Nový Netrin-1-odvodený peptid zvyšuje ochranu pred smrťou neurónov a zmierňuje intracerebrálne krvácanie u myší, časť 1

Abstrakt:

Bolo hlásené, že Netrin-1 sa podieľa na neuroprotekcii po poranení centrálneho nervového systému. Minimálna funkčná doména Netrin-1, ktorá môže zachovať neuroprotekciu, ale vyhnúť sa hlavným vedľajším účinkom Netrinu, zostáva nepolapiteľná.

Centrálny nervový systém je jedným z najdôležitejších nervových systémov v ľudskom tele, ktorý riadi myslenie, pocity a činy ľudí. Pri poškodení centrálneho nervového systému bude ovplyvnená aj pamäť ľudí. Ale nebojte sa, môžeme prijať niekoľko pozitívnych spôsobov, ako pomôcť obnoviť pamäť.

Najprv musíte pochopiť vplyv poškodenia pamäte. Poškodenie centrálneho nervového systému môže ovplyvniť kognitívne schopnosti ľudí, procesy myslenia a pozornosť, čo všetko priamo ovplyvňuje ľudskú pamäť. Okrem toho poškodenie centrálneho nervového systému môže tiež spôsobiť emocionálnu nestabilitu, vďaka čomu sú ľudia náchylnejší k panike, úzkosti a depresii, čo ovplyvňuje obnovu pamäte.

Avšak aj keď poškodenie centrálneho nervového systému môže priniesť určité negatívne účinky, môžeme prijať určité pozitívne opatrenia na podporu obnovy pamäte. Najprv si môžeme vyskúšať nejaký kognitívny tréning, ako je čítanie, písanie a riešenie hádaniek. Tieto aktivity môžu stimulovať mozog k produkcii nových neurónov a pomôcť mozgu vybudovať si nové spomienky a spôsoby myslenia.

Po druhé, môžeme tiež podporiť obnovu pamäte pomocou nejakého fyzického cvičenia. Štúdie ukázali, že správne cvičenie môže stimulovať mozog, aby produkoval nové neuróny a neurónové spojenia a podporiť mozgové spracovanie nových informácií. To je dôvod, prečo niektorí ľudia zrazu prídu s dobrým nápadom alebo vyriešia zložitý problém počas behu alebo chôdze.

Nakoniec musíme venovať pozornosť úlohe správneho príjmu výživy na pamäť. Normálne fungovanie mozgu vyžaduje niektoré potrebné živiny, ako sú bielkoviny, vitamíny a stopové prvky. Ak v našom jedle chýbajú tieto živiny, ovplyvní to našu pamäť a schopnosť myslenia. Preto by sme si v strave mali vyberať potraviny bohaté na tieto živiny, ako sú ryby, chudé mäso, zelenina a ovocie.

Stručne povedané, poškodenie centrálneho nervového systému bude mať určitý vplyv na pamäť ľudí, ale môžeme podporiť obnovu pamäte správnym kognitívnym tréningom, fyzickým cvičením a kontrolou stravy. Dúfam, že každý dokáže čeliť výzvam v živote pozitívne, zachovať si optimistický postoj a snažiť sa obnoviť zdravý centrálny nervový systém a dobrú pamäť. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche je tradičná čínska medicína s mnohými unikátnymi účinkami, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinnosť Cistanche pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď., ktoré môžu podporovať zdravie mozgu mnohými spôsobmi.

Kliknite na Know, aby ste zlepšili krátkodobú pamäť

Tu sme skúmali neuroprotektívny účinok peptidu E1 odvodeného z domény EGF3 Netrin{1} (zvyšky 407–422). Zistili sme, že interaguje s deletovaným kolorektálnym karcinómom (DCC) na aktiváciu fosforylácie fokálnej adhéznej kinázy vykazujúcej neuroprotekciu.

Podávanie peptidu E1 bolo schopné zlepšiť funkčné zotavenie prostredníctvom zníženej apoptózy v experimentálnom myšom modeli intracerebrálneho krvácania (ICH).

