Nová stratégia na skríning aktívnych zložiek v Cistanche Tubulosa založená na analýze vzťahu medzi spektrom a účinkom a sieťovej farmakológii Ⅱ

3. Výsledky a diskusia

3.1. HPLC odtlačky prstov

3.1.1. Validácia metódy

Validácia pre metódu HPLC ukázala, že relatívna štandardná odchýlka (RSD) pre presnosť metódy, reprodukovateľnosť a stabilitu bola menšia ako 2,85 percent pre relatívnu plochu píku (n = 11) a 0,77 percent pre relatívny retenčný čas (n = 11). Presnosť rovnakého vzorového riešenia bola v rozsahu 0.05–{{10}},77 percent pre relatívny čas a 0,28– 2,70 percent pre relatívnu plochu spoločných vrcholov. Reprodukovateľnosť experimentu bola v rozsahu 0.03 – 0,20 percent pre relatívny čas a 0,23 – 2,59 percent pre relatívnu plochu spoločných vrcholov. Stabilita vzorky bola 0,09–0,24 percent pre relatívny retenčný čas a 0,75–2,85 percent pre relatívnu plochu spoločných píkov. Tieto výsledky ukázali, že stanovený odtlačok prsta bol spokojný. Lineárne vzťahy pre kyselinu geniposidovú,echinakozid, akteozid, tubulozid A, aizoakteozidsú uvedené v tabuľke S4. Hodnota R štvorca bola 1.0000, čo naznačuje dobrú linearitu. Výsledky výťažnosti vzorky ukázali, že priemerné výťažnosti kyseliny geniposidovej, echinakozidu,akteozid, tubulozid A, aizoakteozidboli 100,37 percenta , 103,59 percenta , 98,46 percenta , 100,81 percenta a 101,19 percenta a RSD pre výťažky vzorky bolo menej ako 2,68 percenta .

Kliknutím sem získate ďalšie podrobnosti o aktívnych komponentoch Cistanche

3.1.2. Peak Area (PA) a relatívny retenčný čas (RRT)

Referenčné odtlačky prstov a odtlačky prstov HM, WE a HR z 11 šarží C. tubulosa sú uvedené na obrázku 2. Jedenásť píkov, ktoré vykazovali dobré oddelenie a rozlíšenie, bolo identifikovaných ako bežné píky medzi HM, WE a HR. Päť štandardných zlúčenín bolo identifikovaných ako kyselina geniposidová (A2),echinakozid(A8),akteozid (A9), tubulozidA (A10) aizoakteozid(A11). Štandardná zlúčenina,echinakozid, ktorý bol prítomný vo všetkých chromatogramoch (priemerný retenčný čas 12.86 min) s vhodnou plochou píku a dobrou stabilitou, bol vybraný ako referenčný pík a použitý na výpočet relatívnych retenčných časov (RRT) ostatných desiatich spoločné vrcholy. RRT týchto rôznych foriem sú v rozsahu 0.16–1.51. PA a koeficient rozptylu (CV percenta) týchto spoločných píkov sú uvedené v tabuľkách S5–S7. Z údajov sú hodnoty CV percent pre PA v rôznych formách 25,78 percenta – 142,02 percenta, 23,36 percenta –150,38 percenta a 28,91 percenta –112,78 percenta pre HM, WE a HR. Tieto výsledky odhaľujú významné rozdiely v koncentrácii každého z nichCistanche tubulosazložený medzi rôznymi formami. Odtlačky prstov HM, WE a HR sú znázornené na obrázku 3.

