA (10 percent, w/v); a zmes sa centrifugovala pri 9,{15}} otáčkach za minútu počas 3 minút. Nakoniec sa 50 ul supernatantu zmiešalo s 50 ul destilovanej vody a 50 ul chloridu železitého vo vode (0,1 percenta, hmotn./obj.) a po 10 minútach reakčného času sa merala absorbancia pri 700 nm proti slepému pokusu. Použité pozitívne kontroly boli butylovaný hydroxytoluén (BHT) a -tokoferol.

2.8. Troloxový test ekvivalentnej antioxidačnej kapacity (TEAC).

Antioxidantaktivity hydrosólu COK boli hodnotené podľa skôr opísanej metódy [15,18] s modifikáciami. Stručne, koncentrovaný roztok radikálového katiónu ABTS (ABTS• plus) sa zriedil vo fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (pH 7,4) na konečnú absorbanciu 0,80 ± 0,05 pri 734 nm. Po zmiešaní (0,02 ml) vzorky s 1 ml ABTS plus roztoku došlo po 5 minútach k zníženiu absorbancie pri 734 nm. Ako štandard bol použitý Trolox a hydrosolové aktivity boli vyjadrené ako TEAC vynesením kalibračných kriviek Troloxu. Molárne ekvivalentné hodnoty TEAC vzoriek hydrosólov boli vypočítané podľa zníženia absorbancie roztoku Troloxu. BHT a -tokoferol sa použili ako pozitívne kontroly.

2.9. Účinky hydrosolu na inhibíciu hubovej tyrozinázy

Hubatyrozinázaaktivita bola meraná pomocou spektrofotometrickej analýzy, ako bolo opísané vyššie, s modifikáciami [19]. Stručne, 20 ul L-tyrozínu alebo 20 ul L-DOPA v PBS (pH 6,8; 80 ul) a 80 ul PBS s testovaným hydrosólom alebo bez neho sa pridalo do 96-jamkových mikrodoštičiek a potom 20 ul hubtyrozinázy (100 U/ ml). Po premiešaní a inkubácii pri 37 °C počas 20 minút bola stanovená produkcia (alebo spotreba) dopachrómu v reakčnej zmesi pri absorbancii 475 nm. Kyselina kojová, ktorá inhibuje tyrozinázu, bola použitá ako pozitívna kontrola. Percento inhibície tyrozinázy sa vypočítalo takto:

Inhibícia ( percentá ) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 percent

kde A označuje absorbanciu s enzýmom v neprítomnosti vzorky hydrosólu, B označuje absorbanciu bez enzýmu alebo vzorky hydrosólu, C označuje absorbanciu s enzýmom a hydrosólom a označuje absorbanciu bez enzýmu, ale s hydrosólom. Vypočítali sme aj 50 percenttyrozinázainhibičné koncentrácie (IC50) vzoriek ako tie, ktoré inhibujú aktivitu tyrozinázy o 50 percent.

2.10. Kinetická analýza inhibície hubovej tyrozinázy

Reakčné zmesi obsahovali 20 µl L-tyrozínu alebo L-DOPA (0,25 mg/ml) ako substráty, 100 µL hubovej tyrozinázy (20 jednotiek/ml) v 0,2 M pufri fosforečnanu sodného ( pH 6,8) a 80 ul každej vzorky hydrosólu v celkovom objeme 200 ul. Test sa uskutočnil pri 25 °C a inhibičnej kinetike každej vzorky hydrosólu styrozinázabol analyzovaný pomocou Lineweaver-Burk grafov. Recipročná rovnica sa použila na rýchlu rovnováhu zo zmiešaného typu nekompetitívnej inhibície, ako je vyjadrené v rovnici (1) [20]. Hodnoty Ki pre vzorky hydrosólov boli odhadnuté zo sklonových grafov (Rovnica (2)). Hodnoty Ki pre hydrosól boli vypočítané z prekreslenia osi 1/v (Rovnica (3)),

kde Vmax je maximálna rýchlosťtyrozinázaaktivita, K je disociačná konštanta substrátu (S) od komplexu enzým-substrát (ES), Ki je disociačná konštanta inhibítora[I] od komplexu enzým-inhibítor a Ki je disociačná konštanta inhibítora od enzýmu-substrát - komplex inhibítorov (ESI).