V súhrne odhaľujeme funkčnú sekvenciu Netrinu-1, ktorá sa podieľa na procese obnovy po ICH, a identifikujeme kandidátsky peptid na liečbu ICH.

Kľúčové slová: intracerebrálne krvácanie; hemín; neuroprotekcia; Netrin{0}}; peptid.

1. Úvod

Intracerebrálne krvácanie (ICH) je devastujúci podtyp cievnej mozgovej príhody s vysokou mortalitou a morbiditou [1–3], ktorý zahŕňa abnormálne prasknutie mozgových krvných ciev v mozgu [4,5].

Chirurgické odstránenie hematómov sa uprednostňuje na dosiahnutie hemostázy a zmiernenie intrakraniálneho tlaku [6]. Zvyškové hematické zvyšky a produkty rozpadu krvi však môžu stále podporovať sekundárne poškodenie mozgu po ICH, indukovať poškodenie neurónov a oddialiť funkčné zotavenie [7–9].

Vývoj účinných stratégií zameraných na poškodenie neurónov vyvolané sekundárnym poranením mozgu by bol teda prospešný pri liečbe mŕtvice. Netrin-1 je jedným z najviac preštudovaných proteínov, ktoré regulujú axonálne vedenie a synaptogenézu [10–12] prostredníctvom interakcie s jeho receptormi vymazané pri kolorektálnom karcinóme (DCC) a UNC5H (nekoordinovaný-5 homológ), aby sa aktivovalo prežitie, diferenciácia a proliferácia buniek [13–15].

Receptory indukujú signál smrti na sprostredkovanie apoptózy, keď netrín-1 chýba [16]. Je známe, že väzba Netrinu-1 s DCC vedie k dimerizácii DCC a iniciuje tyrozín 861 fosforyláciu fokálnej adhesionkinázy (FAK) na vyvolanie rastu neuritov a axonálneho vedenia [17,18].

Väzba Netrinu-1 s DCC zahŕňa doménu EGF3 Netrin-1 a doménu FN5 DCC pri aktivácii signálnej dráhy Netrin-1 [19,20]. Nedávno sa preukázalo, že Netrin-1 má neuroprotektívne účinky v ischemických oblastiach [21].

Hladina expresie Netrinu-1 v sére, ktorý inhibuje apoptózu buniek a podporuje regeneráciu neurónov, pozitívne koreluje so zotavením pacienta z ischemickej cievnej mozgovej príhody [22,23].

Je zaujímavé, že transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek kostnej drene, ktoré vylučujú Netrín-1 do poškodeného sedacieho nervu potkana, iniciuje regeneráciu axónov [24] a znižuje smrť motorických neurónov [25]. Stereotaxická injekcia proteínu Netrin-1 do komôr znižuje smrť nervových buniek po subarachnoidálnom krvácaní prostredníctvom aktivácie signalizácie DCC/APPL1/AKT [26].

Polypeptid odvodený z EGF3 domény Netrin-1 (aminokyseliny 423–433) výrazne aktivuje fosforyláciu ERK a podporuje produkciu NO, ktorý má kardioprotektívne účinky [27,28]. Netrin-1 bol však identifikovaný ako potenciálny biomarker tumorigenézy [29–31], pretože regulácia stavu Netrin-1 sa nachádza pri rakovine viacerých tkanív [32].

Keď sa Netrin-1 naviaže na svoj receptor DCC alebo Unc5H, tieto receptory prenesú pozitívny signál vedúci k prežitiu, zápalu, angiogenéze a antiapoptóze, ktorá následne reguluje tumorigenézu [31].

Preto je veľmi dôležité identifikovať minimálnu funkčnú doménu Netrinu-1, ktorá môže zachovať neuroprotekciu a vyhnúť sa hlavným vedľajším účinkom Netrinu-1. Tu sme zistili, že peptid E1 (zvyšky 407–422), ktorý je odvodený od EGF3 domény Netrin-1, interaguje s DCC, aby chránil neuróny pred toxicitou vyvolanou hemínom.