Obrázok 2 HPLC fingerprinty štandardných vzoriek

3.1.3. Obsah HM, WE a HR

Päť štandardných zložiekC. tubulosaboli merané. Obsahy hlavných zložiek sú uvedené v tabuľke 1. Porovnanie medzi HM, WE a HR je uvedené v tabuľke 2 a na obrázku 4. PhG v C. tubulosa sú biologicky aktívne, ale citlivé na teplo. Zložky citlivé na teplo, ktoré sa rozpúšťajú vo vode, možno efektívne extrahovať pomocou rozumnej metódy. Vo všeobecnosti sa Cistanche herba extrahuje vodou a potom sa odparí do koncentrovaného roztoku na nasledujúcu chemickú analýzu [26, 27, 30]. Po extrakcii a zahustení bola použitá technológia sušenia rozprašovaním a upravený postup z predchádzajúceho článku. Z kvapalnej pary sa rýchlo odstránila voda a potom sa získali suché extrakty surovín z rastlín. V tomto kroku sa pridanie maltodextrínu považuje za bežný nosič na zlepšenie disperzie a predĺženie doby skladovania. Prostredníctvom série výrobných procesov sa potom bylinné rastliny lisovali do granúl s prísadami. Tento krok pridávania pomocných látok nebol zahrnutý do experimentu. Vo všeobecnosti náš výrobný proces zahŕňa extrakciu, koncentráciu a sušenie rozprašovaním, ako je opísané v časti 2.2, súbežne s procesom výroby granúl. Na výrobu týchto polotovarov je potrebné dodržať vyššie uvedené tri kroky. Postup vytvárania WE zahŕňa koncentráciu a sušenie rozprašovaním, ktoré ľahko spôsobujú stratu komponentov citlivých na teplo, ale HR sa získajú po extrakcii a vysušení HM. Zaujímalo by nás, či je možné, že aktívne zložky zostávajú v HR. Podľa našich výsledkov sa obsah verbascozidu významne znížil z HM na WE a HR ( a ). Tepelná stabilita verbascozidu sa skúma sledovaním zmien v oblasti píku pomocou HPLC počas procesu zahrievania. Po zahrievaní počas 4 hodín zostane 41,6 percent verbaskozidu. Znamená to, že verbaskozid je termosenzitívny [31]. Izoakteozid, tubulozid A a echinakozid vo WE zostali stabilné po zložitých procesoch spracovania. Počas dlhodobého procesu sušenia akumulácia PhG vykazovala významný pokles, ktorý možno pripísať tepelnej degradácii týchto termosenzitívnych komponentov [32]. Pokiaľ ide o ostatné cieľové zložky, HR a WE sa významne nelíšili okrem verbascozidu. Naše pochopenie tohto rozdielu nám umožní v budúcnosti vyvinúť lepšie štandardy kvality pre bylinné koreniny a posunúť ich do produktov.

Tabuľka 1 Obsahy 11 šarží C. tubulosa

Tabuľka 2 Porovnanie obsahu hlavných komponentov (n = 11).

,

Obrázok 4 Určenie obsahu piatich komponentov z rôznych foriem (n = 11). , ns: nevýznamné.

3.1.4. Analýza podobnosti odtlačkov prstov

Hodnotili sa podobnosti medzi tromi skupinami C. tubulosa. Hodnoty podobnosti medzi rastlinným materiálom a vodným extraktom, bylinným materiálom a bylinným zvyškom a vodným extraktom a rastlinným zvyškom boli v rozsahu 0,943–0,994, 0,847–{ {9}}.995 a 0.938–1.{14}} (tabuľka 3).

Tabuľka 3 Podobnosti HM-WE, HM-HR a WE-HR pre 11 šarží C. tubulosa.

3.2. Výsledky testu antioxidačnej aktivity

Antioxidačné aktivity rôznych foriem C. tubulosa boli stanovené pomocou testov DPPH, , a vychytávacej kapacity a príslušné výsledky sú uvedené na obrázku 5. V tabuľke S8 sú rozsahy pre DPPH a výsledky testu vychytávacej kapacity { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 a 0,32–27,65 mg/ml pre tri rôzne formy spomedzi 11 šarží C. tubulosa. V troch testoch antioxidačnej aktivity vykazovali HM a WE blízku inhibičnú aktivitu, zatiaľ čo HR vykazovali najslabšiu inhibíciu.