2.11. Bunkové kultúry a testy životaschopnosti buniek

Bunky melanómu B16-F10 (BCRC60031) boli získané z Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), Taiwan. Bunky B16-F10 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (Gibco, Kalifornia, USA) obsahujúcom 10 percent FBS pri 37 °C v 5 percentách CO2. Trypsinizáciou sa bunky zozbierali. Životaschopnosť buniek sa merala pomocou testu 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidu (MTT), ako opísal Lee [15 ].

2.12. Obsah bunkového melanínu

Obsah melanínu sa meral pomocou metódy opísanej Lee. [15]. V stručnosti, B16-F10 bunky sa kultivovali na 6-jamkových doštičkách pri hustote 0,8 × 105 buniek na jamku a potom sa inkubovali 24 hodín. Bunky sa potom ošetrené 100-nM hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH), kyselinou kojovou (pozitívna kontrola) a hydrosolom v rôznych koncentráciách počas 24 hodín. Po dvojnásobnom premytí PBS boli bunky lyzované v pufri obsahujúcom 100 mM fosforečnanu sodného (pH 6,8), 1 % Triton X-100 a 0,1 mM fenylmetánsulfonylfluoridu a uskladnené pri -80 °C počas 30 minút. Po zbere buniek sa bunková peleta rozpustila v 1N NaOH obsahujúcom 10 percent DMSO pri 65 °C počas 1 hodiny. Potom sa merala absorbancia pri 405 nm.

2.13. Western Blot

Bunky sa lýzovali tak, ako je opísané v časti 2.11 a podrobili sa Western blotovaniu na MITF protein s použitím anti-MITF protilátky.

2.14. Testy ochrany DNA

Oxidačné poškodenie DNA sa stanovilo podľa konverzie cirkulárnej superšpirálkovej pCI neo plazmidovej DNA na cirkulárne alebo ďalej degradované formy s použitím skôr opísanej metódy [21,22] s miernymi modifikáciami. Reakčné zmesi 20 µl obsahovali 2,5 µl supercoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 µl Fentonovho reakčného roztoku obsahujúceho 30 mM peroxid vodíka, 100- µM chlorid železitý a 100 µl μM kyseliny askorbovej v 20 mM Tris-HCl tlmivom roztoku (pH 7,6) a 5 μl hydrosólu (0,3325 – 5,32 mg/ml) alebo kvercetínu (pozitívna kontrola; 250 μg/ml). Reakčné zmesi sa inkubovali pri 37 °C počas 30 minút a formy plazmidovej DNA sa separovali na 0,7 % agarózových géloch a farbili sa pomocou SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Richmond, Kanada).

Polokvantifikovaťantioxidantaktivity extraktov, množstvá nadzávitnicových a vrúbkovaných foriem pCI neo sa kvantifikovali pomocou zariadenia AlphaImager Mini (proteínsimple) a intenzity pásov na agarózových géloch sa kvantifikovali pomocou softvéru Gelpro. Ako negatívna a pozitívna kontrola bol pCI neoplazmid inkubovaný samotný a so zmesou Fentonovho činidla. Dáta sú vyjadrené ako množstvá nadzávitnicovej DNA relatívne k množstvu (100 percent) v negatívnych kontrolách. Ochranné aktivity extraktov sa vypočítali z množstiev nadzávitnicovej a vrúbkovanej plazmidovej DNA s použitím nasledujúcich rovníc [23]:

Ochrana superzvinutého plazmidu ( percent ) =intenzita superzvinutej formypCI neo DNA intenzita pásu × 100

Ochrana poškodeného plazmidu ( percent ) =intenzita prerezanej formypCI neo DNA intenzita pásu × 100