V experimentálnom modeli ICH myší aplikácia peptidu E1 zlepšila funkčné zotavenie, ako sa stanovilo pomocou behaviorálnych testov. Okrem toho môže peptid E1 zabrániť degenerácii neurónov po ICH.

Na základe týchto výsledkov sme identifikovali funkčnú sekvenciu Netrinu-1, ktorá sa podieľa na zotavení po ICH, a určili sme, že tento peptid možno použiť na liečbu ICH.

2. Výsledky

2.1. Doména EGF3 je kritická pre interakciu Netrin-DCC

Netrin-1 pozostáva z domény VI, troch opakovaní EGF a C-terminálnej domény [33]. Kryštalická štruktúra ľudského komplexu Netrin-1/DCC odhaľuje, že doména Netrin-1 EGF3 je kľúčová pre interakciu Netrin-1/DCC, ale nie domény EGF1 a EGF2 [34].

Mutagenéza kľúčových aminokyselinových zvyškov (His407, Gln442 alebo Gln443) na doméne EGF3 úplne narušila väzbu Netrin-1/DCC [19]. Domény EGF1/2 sú potrebné na prepnutie atraktívnej signalizácie na odpudzujúcu, keď Unc5 koexistuje s DCC [20].

Najprv sme teda vytvorili kompletné a EGF 3-deletované (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 konštrukty (obrázok 1A) a prechodne exprimovali tieto konštrukty v kultivovaných HEK293T bunkách na GSTpulldown .

Väzba bola pozorovaná pre konštrukty, ktoré exprimovali Netrin-1, ale nie Netrin-1(∆407–443) (obrázok 1C). Tieto výsledky naznačujú, že doména EGF3 obsahujúca aminokyseliny 407–443 je zodpovedná za interakciu Netrin-1 s DCC. Aby sme preskúmali úlohu domény EGF3 v Netrin-DCC, najprv sme vyčistili myc-označený Netrin{{12 }} alebo skrátený Netrin-1 (∆407–443) (obrázok 1B).

Ďalej boli bunky HEK293T transfekované plazmidom nesúcim DCC cDNA a inkubované s proteínom Netrin-1 a potom bola väzba Netrin-1 hodnotená imunofarbením.

Zistili sme, že Netrin -1 plnej dĺžky, ale nie skrátený Netrin-1, sa dokázal viazať na DCC na plazmatickej membráne (obrázok 1D). Aby sme určili, či doména EGF3 môže interagovať s DCC, vytvorili sme konštrukt GST-EGF3 na stiahnutie lyzovaných buniek nadmerne exprimujúcich DCC. Pozorovali sme špecifickú väzbu DCC s GST-EGF3 (obrázok 1E).

Ďalej sme syntetizovali peptidEGF3 značený FITC a potvrdili sme, že podobne ako Netrin s plnou dĺžkou-1 sa dokázal viazať na DCC na plazmatickej membráne (obrázok 1F). Celkovo naše údaje naznačujú, že doména EGF3 je zodpovedná za interakciu Netrin-1 s DCC.

2.2. Doména EGF3 indukuje fosforyláciu downstream dráh Netrínu-1

Interakcia Netrin{0}} a DCC aktivuje viaceré signálne dráhy vrátane FAK, SFK a ERK [16,35]. Fokálna adhézna kináza (FAK) je jednou z hlavných tyrozínfosforylačných aktivít spojených so signalizáciou Netrin-1/DCC.

Netrin-1 aktivuje fosforyláciu FAK a fosforyláciu proteín tyrozínkináz (SFK) rodiny Src [17]. Signálne dráhy FAK aj SFK hrajú kľúčovú úlohu vo vývojovom štádiu nervového systému a pri hojení poranení [36,37]. Okrem toho Netrin-1 môže aktivovať extracelulárnym signálom regulovanú kinázu-1/2 (ERK1/2), ktorá sprostredkováva pôsobenie mitogénom aktivovanej proteinkinázy (MAPK) [38–40].