Zistilo sa, že sprejovo sušené WE vykazujú významné aktivity aj pri nízkych koncentráciách. Predchádzajúca správa naznačila, že rozprašovaním sušená Vernonia amygdalina WE dosiahla 50 percentnú inhibíciu zachytávania pri 0,17 mg/ml [33]. Aplikácia dlhých časov extrakcie a vysokých teplôt je dvojsečná zbraň. Na jednej strane zvýšenie doby extrakcie a vstupná teplota sušenia rozprašovaním zlepšuje výťažok a účinnosť. Navyše extrakty dosahujú silnú antioxidačnú aktivitu a vyššie koncentrácie biologických zložiek ako tieto rastliny [34]. Na druhej strane príliš horúci privádzaný vzduch degraduje bioaktívne zlúčeniny. Takéto zvýšené teploty privádzaného vzduchu viedli k strate antioxidačnej aktivity extraktu Bidens pilosa a pripisovali sa poklesu fenolových zlúčenín [35]. Súčasné výsledky sú v súlade s vyššie uvedenou správou. Napríklad WE v S6 vykazovala slabšie radikálové inhibičné schopnosti ako HM aj HR. Okrem toho HR v S5 vykazovala silnejšie schopnosti zachytávať DPPH a superoxidové anióny ako HM a WE. Štruktúra PhGs pozostáva z glykozidických väzieb a acetylových skupín, ktoré sa ľahko hydrolyzujú enzymatickým pôsobením alebo sa rozkladajú pri vysokých teplotách. Tieto reakcie môžu byť príčinou poklesu niektorých hlavných zložiek počas výroby vo veľkom meradle. Avšak hydrolýza alebo izomerizácia určitých zložiek môže urýchliť syntézu iných zložiek. Takéto premeny sú bežné pri spracovaní bylín Cistanches [36–38]. Keďže PhG sú rozpustné vo vode, znamená to, že väčšinu biologických zložiek možno využiť extrakciou vody. Tvrdenie, že väčšina aktívnych zložiek zostáva v WE, pretrváva už desaťročia, takže sa zdá rozumné predpokladať, že mokré zvyškové materiály možno po extrakcii zlikvidovať. Je však nesprávne považovať HR C. tubulosa za odpad. Výskumníci poukazujú na to, že PhG sú nestabilné a sú náchylné na enzymatickú alebo hydrolytickú degradáciu [39]. Hydrolyzačné alebo izomerizačné reakcie, ktoré prispievajú k zníženiu biologických zložiek vo fytomedicíne počas spracovania, môžu zároveň predstavovať nové príležitosti na využitie HR. Premenou tradičných extrakčných metód možno liečivé zvyšky vyvinúť a využiť efektívnejšie. Enzymatická hydrolýza sa uskutočnila na premenu zvyšku ženšenu Panax na monocukry. Zvýšili sa výťažky polysacharidov a ginsenozidov, ako je cukor, kyselina jantárová, polysacharidy ženšenu a ginsenosidy [40]. Zvyšky Sophora flavescens sú reextrahované pomocou ultrazvukových vĺn s etylacetátom [41]. Aktualizované technológie na využitie rastlinných zvyškov sú zhrnuté v Huang et al. [42].

Na základe výsledkov PLSR a BCA sa päť najlepších vrcholov rôznych foriem skrínovalo pomocou testov DPPH, superoxidových aniónov a hydroxylových radikálov, aby sa identifikovali najdôležitejšie vrcholy. Výsledky sú znázornené na Vennovom diagrame (obrázok 7). A2, A6, A8 a A10 sú spoločné píky, ktoré zdieľajú HM, WE a HR (obrázky 7(a) a 7(c)) v testoch zachytávania superoxidových aniónov a hydroxylových radikálov, zatiaľ čo HM, WE a HR nezdieľa žiadne vrcholy testu DPPH. Medzitým modely BCA ukazujú, že A1, A2, A3 a A6 sú spoločné vrcholy zdieľané HM, WE a HR (obrázky 7 (d) – 7 (f)). Je pozoruhodné, že prekrytia vo Vennovom diagrame naznačujú, že model BCA sa javí ako vhodnejší ako model PLSR, pričom prvý model vykazuje viac opakovaní. Koeficienty modelu BCA a hodnoty IC50 antioxidačnej schopnosti boli analyzované pomocou RDA. Ako je RDA znázornené na obrázku 8, A1, A3 a A6 z HM a HR súvisia pozitívne s indexmi antioxidantov, okrem toho, že A3 súvisí negatívne s kapacitou zachytávania hydroxylových radikálov. A1 a A6 z WE majú silné korelácie s DPPH a superoxidovým aniónom. Píky A6 zaznamenané z rôznych foriem vykazujú najsilnejšie spojenie s DPPH, superoxidovým aniónom a hydroxylovými radikálmi. A1 a A3 tiež vykazujú podobné spojenie.