2.15. Štatistická analýza

Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Rozdiely medzi ošetreniami boli identifikované pomocou Studentovho t-testu alebo ANOVA nasledovaného Scheffeho testom. Rozdiely sa považovali za významné, keď p <>

3. Výsledky a diskusia

3.1. Identifikácia prchavých zlúčenín v hydrosóle

Obsah hydrosólov sa analyzoval pomocou GC/MS. Zložky sa identifikovali podľa retenčných časov štandardov a množstvá sa určili z plôch píkov eluentov (obrázok 2). Ako je znázornené na obrázku 2A–D, trans-cinnamaldehyd, benzaldehyd a cinnamylacetát boli hlavnými zlúčeninami v hydrosóle COK a boli prítomné pri 87,7 percenta , 7.{6}} percent a 5,3 percenta . Eugenol sa predtým nachádzal v esenciálnych olejoch z C. verum v 7,29 percentách [24], ale nebol zistený v súčasnom hydrosóle COK (obrázok 2). Rozdiely v extrakčných procesoch a testovacích metódach môžu prispieť k rozdielom v obsahu cinnamaldehydu v esenciálnych olejoch C. cassia [25].

3.2. Antioxidačné vlastnosti hydrosolu z listov COK

3.2.1. DPPH Radical Scavenging Activity

Na obrázku 3A sú aktivity hydrosólov na zachytávanie radikálov DPPH od 1.06×10-2 do 5,32×10-1 mg/ml medzi 5.04 percenta ± 0,96 percenta a 41,76 percenta ± 2,50 percenta. Tieto údaje ukazujú na dávke závislé zachytávanie radikálov hydrosólom COK. Na porovnanie, pozitívne kontroly BHT a -tokoferoly vychytali 94,32 percent ± 0,08 percent a 93,82 percent ± 0,13 percent reaktívnych radikálov DPPH, v uvedenom poradí, pri 0,5 mg/ml. Aktivita zachytávania radikálov hydrosólu COK je s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobená cinnamaldehydom (obr. Mnohé štúdie ukazujú, že fenoly a flavonoidy zabraňujú tvorbe DPPH radikálov darovaním atómov vodíka. Z tohto dôvodu môžu aktivity zachytávania radikálov DPPH druhov Cinnamomum odrážať aj pôsobenie ako donor vodíka [26,27].

3.2.2. Chelatácia kovových iónov

Hodnotili sme väzbovú kapacitu hydrosólov Fe2 plus pri 1, 06 × 10-3 a 5, 32 × 10-1 mg / ml, ako je znázornené na obrázku 3A. Kovová chelatácia hydrosólovými zložkami sa mierne zvýšila s koncentráciou, ale pri 6 mg/ml mala len 37,3 percent chelatačnej aktivity EDTA (obrázok 3A).

3.2.3. Zníženie výkonu

Ako je znázornené na obrázku 3A, redukčná sila hydrosólových zložiek bola závislá od koncentrácie a bola vyššia ako u BHT a -tokoferolu (0,22 ± 0.01 a {{9 }} 0,33 ± 0 0,15) pri 0,5 mg/ml. V predchádzajúcich štúdiách bola redukčná sila surových extraktov z vetvičiek C. osmophloeum vo frakciách BuOH najvyššia zo všetkých frakcií a rástla lineárne s koncentráciou [28].antioxidantpotenciály sa medzi zlúčeninami v extraktoch líšia, celkové antioxidačné aktivity extraktov silne závisia od extrakčného rozpúšťadla. Avšak redukčná sila (hodnota OD {{0}} 0,7) vodných extraktov z vetvičiek C. osmophloeum bola podobná (hodnota OD=0,66 ± 0,01) ako súčasné C. hydrosoly osmophloeum (obrázok 3A), ktoré boli vyrobené destiláciou vodnou parou. Redukčná sila je vo všeobecnosti spojená s prítomnosťou redukčných činidiel a antioxidačnou aktivitou, čo odráža zastavenie reťazových reakcií voľných radikálov poskytnutím redukujúcich atómov vodíka. Redukčná sila C. osmophloeum je pravdepodobne spôsobená prítomnosťou hydroxylových skupín vo fenolových zlúčeninách (obrázok 2), ktoré môžu pôsobiť ako donory elektrónov.