Aby sme zistili, či je doména EGF3 kritická pre aktiváciu downstream signálnych dráh prostredníctvom väzby Netrínu-1 na DCC, najprv sme skúmali účinok domény EGF3 na fosforyláciu tyrozínu 861 FAK (obrázok 2A) . Zistili sme, že delécia EGF3 inhibovala fosforyláciu FAK v kultivovaných kortikálnych neurónoch (obrázok 2B, C), čím sa potvrdila zásadná úloha EGF3 v signálnej dráhe Netrin-1.

Ďalej sa kultivované kortikálne neuróny stimulovali fúznym proteínom GST-EGF3 počas 20 minút a western blotting ďalej potvrdil, že ošetrenie fúznym proteínom GST-EGF3 indukovalo fosforyláciu FAK, ERK a SFK (obrázok 2D–G).

Tieto výsledky naznačujú, že doména EGF3 Netrin-1 funguje ako silný stimulátor na aktiváciu downstream signálnych dráh.

Obrázok 1. Doména EGF3 Netrin-1 je kritickou oblasťou pre interakciu Netrin-1/DCC. (A) Ilustrácie Netrin-1konštrukcií. Konštrukty Netrin-1 sú Netrin-1 plnej dĺžky, Netrin-1-(∆407–443) a GST-EGF3. (B) Purifikovaný Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His boli kvantifikované porovnaním so štandardnou krivkou BSA. (C) Imunoblotovanie sťahovacej frakcie fúznym proteínom domény FN5 GST-DCC a samotným GST. (D) Imunofluorescenčné snímky Flag-DCC exprimujúcich 293T buniek inkubovaných s kontrolným médiom, Netrin-1-myc/his a Netrin{23}}(∆407–443) -Myc/his počas 30 minút, respektíve kvantitatívne analýza. Mierka, 10 µm. (E) Imunoblotovanie sťahovacej frakcie fúznym proteínom GST-EGF3 a GST. (F) Imunofluorescenčné snímky Flag-DCC exprimujúcich 293T buniek inkubovaných s kontrolným médiom a Pep EGF3 značeným FITC počas 30 minút a kvantitatívna analýza. Mierka, 10 µm.

Obrázok 2. Doména EGF3 aktivuje downstream cesty Netrinu-1. (A) Experimentálny postup. (B) Kortikálne neuróny (E17 a DIV3) boli stimulované pomocou Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) alebo kontrolného média počas 20 min. Bunkové lyzáty sa inkubovali s protilátkou anti-p-FAK{12}} na potvrdenie aktivity Netrin{13}}. (C) Kvantitatívna analýza výsledkov Western blotu je uvedená v (B). n=3. (D) Kortikálne neuróny (DIV3) boli ošetrené 1,5 uM GST (+), 1,5 uM GST-EGF3 fúzneho proteínu (+) alebo 1,5 uM Netrín-1 (+) média počas 20 minút. Bunkové lyzáty boli inkubované s anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 a anti-p-ERK-202/204.(E–G) Kvantitatívna analýza západných výsledky blot zobrazené v (D). n=3. Dáta sú prezentované ako priemer ± SEM. Jednosmerná ANOVA sa použila pre všetky štatistické analýzy zobrazené na tomto obrázku (* p < 0,05,** p < 0,01; ns, nevýznamné). Podrobnosti analýzy údajov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

2.3peptid E1 a E2 interagujú s DCC a aktivujú downstream signálnu dráhu Netrinu-1

Ako už bolo opísané, malý peptid odvodený z domény EGF3 Netrin-1 (aminokyseliny 423–433) indukoval fosforyláciu ERK [27]. Syntetizovali sme peptidy E1 (zvyšky 407–422) a E2 (zvyšky 423–433), ktoré boli odvodené z domény EGF3 Netrinu-1 (obrázok 3A).