Obrázok 7

Vennove diagramy modelu PLSR a BCA: (a) DPPH test. (b) test vychytávania. (c) test vychytávania sa analyzovali pomocou modelu PLSR. (d) DPPH test. (e) test vychytávania. (f) test vychytávania sa analyzovali pomocou modelu BCA. Prekrývajúcim sa úsekom boli spoločné črepy vrcholov podľa HM, WE a HR.

3.4. Analýza založená na sieťovej farmakológii

3.4.1. Výstavba CT siete

Celkovo bolo získaných 4359 cieľov súvisiacich s antioxidačnou aktivitou z databázy GeneCards a databázy OMIM. Súčasne boli skrínované aktívne komponenty z databázy TCMSP a databázy SwissTargetPrediction. Potom sa zhromaždilo a štandardizovalo 198 cieľov prostredníctvom databázy UniPort. Existovalo 159 cieľových génov zdieľaných aktívnymi zložkami a chorobami súvisiacimi s antioxidantmi (pozri obrázok S1). Sieť CT bola skonštruovaná na ilustráciu korelácie medzi zlúčeninami a kľúčovými génovými cieľmi (obrázok 9).

Obrázok 9 CT sieť. Sieť ukázala koreláciu medzi aktívnymi zložkami a kľúčovými génovými cieľmi.

3.4.2. Výstavba siete PPI a skríning kľúčových cieľov

PPI bol vizualizovaný pomocou databázy STRING (obrázok 10). Sieť zahŕňala 159 uzlov a 2528 hrán. V celej interakčnej sieti môžu byť spojovacie komponenty alebo uzly s viacerými cieľovými bodmi kľúčovým komponentom alebo cieľovým génom, ktorý hrá antioxidačnú úlohu v C. tubulosa. Výsledky sa stiahli a zaviedli do Cytoscape na vizualizáciu. Čím vyššia je hodnota DC, tým je farba tmavšia a čím väčšia je hodnota kombinovaného skóre, tým je okraj hrubší. Zistili sme, že RAC-alfa serín/treonín-proteínkináza (AKT1), interlukin-6 (IL6), tumor nekrotizujúci faktor (TNF) a vaskulárny endotelový rastový faktor A (VEGFA) boli centrálne umiestnené (obrázok 11), čo naznačuje, že boli kľúčovými cieľmi, keď aktívne zložky vykazovali antioxidačný účinok. Uvádza sa, že echinakozid znižuje mitochondriálnu dysfunkciu prostredníctvom regulácie mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK) a AKT a ich fosforylovaných foriem [43]. Výskumníci špekulovali, že antidiabetický účinok glykozidov C. tubulosa môže byť spôsobený antioxidačnou aktivitou PhG znížením regulácie prozápalových cytokínov, ako sú IL{11}} a TNF- [44]. Okrem toho by echinakozid mohol narušiť rast buniek rakoviny vaječníkov znížením regulácie expresie VEGFA na inhibíciu angiogenézy [45], čo úzko koreluje so systémom ROS, pretože ROS indukuje expresiu signalizácie VEGF [46].

Obrázok 10 Sieť PPI.