3.2.4. TEAC testy

Hodnoty TEAC súčasného hydrosólu sa zvýšili pri koncentráciách vyšších ako 5,32 × 10-3 mg/ml a boli vyššie ako hodnoty referenčných zlúčenín tokoferolu a BHT, ako je znázornené na obrázku 3A. Stérická dostupnosť k radikálovému miestu ABTS plus je hlavné kritérium pre aktivitu v testoch TEAC. Podľa toho sú fenylové skupiny prítomných hydrosólových zložiek o niečo menej bránené ako v prípade Troloxu.

3.2.5. Korelácie medzi TPC a antioxidačnými aktivitami

Ako je znázornené na obrázku 3B, existovala veľmi významná korelácia medzi TPC a aktivitou zachytávania voľných radikálov DPPH pri GAE od 1,75 ± 0,438 do 100,41 ± 1,581 mg/g . Korelačné koeficienty TPC s aktivitou zachytávania voľných radikálov DPPH, aktivitou FIC, redukčným výkonom a TEAC boli 0,980, 0,925, 0,967 a 0,902, v tomto poradí (obrázok 3B). Súhrnne tieto údaje ukazujú, žeantioxidantaktivity hydrosólov COK úzko korelujú s obsahom fenolu.

3.3. Vplyv koncentrácie hydrosólu COK na aktivitu tyrozinázy

Stanovili sme účinky koncentrácie hydrosólu COK na oxidáciu L-tyrozínu a L-DOPA hubamityrozinázaa vykonali porovnania s aktivitou kyseliny kojovej, ktorá je dobre známym inhibítorom tyrozinázy (obrázok 3C,D). Prítomný hydrosól silne a v závislosti od dávky inhiboval L-tyrozínové a L-DOPA oxidázové aktivity hubovej tyrozinázy (obrázok 3C), ale mal vyššiu tyrozinázovú inhibičnú aktivitu v prítomnosti L-tyrozínového substrátu (monofenolázová aktivita) ako L-DOPA (difenolázová aktivita). Hodnoty IC5{{10}} kyseliny kojovej proti aktivitám monofenolázy a difenolázy boli 4.0 × 10-5 a 7,8 × 10-3 mg/ml (obrázok 3C), v uvedenom poradí, významne viac ako u súčasného hydrosólu (7,96 x 10-4 mg/ml a 0,35 mg/ml, v tomto poradí; obrázok 3D). Na dosiahnutie 90-percentnej inhibičnej aktivity tyrozinázy (monofenolázová aktivita) sa teda vyžadoval hydrosól a kyselina kojová v množstve 0,52 mg/ml a 4,0 x 10-3 mg/ml, keď sa ako substrát použil L-tyrozín (obrázok 3C, D ). Hoci inhibičné účinky na tyrozinázu vyžadujú vyššie koncentrácie hydrosolantu kyseliny kojovej COK, v týchto experimentoch bola evidentná silná inhibičná aktivita tyrozinázy.