Zistili sme, že inkubácia peptidu E1 zvýšila hladiny fosforylovaného FAK a SFK (obrázok 3B, D, E) v kultivačných bunkách spôsobom závislým od dávky, ale nezmenila hladiny fosforylovaného ERK (obrázok 3B, F).

Na rozdiel od peptidu E1, peptid E2 nielen indukoval fosforyláciu tyrozínu FAK (obrázok 3C, G) a fosforyláciu tyrozínu SFK (obrázok 3C, H), ale tiež indukoval fosforyláciu tyrozínu ERK (obrázok 3C, I) v kultivovaných kortikálnych neurónoch.

Kontrolný peptid (Pep Ctrl) nemal žiadny detegovateľný účinok na fosforyláciu tyrozínu FAK, SFK a ERK (obrázok S1). Ďalej sme pozorovali, že fosforylácia zložiek signálnej dráhy FAK indukovaná peptidom E1 bola časovo závislá (obrázok S1). S2). Tieto výsledky naznačujú, že E1 a E2 sú minimálne funkčné peptidy Netrinu-1.

Obrázok 3. Minimálne sekvencie domény EGF3 aktivujú downstream dráhy Netrinu-1. (A) Ilustrácie peptidov. (B) Kortikálne neuróny (DIV3) boli stimulované gradientovými koncentráciami peptidu El. Bunkové lyzáty boli inkubované s anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 a anti-p-ERK-202/204. (C) Kultivované kortikálne neuróny boli ošetrené gradientovými koncentráciami peptidu E2.

Lyzáty boli zozbierané a inkubované s uvedenými protilátkami na meranie fosforylácie FAK, SFK a ERK. (D–F) Kvantifikácia rozsahu fosforylácie FAK, SFK a ERK indukovanej peptidom E1 v neurónoch je uvedená v (B). n=3. (G–I) Kvantifikácia rozsahu fosforylácie FAK, SFK a ERK indukovanej peptidom E2 je uvedená v (C). n=3. (J) Kortikálne neuróny odvodené z DCC divokého typu a homozygotných mutantných embryí boli stimulované peptidmi odvodenými od Netrin-1 alebo Netrin-1-a boli lyzované.

Výsledné lyzáty sa podrobili imunoblotovaniu. (K) Kvantifikácia hladín FAK PY{{0}} a DCC v mutantných neurónoch DCC je znázornená na (J). n=3. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM. Jednosmerná ANOVA sa použila pre všetky štatistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0,05; ns, nevýznamné). Podrobnosti analýzy údajov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

Aby sme určili, či je aktivácia signálnej dráhy FAK závislá od DCC, merali sme rozsah tyrozínovej fosforylácie FAK indukovanej týmito peptidmi v neurónoch DCC+/+ a DCC−/−. Zistili sme, že oba peptidy E1 a E2 nedokázali indukovať fosforyláciu FAK v DCC-/- neurónoch (obrázok 3J, K).

Tiež sme zistili, že syntetizované N-terminálne Flag-značené peptidy El a E2 (Flag-E1 a Flag-E2) sa priamo viažu na doménu DCCFN5 (obrázok S3).

2.4. Peptid E1 chráni neuróny pred smrťou buniek indukovanou hemínom in vitro

Na preukázanie ochrany peptidu E1 proti poškodeniu neurónov sme použili reakciu toxicity indukovateľnú Heminom na napodobenie sekundárneho poškodenia mozgu po intracerebrálnej hemorágii [41,42].

Kultivované neurónové bunky exprimujúce GnRH (NLT) [43–45] sa inkubovali s hemínom pri rôznych koncentráciách a trvaní. Inkubácia buniek NLT s hemínom pri strednej letálnej dávke (60 uM) viedla k časovo závislému zníženiu miery prežitia buniek, čo naznačuje, že hemín bol absorbovaný neurónmi a metabolizovaný (obrázok S4).