3.4.3. Analýza obohatenia a zriadenie siete CTP

Potenciálne antioxidačné zlúčeniny pôsobili na mnohé biologické funkcie, vrátane BP, CC a MF. Na obrázku 12(a) je zobrazených 10 najlepších dráh. Predpovedané ciele zo siete PPI reagovali hlavne na mnohé biologické procesy, ako sú organické cyklické zlúčeniny, xenobiotické stimuly, anorganické látky, hladiny kyslíka a pozitívna regulácia pohybu bunkových komponentov. Analýza bunkových zložiek ukázala, že gény súviseli hlavne s membránovým raftom, extracelulárnou matricou, lumenom sekrečných granúl, komplexom regulátora transkripcie a apikálnou časťou bunky. Tieto ciele sú tiež zapojené do mnohých molekulárnych funkcií, vrátane väzby transkripčného faktora viažuceho DNA, aktivity homodimerizácie proteínov, väzby špecifickej pre proteínovú doménu a väzby cytokínového receptora.

Obrázok 12 Analýza obohatenia: (a) Analýza obohatenia GO. b) Analýza obohatenia KEGG.

Na preskúmanie biologických funkcií týchto hlavných uzlov sa uskutočnila analýza obohatenia dráhy. Z výsledkov obohatenia KEGG bol nakreslený bublinový diagram, ktorý ukazuje 20 najlepších ciest. Čím väčšia bola škvrna, tým viac génov bolo zahrnutých do dráhy. Ako je znázornené na obrázku 12(b), kľúčové dráhy C. tubulosa súviseli s dráhami rakoviny, lipidov a aterosklerózy, signálnou dráhou AGE-RAGE pri diabetických komplikáciách, chemickou karcinogenézou – aktiváciou receptora a signálnou dráhou MAPK. Skúmali sa účinky C. tubulosa na apoptózu a bunkovú redoxnú homeostázu. Údaje naznačujú, že C. tubulosa môže byť sľubným kandidátom na liečbu rakoviny hrubého čreva [47]. Extrakt z C. deserticola sa nachádza u starších ľudí [48].

Obrázok 13 znázorňuje koreláciu medzi dráhami a ich príbuznými cieľmi a vzťah medzi prekrývajúcimi sa cieľovými génmi a biologicky aktívnymi zložkami C. tubulosa. Vytvoril sa globálny pohľad na sieť CTP, ktorý pozostával z 12 zložiek, 159 cieľov a 20 ciest. Väčšina cieľov bola zdieľaná kandidátskymi aktívnymi zlúčeninami. Tieto kandidátske aktívne zložky s vysokými stupňami prepojenia boli zodpovedné za vysokú prepojenosť siete CTP, najmä kvercetín (stupeň = 131). Väčšina cieľov, ako napríklad AKT1, IL6, TNF a VEGFA, bola mapovaná na KEGG dráhy spojené s dráhami pri rakovine.

Obrázok 13 CTP sieť.

4. Závery

V tejto štúdii sme primárne skúmali zložité situácie pri zvažovaní vzťahov medzi spektrálnym účinkom medzi HM, WE a HRC. tubulosa. HPLC odtlačky prstov aantioxidačné testysa použili na identifikáciu rozdielov medzi Hs, WE a HRsC. tubulosa. Podľa odtlačkov prstov HPLC bolo 11 píkov spoločných medzi 11 šaržami Hs, WE a HR. kyselina geniposidová,echinakozid, verbaskozid, tubulozid A, aizoakteozidboli identifikované medzi týmito vrcholmi. Stanovil sa obsah týchto piatich zložiek. Okrem toho antioxidačné účinkyC. tubulosaHs, WE a HR sa líšili v dôsledku zmien v chemickom zložení spôsobených zložitými výrobnými podmienkami. Na základe diverzifikovaných štatistických modelov štúdia vzťahu spektra a účinku ukázala, že vrchol A6 môže byť najdôležitejšou zložkou spomedzi troch foriemC. tubulosa. Štúdia bola založená na sieťovej farmakológii s cieľom preskúmať potenciálne mechanizmyC. tubulosanaantioxidáciaprostredníctvom skríningu zlúčenín, predikcie kľúčových cieľov, konštrukcie sietí a vykonania analýzy obohatenia. Naše výsledky poskytujú teoretický základ pre recykláciu rastlinných zvyškov a potenciálC. tubulosapri liečbeochorenia súvisiace s antioxidantmi.