Rôznetyrozinázaprípravky, metódy testovania aktivity a čistoty a zložky inhibítorov mohli prispieť k rozdielom v kinetike inhibície enzýmov [29]. K biologickým aktivitám rastlinných extraktov však prispievajú ich bioaktívne zložky, ktoré môžu byť ovplyvnené rastlinným druhom, časom zberu, sezónou, geografickým pôvodom, agronomickými postupmi a metódami extrakcie. Inhibítory boli identifikované a charakterizované z prírodných zdrojov v mnohých nedávnych štúdiách a vzťahy medzi inhibičnými aktivitami a prírodnými zložkami sú dobre preukázané (tabuľka 1). Najmä mnohé aldehydy a iné zlúčeniny boli izolované a charakterizované ako inhibítory tyrozinázy. Patria sem cinnamaldehyd, 2-hydroxy-4-metoxybenzaldehyd, anizaldehyd, cuminaldehyd, kyselina kumová, flavonoly, flavóny a izoflavany [4,19,30–37]. Súčasný hydrosól obsahuje 87,7 percenta cinnamaldehydu a 7,0 percenta benzaldehydu, čo naznačuje, že cinnamaldehyd, nasledovaný benzaldehydom, je hlavnou látkou zodpovednou za inhibičnú aktivitu hydrosolu na tyrozinázu. V súlade s tabuľkou 1 sme zistili, že hydrosól s prítomnosťou benzaldehydu je účinnejší než čistý cinnamaldehyd a zvyšujetyrozinázainhibičná aktivita hydrosol. Bolo tiež potvrdené, že benzaldehydy inhibujú aktivitu difenolázy aj monofenolázovú aktivitu hubtyrozinázy [38]. Mechanizmus inhibície tyrozinázy inhibítorov benzaldehydového typu pravdepodobne pochádza z ich schopnosti tvoriť Schiffovu bázu s primárnou aminoskupinou v enzýme [33,39]. Pridanie elektrón-donorovej skupiny v para polohe benzaldehydu zvyšuje inhibičnú aktivitu tyrozinázy, pravdepodobne stabilizuje Schiffovu základňu.

3.4. Kinetické režimy inhibície hubovej tyrozinázy pomocou COK Hydrosol

Študovalo sa kinetické správanie hydrosolu na monofenolázovej a difenolázovej aktivite tyrozinázy s použitím L-tyrozínu a L-DOPA ako substrátu. Thetyrozinázainhibičná kinetika hydrosólu sa analyzovala pomocou Lineweaver-Burk dvojitých recipročných grafov, ako je znázornené na obrázku 4. Na obrázku 4A, B štyri čiary predstavujú neinhibovaný enzým (riadok 1) a inhibíciu tromi koncentráciami (riadok 2 – riadok 4) hydrosolu a tieto čiary sa pretínajú vľavo od osi 1/v nad osou 1/S. Za neinhibovaných experimentálnych podmienok bola maximálna rýchlosť (Vmax) oxidačnej reakcie L-tyrozínu a L-DOPA katalyzovaná tyrozinázou {{10}},055 ∆OD475/min a 0,096 ∆OD475/min bez obsahu hydrosol (čiara 1 na obrázku 4A, B). Kinetické parametre Km (Michaelisova konštanta) pre hubutyrozinázazískané z Lineweaver-Burk grafu s použitím L-tyrozínu a L-DOPA ako substrátov v uvedenom poradí ukazujú, že Km bolo 0,534 mg/ml a 0,511 mg/ml bez obsahu hydrosólu (Line 1 na obrázku 4A, B).