Aby sa zistilo, či expresia Netrin{0}} a DCC reagovala na hemínom indukovanú smrť neurónových buniek, kultivované NLT bunky sa inkubovali s hemínom počas rôzneho trvania. Výsledky Western blotu ukázali, že hladiny expresie Netrin-1 a DCC sa významne zvýšili 6 hodín po inkubácii hemínu a potom postupne klesali (obrázok 4A, B).

Aby sme zistili, či sú peptidy E1 a E2 schopné zoslabiť hemínom indukovanú neurónovú smrť, vykonali sme CCK-8 test s Netrin-1, PepCtrl, peptidom E1 a peptidom E2.

Zistili sme, že tieto peptidy nemali žiadny detegovateľný účinok na životaschopnosť buniek (obrázok 4C a obrázok S5). V porovnaní s inkubáciou s Pep Ctrl a peptidom E2, peptid E1 a Netrin-1 zlepšili neurónovú smrť vyvolanú hemínom (obrázok 4D). Farbili sme tiež kalceínom-AM a PI, aby sme rozlíšili živé a mŕtve bunky.

Výsledky ukázali, že Netrin{0}} aj peptid E1 chránili pred smrťou vyvolanou hemínom in vitro (obrázok 4E–G). Okrem toho 1,5 uM peptid El zmiernil hemínom indukovanú smrť v primárne kultivovaných neurónoch (obrázok 4H, I). Celkovo tieto výsledky ukázali, že peptid E1 chráni neuróny pred bunkovou smrťou vyvolanou hemínom.

2.5. Netrin-1-Odvodený peptid E1 podporuje funkčnú obnovu po ICH

Aby sme zistili, či peptid E1 odvodený od Netrinu-1 hrá dôležitú úlohu pri nefunkčnom zotavení po mŕtvici s krvácaním, vytvorili sme experimentálny model ICH inmice injekciou kolagenázy zmiešanej s atramentom do striata (obrázok S6A).

Po troch dňoch sa ukázalo, že obrazy mozgového rezu sledujú polohu injekcie a objem kolagenázy pomocou atramentu (obrázok S6B, C). Myši so striatálnym krvácaním vykazovali slabosť na ipsilaterálnej strane v dôsledku poranenia mozgu (obrázok S7A–C).

Hematóm v striate po ICH bol viditeľný v porovnaní s injekciou fyziologického roztoku (obrázok S7D). Relatívne hladiny proteínov Netrin-1 a DCC v perihematomálnom kortexe boli u myší ICH zvýšené v porovnaní s kontrolnými myšami na 2. deň a Netrin-1 bol stále výrazne vyšší na 3. deň, čo naznačuje, že Netrin-1 je dôležitý pre zotavenie poranenia mozgu (obrázok S7E, F).

Ďalej sa FITC-značený TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), ktorý pridal TAT sekvenciu N-konca peptidu E1, injikoval do ICH myší a ukázalo sa, že FITC-Pep TE1 prechádza cez hematoencefalickú bariéru ( Obrázok S8).

ICH a kontrolným myšiam bol denne intraperitoneálne injikovaný peptid (12 mg/kg) alebo rovnaký objem fyziologického roztoku (obrázok 5A). Zistili sme, že podávanie peptidu TE1 zlepšilo mieru prežitia a zachránilo defekty telesnej hmotnosti po ICH (obrázok 5B, C).

Zistili sme tiež, že objem kolagenázy sledovaný s rovnakým pomerom atramentu v každej skupine bol podobný, čo potvrdzuje, že tento štandardný ICH model kolagenázy viedol k reprodukovateľným intrastriatálnym hematómom (obrázok 5D). Peptid TE1 zlepšil skóre správania myší ICH v teste odstraňovania pásky (obrázok 5E ) a test valca (obrázok 5F).

Ako sa očakávalo, peptid TE1 znížil infarkt po ICH (obrázok 5G, H). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že peptid E1 bol schopný znížiť objem hematómu a zlepšiť funkčné zotavenie v myšom modeli ICH.

Obrázok 4. Peptid El zlepšuje hemínom indukovanú bunkovú smrť in vitro. (A) Western blot Netrin-1 a DCC v kultivovaných NLT bunkách vystavených hemínu (60 uM). (B) Kvantitatívna analýza výsledkov Western blotre je uvedená v (A). n=3. (C) CCK-8 testy ukázali, že sériové peptidy nezmenili životaschopnosť buniek. n=4. (D) 1,5 uM Pep E1 zachovalo životaschopnosť NLT buniek, keď sa pridalo dobre po expozícii hemínu (60 uM). n=4. (E) Živý (zelený)/mŕtvy (červený) test buniek NLT vystavených hemínu (60 uM, 6 h). Mierka, 50 µm. (F, G) Kvantitatívna analýza testu živých/mŕtvych v (E). n=9. (H) CCK-8testy ukázali, že Pep E1 by mohol znížiť hemínom indukovanú bunkovú smrť v neurónoch primárnej kultúry. n=8.(I) Živé/mŕtve zobrazenie neurónov primárnej kultúry (50 uM, 6 h). Mierka, 50 µm. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. Jednosmerná ANOVA alebo dvojcestná ANOVA sa použili pre všetky štatistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nevýznamné). Podrobnosti o analýze údajov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

Obrázok 5. Peptid E1 odvodený od netrínu-1- podporuje proces obnovy po ICH. (A) Schéma experimentálnej paradigmy intraperitoneálnej (IP) injekcie peptidu TE1 v ICH modelovaní myší. (B) Zaznamenal sa pomer prežitia po ICH každej skupiny a použila sa Kaplan-Meierova metóda. n=10. (C) Zmeny telesnej hmotnosti 5 dní po ICH. n=6.(D) Zmes koláže/fyziologického roztoku s rovnakým pomerom atramentu (celkom 0,6 µl) vstreknutým do striata myší C57, reprezentatívne obrázky zobrazujúce oblasť atramentu boli podobné u myší liečených/ bez peptidu TE 1 5 dní po ICH. (E, F) IP injekcia peptidu TE1 (12 mg/kg), ale nie kontrola TAT (12 mg/kg), zlepšené správanie monitorované úlohou odstraňovania pásky (E) alebo úlohou v rohu (F).

Fyziologický roztok,n=10 jednotlivých zvierat; ICH, n=6 jednotlivých zvierat; ICH + TAT, n=6 jednotlivých zvierat; ICH + TE1, n=8 jednotlivých zvierat. (G) Reprezentatívne hematoxylínom a eozínom zafarbené rezy u myší liečených / bez peptidu TE 1 5 dní po ICH. Mierka, 1 mm. (H) Kvantifikácia objemu krvácania v rezoch mozgu znázornená na (G).

Fyziologický roztok, n {{0}} jednotlivých zvierat; ICH, n=6 jednotlivých zvierat; ICH + TAT, n=6 jednotlivých zvierat; ICH + TE1, n=8 jednotlivých zvierat. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. Jednosmerná ANOVA alebo obojsmerná ANOVA sa použili pre všetky štatistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nie významné). Podrobnosti analýzy údajov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

2.6. Netrin-1-Odvodený peptid E1 znižuje neuronálnu apoptózu po ICH

Preskúmať základné mechanizmy peptidu E1 v procese funkčnej obnovy ICH. Zistili sme neuronálnu degeneráciu v perihematomálnej oblasti farbením fluoro-nefritom C (FJC).

Zistili sme, že podávanie peptidu TE1 významne znížilo počet FJC-pozitívnych buniek v perihematómových oblastiach, čo naznačuje, že pep TE1 inhiboval neuronálnu degeneráciu po ICH (obrázok 6A, B). Vykonali sme farbenie TUNEL a zistili sme, že peptid TE1 významne znížil počet TUNEL-pozitívnych neurónov (obrázok 6C, D).