Štyri čiary získané z neinhibovaného enzýmu a z troch rôznych koncentrácií hydrosólu sa pretínali vľavo od osi 1/v nad osou 1/S. Zvýšené koncentrácie hydrosolu mali za následok zníženie Vmax a zvýšenie Km. Konkrétne, keď sa ako substrát použil L-tyrozín, zvyšujúce sa koncentrácie hydrosólu viedli k viacerým čiaram s rôznymi sklonmi a priesečníkmi, ale tieto sa navzájom pretínali v druhom kvadrante (čiara 1–4 na obrázku 4A). Podobné výsledky sa získali, keď sa ako substrát použila L-DOPA (riadok 1–4 na obrázku 4B), čo podporuje tvrdenie, že hydrosol nesie inhibítory tyrozinázy zmiešaného typu. V súlade so zmiešaným typom inhibície hydrosolové zložky pravdepodobne viažu voľný enzým a komplex enzým-substrát. Inhibície zmiešaného typu môžu vzniknúť mnohými spôsobmi: k inhibícii hydrosólu môže dôjsť, pretože interaguje s nasledujúcim medziproduktom v reakčnom vzore, ale nie s počiatočným komplexom enzým-substrát [40]. Takto sme určili disociačné konštanty (Ki a Ki, v uvedenom poradí) pre väzbu inhibítora na voľný enzým (E) a komplex enzým-substrát pomocou dvojito recipročných grafov a grafov sklonu a vertikálneho priesečníka verzus koncentrácie hydrosolu v prítomnosti L-tyrozínu (obrázok 4C, D) alebo L- DOPA ako substráty (obrázok 4E, F). Ako je znázornené na obrázku 4A, B, hodnota Ki, keď sa ako substrát použil L-tyrozín, bola približne 1,28-krát nižšia ako v prítomnosti L-DOPA, čo ukazuje na účinnejšiu väzbu inhibičného enzýmu s L-tyrozínom ako s L-DOPA. Okrem toho hodnota Ki bola 1,71-krát väčšia ako hodnota Ki pre oxidáciu L-DOPA, čo naznačuje, že afinita hydrosólových zložiek k voľnému enzýmu je silnejšia ako afinita komplexu enzým-substrát. Tieto údaje naznačujú, že hydrosol ovplyvňuje afinitu enzým pre L-DOPA, ale neviaže sa na aktívne miesto. Okrem toho hodnota Ki bola takmer rovnaká ako hodnota Ki pre oxidáciu L-tyrozínu, čo naznačuje, že zmiešané inhibítory sú nekompetitívne inhibítory, ktoré sa viažu na voľný enzým a komplex enzým-substrát s rovnakou rovnovážnou konštantou pomocou L- tyrozín ako substrát (obrázok 4A). Avšak rovnovážne väzbové konštanty pre voľný enzým a enzým-substrátový komplex sú odlišné pri použití L-DOPA ako substrátu (obrázok 4B), čo naznačuje, že zmiešaný typ (kompetitívny a nekompetitívny zmiešaný) inhibítor sa môže viazať nielen s voľný enzým, ale tiež s komplexom enzým-substrát s použitím L-DOPA ako substrátu. Predchádzajúce štúdie tiež odhalili, že esenciálny olej C. cassia a cinnamaldehyd sú inhibítory zmiešaného typu [19]. Naproti tomu trans-cinnamaldehyd izolovaný z kôry C. cassia indikoval kompetitívnu inhibíciu oxidácie L-DOPA hubami.tyrozináza[32], zatiaľ čo cinnamaldehyd izolovaný z koreňa P. cernua bola nekompetitívna inhibícia [35].

3.5. Vplyv koncentrácií hydrosólov na melanogenézu závislý od koncentrácie

Aby sme otestovali účinky hydrosólu na životaschopnosť buniek a melanogenézu pri rôznych koncentráciách ({{0}} 0,0035–10,64 mg/ml), indukovali sme melanogenézu v bunkách melanómu B16-F10 pomocou -MSH a porovnali účinky s použitím kyseliny kojovej ako pozitívnej kontroly (obrázok 5). Výsledok tohto testu životaschopnosti buniek ukázal, že hydrosol nemal žiadnu cytotoxicitu pri koncentráciách 0,0035–1,064 mg/ml v bunkách melanómu B16F10 (obrázok 5a). Keďže inhibítory melanogenézy sa vyvíjajú, bezpečnosť a účinnosť by mala byť najdôležitejším faktorom pri mnohých aplikáciách. Liečba buniek melanómu B16F10 hydrosólom však viedla k výraznému zníženiu životaschopnosti buniek pri koncentráciách 5,32–10,64 mg/ml. Podľa výsledkov štúdií skríningu bezpečnosti a účinnostibielenie pokožkyproduktov v B16F10 bunkových kultúrach, 1,064 mg/ml je prahová koncentrácia pre primárny skríning založený na bunkách. Preto sa na skúmanie mechanizmov anti-tyrozinázy v bunkách melanómu B16F10 pomocou hydrosólu použili koncentrácie 0,1064–1,064 mg/ml.

Represia melanogenézy ošetrením hydrosolom pri rôznych koncentráciách sa stanovila ako percento obsahu melanínu v bunkách (obrázok 5b). Tiež sme analyzovali hladiny expresie MITF pomocou Western blottingu (obrázok 5c). V týchto experimentoch boli obsah melanínu a hladiny expresie MITF potlačené v závislosti od dávky hydrosólom COK, čo naznačuje, že hydrosol COK znižuje obsah melanínu v bunkách potlačením syntézy MITF.