Počet TUNEL-pozitívnych astrocytov nebol detegovateľnou zmenou po liečbe peptidom TE1 (obrázok 6E, F). Okrem toho použitím 4 kDa dextránu značeného FITC ako atraceru na indikáciu permeability hematoencefalickej bariéry (BBB) ​​sme zistili, že peptid TE1 neovplyvnil obnovenie permeability BBB (obrázok S9A, B).

Hladiny surových fluorescenčných jednotiek (RFU) v sére boli podobné, čo potvrdzuje prítomnosť injikovaného indikátora u všetkých analyzovaných zvierat (obrázok S9C). Na označenie mikrociev sme tiež použili lektín značený fluoresceínom, ale nepodarilo sa nám pozorovať žiadne zlepšenie po liečbe TE1 (obrázok S9D, E). Tieto zistenia predovšetkým naznačujú, že peptid E1 podporuje zotavenie neurónov po ICH inhibíciou apoptózy neurónov.

Obrázok 6. Peptid E1 odvodený od netrínu{1}} môže chrániť pred smrťou a degeneráciou neurónov, ale nie astrocyty po ICH. (A) Reprezentatívne rezy zafarbené fluór-nefritom C u myší liečených/bez TE1 5 dní po ICH. Mierka, 50 um, respektíve 10 um. (B) Kvantifikácia buniek pozitívnych na fluór-nefrit C v perihematomálnej oblasti (n=4). (C) Farbenie TUNEL ukazujúce účinky TE1 na sekundárne poškodenie mozgu (SBI) 5 dní po nástupe ICH. Reprezentatívne obrázky zo skupín Saline, ICH, ICH + TAT a ICH + TE1.

Každá skupina bola podrobená ICH okrem skupiny s fyziologickým roztokom. Mierka, 50 um, respektíve 10 um. (D) Kvantitatívne analýzy pre percento TUNEL-pozitívnych neurónov sú uvedené v (C). n=4. (E) Kolokalizácia TUNEL s GFAP 5 dní po ICH. Reprezentatívne obrázky zo skupín Saline, ICH, ICH + TAT a ICH + TE1. Mierka, 50 um, respektíve 10 um. (F) Kvantitatívne analýzy percenta TUNEL-pozitívnych astrocytov sú uvedené v (E). n=4. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM.

Jednosmerná ANOVA bola použitá pre všetky štatistické analýzy zobrazené na tomto obrázku (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, nevýznamné); Podrobnosti analýzy údajov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

3. Diskusia

Naša štúdia identifikovala hlavnú peptidovú sekvenciu Netrin-1, ktorá je kľúčová pre funkčné zotavenie po ICH. Interakciou s DCC tento peptid odvodený od Netrin-1-chráni pred smrťou neurónov v dôsledku sekundárneho poškodenia po ICH, a preto je sľubnou liečbou ICH.

Terapeutická aplikácia Netrinu-1, proteínu s vysokou molekulovou hmotnosťou, si vyžaduje identifikáciu minimálnej funkčnej sekvencie Netrinu-1, ktorá podporuje downstreamovú signalizáciu. V našej štúdii sa vytvorili peptidy E1 (zvyšky 407–422) a E2 (zvyšky 423–433), ktoré sú odvodené z domény EGF3 Netrin-1. Zistili sme, že peptid E1 (zvyšky 407–422) chránil pred smrťou neurónov po ICH.

Zistili sme, že hladiny expresie Netrin{0}} a DCC boli zvýšené v bunkách NLT po liečbe hemínom. Hemín sa uvoľňuje z hemoglobínu po ICH a indukuje sekundárne poškodenie gliových aj neuronálnych buniek [46–48].

Okrem toho sme po experimentálnej ICH pozorovali aj zvýšené hladiny proteínov Netrin{0}} a DCC. Okrem toho sme po experimentálnej ICH pozorovali aj zvýšené hladiny proteínov netrín{1}} a DCC.

Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi výsledkami, ktoré ukazujú, že netrín{0}} hrá dôležitú úlohu pri zotavovaní sa po ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com