3.6. Testy ochrany DNA

Je dobre známe, že reaktívne formy kyslíka poškodzujú DNA a spôsobujú starnutie buniek a rakovinu. Testy DNAnicking ponúkajú pohodlný bezbunkový modelový systém na citlivé stanovenie produkcie radikálov poškodzujúcich DNA [41]. V týchto experimentoch Fentonove reakcie produkovali hydroxylové radikály, ktoré štiepia superzvinutú plazmidovú DNA a premieňajú ju na zrezanú formu DNA, ktorá má zníženú elektroforetickú mobilitu. [42,43]. Na vyhodnotenie DNA ochranných aktivít hydrosolu sme teda inkubovali pCI neo DNA s Fentonovými reaktantmi [44]. Ako je znázornené na obrázku 6, nadzávitnicové a vrúbkované plazmidové formy sa jasne odlišujú ich relatívnou rýchlosťou elektroforetickej mobility na agarózovom géli; supercoiledDNA sa pohybovala najrýchlejšie a vrúbkovaná DNA sa pohybovala najpomalšie. Po ošetrení hydrosólom sa poškodenie DNA mierne znížilo pri koncentráciách hydrosólu 1,33–5,32 mg/ml, s 28–58-percentnou ochranou supercoiled formy (dráhy 6–8). Pri koncentráciách hydrosólu 0,3325–0,665 mg/ml nebola pozorovaná žiadna ochrana v porovnaní s negatívnou kontrolou (dráhy 4 a 5). Na rozdiel od toho kvercetín účinne chránil plazmidovú DNA pred hydroxylovými radikálmi. sprostredkovaná fragmentácia, ako bolo uvedené vyššie [45]. Toto sú prvé údaje, ktoré ukazujú ochranné účinky hydrosólových extraktov z C. osmophloeum Kanehira zanecháva poškodenie DNA Fentonovými reakciami. Tieto účinky sú pravdepodobne spôsobené prítomnosťou polyfenolových zlúčenín.

4. Závery

COK sa na Taiwane dlho používa ako liečivá rastlina. Avšak, pokiaľ je nám známe, toto je prvá správa, ktorá dokazuje, že hydrosóly, ktoré sa pripravujú parnou destiláciou z listov COK, majú antioxidačné aktivity, ako sa pozorovalo pri testochantioxidantaktivitu a poškodenie DNA. Tiež sme ukázali, že tento hydrosol potláča melanogenézu. V analýzach GC/MS sa zistilo, že hlavnými zlúčeninami v hydrosóle COK sú cinnamaldehyd a benzaldehyd a tieto činidlá sú silne inhibujúce proti monofenolázovým a difenolázovým aktivitám tyrozinázy. V našom hodnotení kinetiky inhibície tyrozinázy vykazoval hydrosol COK zmiešaný typ inhibície aktivity L-tyrozínu a L-DOPA oxidázy závislej od dávky.tyrozináza. Predložené hydrosólové zlúčeniny tiež potláčali expresiu proteínu MITF, čo viedlo k zníženej syntéze melanínu indukovanej MSH.

Napokon, bezpečnosť je hlavným hľadiskom pre inhibítory tyrozinázy, najmä pre tie, ktoré sa používajú v kozmetických a potravinárskych výrobkoch, ktoré sa môžu používať v regulovaných množstvách. COK je už jedlá a široko používaná prírodná prísada do potravín a kozmetiky. Okrem toho je cinnamaldehyd všeobecne uznávaný ako bezpečný pre ľudskú spotrebu. COK hydrosol je vynikajúci prírodný biomateriál s účinným a bezpečným spôsobomtyrozinázaa inhibičná aktivita syntézy melanínu a potenciál ochrany proti poškodeniu DNA. Preto sa domnievame, že hydrosol COK by mohol byť použitý ako bezpečný a účinný depigmentačný prostriedok pre mnohé aplikácie.